本研究表明，丹参酮 IIA（Tan IIA）可通过 IL-33/ST2 调控途径减轻心肌梗死后纤维化，该结论在动物模型和分子对接研究中得到证实，并通过 ELISA 和 Western blot 进行了验证。
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研究文章
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本研究表明，丹参酮 IIA（Tan IIA）可通过 IL-33/ST2 调控途径减轻心肌梗死后纤维化，该结论在动物模型和分子对接研究中得到证实，并通过 ELISA 和 Western blot 进行了验证。
心肌梗死（MI）是冠状动脉疾病的一种严重形式，常导致心肌纤维化，而心肌纤维化是心脏功能障碍和心力衰竭的关键因素。脏层心包脂肪组织（EAT）通过细胞因子介导的心脏功能调节， increasingly 被认为在心血管病理过程中发挥重要作用。丹参酮 IIA（TanIIA）是一种源自丹参的脂溶性化合物， 丹参，具有抗炎、抗氧化和抗纤维化特性。本研究旨在评估丹参酮IIA在减轻心肌梗死后心肌纤维化方面的治疗潜力，并通过整合方法探讨其潜在作用机制 体内 实验和 计算机模拟 分析。建立小鼠心肌梗死（MI）模型，并采用分子对接技术评估丹参酮IIA（TanIIA）与白细胞介素-33/生长刺激表达基因2（IL-33/ST2）信号通路关键组分的结合能力。结果显示，TanIIA治疗显著改善心脏功能，减轻组织学损伤，缓解心肌纤维化，同时降低血清N末端脑钠肽前体（NT-proBNP）和高敏心肌肌钙蛋白I（hs-cTnI）水平。TanIIA还减轻了血清、心肌组织及心脏周围脂肪组织（EAT）中的炎症反应和氧化应激。机制研究表明，TanIIA下调IL-33和ST2的表达，抑制髓样分化因子88（MyD88）/核因子κB（NF-κB）通路活性，并降低转化生长因子-β1（TGF-β1）水平. 计算机模拟 分析进一步表明，丹参酮IIA对IL-33、ST2、MyD88和NF-κB p65具有较强的结合亲和力，其中与ST2的相互作用预测最为稳定。综上所述，这些研究结果提示，丹参酮IIA可能通过多靶点抑制IL-33/ST2信号轴，调节EAT相关炎症和氧化应激，从而缓解心肌梗死诱导的心肌纤维化。这些结果支持丹参酮IIA作为治疗梗死后心肌纤维化的一种有前景的候选治疗药物。
心肌梗死在病理学上定义为因长时间缺血导致的心肌细胞死亡，仍是威胁生命的严重心血管事件1。尽管再灌注治疗策略和药物治疗已取得显著进展，心肌梗死（MI）在全球范围内仍是导致发病和死亡的主要原因2,3,4,5,6。MI的关键病理生理后果之一是心肌纤维化，即细胞外基质蛋白的过度沉积，这是决定后续不良临床结局的重要因素7。这种纤维化瘢痕虽然对防止心室壁破裂至关重要，但往往演变为一种由复杂的炎症反应和细胞间信号通路所启动的不良修复过程5,7,8,9,10。不良纤维化通过以无收缩功能的瘢痕组织替代功能性心肌，导致心室僵硬度增加、进行性心脏功能障碍，并最终引发心力衰竭9,11。因此，探索能够特异性靶向并减轻梗死后纤维化的新型药物治疗手段，是改善患者长期发病率和死亡率的关键治疗目标。
Salvia miltiorrhiza（丹参）是一种传统中药，其多种制剂被广泛用于心血管疾病的治疗。丹参酮IIA（Tanshinone IIA）是其主要的脂溶性成分，具有多种心脏保护作用，包括抗动脉粥样硬化、抗心肌缺血和抗氧化效应12,13,14,15。从作用机制上看，丹参酮IIA通过调控多种信号通路发挥其抗炎和抗纤维化作用13,14,15,16,17。值得注意的是，已有研究证实丹参酮IIA可直接作用于脂肪细胞，抑制其炎症反应，从而改善细胞功能障碍18。然而，丹参酮IIA的这些保护作用是否延伸至心外膜脂肪组织，仍有待阐明。
心外膜脂肪组织是一种独特的内脏脂肪库，在冠状动脉粥样硬化性心脏病（CAD）、心房颤动（AF）和心力衰竭的发病机制中具有重要作用。该组织在解剖上位于心肌与心外膜脏层之间，其间无筋膜层分隔，因此有利于与邻近心脏结构进行直接的旁分泌交流19,20,21,22。在生理状态下，心外膜脂肪组织具有心脏保护作用，可提供代谢支持并释放抗炎性和抗氧化性的脂肪因子20,21,23,24,25,26。相反，在病理状态下，心外膜脂肪组织则转变为促炎性、促氧化应激和促纤维化介质的来源，从而驱动不良的心脏重构27,28,29,30。因此，提出假设：丹参酮IIA可能通过减轻心外膜脂肪组织中的炎症反应和氧化应激，进而抑制心肌纤维化，其作用可能通过一条新的信号通路实现。
