再生过程的制备与活体成像 水螅 球状体

摘要

利用延时成像技术，完整观察再生过程 水螅 可以对类球体进行追踪。本方案描述了类球体的生成方法。 水螅 类器官，讨论了多种固定策略，并详细说明了如何利用转盘共聚焦显微镜以及光片荧光显微镜进行长期活体成像。

摘要

水螅 以其卓越的再生能力而闻名。值得注意的是，微小的再生片段能够 水螅 组织，称为 水螅 类球体可建立一个组织中心 从头合成一旦建立，该组织中心会引导周围组织分化为相应的口腔结构。数天内，球状体便可发育成一个虽小但结构完整的水螅体。这一过程相对较短的时间尺度使得对整个再生过程进行连续的延时成像成为可能，为研究再生的时空动态提供了独特的机会。本文中，我们展示了一套详细的操作流程，并呈现了再生过程中延时成像数据集的代表性结果 水螅 类球体。本方案包含类球体生成的详细步骤，以及用于成像的最优样品选择指南。我们讨论了适用于活体样品长期成像的固定策略，并展示了使用转盘共聚焦显微镜和光片显微镜的成像方法。此处所述原理可广泛应用于其他可通过长期成像研究动态形态发生过程的模型系统。

引言

水螅 是一种小型淡水水螅，以其卓越的再生能力而闻名。从其身体中部切下的组织片段会折叠成一个中空的球形结构，该结构由 水螅的两个上皮层，即外胚层和内胚层。在再生过程中，这些 水螅 类球体建立一个组织中心 从头合成¹大约3天内，身体轴逐渐伸长，头部和足部末端的细胞发生分化。由于这一过程时间较短，整个再生过程可通过活体成像完整记录。时间序列成像数据在揭示其特征性的膨胀与收缩循环方面发挥了重要作用。 水螅 类球体在再生过程中经历的变化²由这些渗透驱动的机械振荡所产生的组织拉伸有助于原肠胚形成组织者（organizer）的定位³.

成功的长期活体成像需要快速的图像采集以避免运动伪影，同时需尽量减少光照以防止对样本造成光损伤。传统的单点扫描共聚焦显微镜无法满足这些要求。然而，目前已开发出先进的成像技术。在本实验方案中，我们将重点介绍两种广泛应用的成像模式：转盘共聚焦显微镜（spinning disk confocal microscopy, SDCM）和光片荧光显微镜（light-sheet fluorescence microscopy, LSFM）。SDCM利用一个带有针孔阵列的高速旋转圆盘⁴，该设计可在保....

方案

所述所有操作均按照瑞士动物研究的国家伦理准则进行。实验开始前，Hydra 应正常喂养，每周 3 次，持续至少 2 周。用于实验的 Hydra 应健康¹²，无性器官且不处于出芽状态。最近出芽的 Hydra（因其长度较群体中其他 Hydra 更短而可被识别）也应避免使用。

1. 水螅（Hydra）球状体的制备（图1）

1. 首先准备含有解离培养基（DM；配方见下文）的培养板 表1）。实验时，DM 应置于室温下。
2. 准备其余工作区域：将一个10 cm细胞培养皿的皿盖置于体视显微镜下，并加入一层液体 水螅 培养基（HM；配方见 表1）。细胞培养皿本身可用于收集残留的 水螅 组织。最后，收集 水螅 并将它们放入培养皿中，置于体视显微镜附近。
3. 使用玻璃巴斯德移液管转移 水螅 将盖子置于体视显微镜下。建议将巴斯德吸管尖端弄钝，可通过快速将管尖置于火焰中实现。
4. 经常地 水螅 将漂浮在培养基表面；重新吹....

结果

我们成功生成了再生过程的长期延时数据集 水螅 使用旋转盘共聚焦显微镜（SDCM）和光片荧光显微镜（LSFM）对类球体进行成像。在两种成像系统中，类球体的再生过程均正常进行：在3天内打破对称性、伸长，并发育出触手和基足。图 5A, 图6A, 补充视频1和补充视频2）。经过长时间成像后，再生的动物变得过于活跃，开始移出焦平面，甚至完全移出视野范围（图 5A).

利用荧光标记，我们观察了Hydra再生过程中至关重要的动态细胞过程。例如，Hydra球形体能够快速重组其肌动蛋白纤维⁸。尽管大部分肌动蛋白结构是继承而来的，但在组织片段不同末端折叠在一起的区域，这种结构组织必须重新建立。通过共聚焦显微镜（SDCM），我们捕捉到一个具有无序肌动蛋白区域的球形体，该区域随后发生了重排与重组.......

讨论

SDCM 和 LSFM 均适用于生成再生水螅球状体的长期延时成像数据集。Hydra 样品的成像基于各自不同的光学原理，因此每种技术都具有独特的优点和局限性（表2）。当无需获得样品完整且高分辨率的图像时，优先选择 SDCM。该方法可在单次实验中同时对多个样品进行成像，因此特别适用于测试不同条件（如药物处理）的实验。此外，SDCM 数据集的处理与分析较为简便，是两种技术中更快捷且更易操作的一种。然而，当需要全面的空间信息时，LSFM 是更优的选择。LSFM 在成像对光敏感性较高的样品时也具有优势。尽管与单点扫描共聚焦显微镜相比，SDCM 已显著降低了光毒性，但仍会使整个样品反复暴露于光照之下。而 LSFM 仅激发一个极薄的光学切面，从而最大限度地减少了光照暴露和光损伤^13,14。然而，LSFM 的学习曲线较陡峭。采集后的数据处理，包括多视角图像配准与融合，可能较为复杂且对计算资源要求较高。尽管在建立标准化分析流程后可显著提升工作效率，但 LSFM 通常因视场更宽、z 轴堆栈.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20×/0.8 Plan-Apochromat物镜	Zeiss	440640-9903-000	用于转盘共聚焦显微镜
20x/1.0 W Plan-Apochromat水浸物镜	Zeiss	421452-9700-000	在Zeiss Lightsheet 7中用作检测物镜
FEP腔室安装用3D打印支架			定制
4孔玻璃底成像板（#1.5H）	Ibidi	80427
琼脂糖	Carl Roth	3810.4
FEP腔室用铝制模具			定制
氯化钙	Sigma-Aldrich	C4901
压缩空气罐	Durable	POWERCLEAN STANDARD 400
细胞培养皿（6 cm）	Thermo Fisher Scientific	150288
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8769
FEP薄膜（127 μm厚度）	Adtech Polymer Engineering
羧基修饰FluoSpheres荧光微球（0.2 μm，深红色）	Thermo Fisher Scientific	F8807
玻璃毛细管	Brand	701904
玻璃巴斯德吸管（150 mm）	VWR	612-1701
Hydra vulgaris
成像软件	Visitron	VisiView	用于转盘共聚焦显微镜
倒置光学显微镜	Zeiss	Axio observer 7	用于转盘共聚焦显微镜
光片显微镜	Leica	Viventis Deep LS2
光片显微镜	Zeiss	Lightsheet 7
低熔点琼脂糖	Thermo Fisher Scientific	R0801
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M2643
微型手术刀	pfm medical	200300745
移液球
活塞式移液器	Brand	701932
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333
安全本生灯	INTEGRA Biosciences	FIREBOY plus
sCMOS相机	Photometrics	Prime 95B	用于转盘共聚焦显微镜
碳酸氢钠	Fluka Analytical, Sigma-Aldrich	71630
二水合柠檬酸钠	Sigma-Aldrich	W302600
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P2256
转盘共聚焦扫描单元（50 μm针孔）	Yokogawa	CSU-W1	用于转盘共聚焦显微镜
体视显微镜	Leica	M80
TES	Sigma-Aldrich	T1375
热塑成型机	余姚金泰机械厂	Jintai JT-18
组织培养皿（10 cm）	VWR	734-2321
Tris-HCl缓冲液	Roche Diagnostics	10812846001