白细胞介素-33（Interleukin-33）是IL-1细胞因子家族的成员31，以其在心血管系统中强大的抗肥厚和抗纤维化特性而著称25。其生物学效应通过一个独特的受体复合物ST2介导，该受体存在两种亚型：一种是启动信号传导的跨膜受体（ST2L），另一种是可溶性诱饵受体（sST2），后者可结合并隔离IL-3332。临床上，心肌梗死（MI）后血清sST2水平会急性升高，并作为心力衰竭和心肌炎不良预后的强有力预测标志物33,34,35,36。经典的IL-33/ST2L信号通路涉及接头蛋白MyD88的募集以及随后TRAF6的激活，导致NF-κB抑制因子（IκB）的磷酸化与降解，进而促使NF-κB转入细胞核37,38。该通路与其他关键炎症细胞因子密切相关；例如，IL-33/MyD88信号可促进抗炎细胞因子IL-10的分泌39，而促炎细胞因子TNF-α则可通过激活NF-κB诱导IL-33表达，从而反过来增强炎症反应40,41。重要的是，IL-33和ST2均在脂肪组织中表达，被认为可在局部发挥抗炎作用31,42,43。然而，丹参酮IIA（TanIIA）的心脏保护作用是否涉及对IL-33/ST2轴的调节，目前尚未被研究。
因此，本研究旨在验证一个核心假设：丹参酮IIA通过调节IL-33/ST2通路，减轻源自心外膜脂肪组织的炎症和氧化应激，从而预防心肌纤维化。具体而言，我们假设该治疗作用源于丹参酮IIA对该信号级联中关键蛋白的直接多靶点作用。为验证这一假设，我们采用了双重研究策略。首先，利用心肌梗死大鼠模型以确认 体内 评估丹参酮IIA（TanIIA）在减轻不良心脏重构中的有效性；其次，为这些观察结果提供直接的分子依据，采用计算对接方法表征TanIIA与该通路中四个关键节点——IL-33、ST2、MyD88和NF-κB p65——之间潜在结合的可能性。通过从组织水平到特定分子结合事件的机制探究，本研究旨在建立TanIIA心脏保护作用的全新机制框架。
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所有实验操作和动物福利措施均严格遵循中国江西中医药大学动物伦理委员会《实验室动物护理与使用伦理规定》（编号：JZLLSC2023-0702）进行。
分子对接模拟
采用计算机辅助分子对接方法，研究丹参酮IIA（TanIIA）与IL-33、ST2L、MyD88及NF-κB p65之间的直接相互作用。TanIIA的三维坐标从PubChem数据库获取，初始SDF文件随后转换为PDB格式。IL-33（PDB编号：4KC3）、ST2L（PDB编号：4KC3）、MyD88（PDB编号：7L6W）和NF-κB p65（PDB编号：1NFI）的晶体结构来自蛋白质数据库（Protein Data Bank）。受体的初步处理在PyMOL（v2.3.4）中进行，去除水分子和原始配体后，再使用AutoDockTools进行加氢和电荷分配等进一步准备。两个分子最终均转换为PDBQT格式。采用AutoDock Vina（v1.1.2）在以活性位点为中心的预定义网格框内执行对接模拟。根据最低结合能选择最优结合构象，并利用PLIP在线工具分析详细的分子相互作用。最终的对接构象使用PyMOL（v2.3.4）进行可视化展示。
动物
雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，SPF级，6周龄，体重200 ± 20 g（合格证号：SCXK(Su)2023-0009）。大鼠饲养于标准化环境中，包括12小时光照/12小时黑暗循环，温度为22 °C ± 2 °C。实验期间，动物可自由摄食和饮水。
实验方案
通过结扎左前降支（LAD）冠状动脉建立大鼠心肌梗死模型。假手术组大鼠接受相同的外科手术操作，但不进行LAD结扎。简言之，大鼠通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）进行麻醉，随后行气管插管并机械通气。行左侧开胸术以暴露心脏，使用4-0不可吸收缝线结扎LAD。心肌梗死造模成功通过持续心电图上ST段抬高以及左心室前壁明显变白来确认。术后，大鼠每日腹腔注射头孢西丁钠（200 mg/kg/d），连续三天。术后24小时，存活的大鼠被随机分为六组（每组n = 10）：
假手术组：给予腹腔注射生理盐水（1 mL·kg-1·day-1）。
MI 组：接受腹腔注射生理盐水（1 mL·kg-1·day-1）。
丹参酮IIA低剂量组（TanIIA-L组）：接受腹腔注射丹参酮IIA（7.5 mg·kg-1·day-1）。
中剂量TanIIA-M组：接受腹腔注射丹参酮IIA（15 mg·kg-1·day-1）。
丹参酮IIA-H组（高剂量）：给予丹参酮IIA腹腔注射（30 mg·kg-1·day-1）。
XST 组（阳性对照组）：给予缬沙坦灌胃（30 mg·kg-1·day-1）。
所有处理均连续给药28天，每日一次。丹参酮IIA和心舒通的剂量选择基于既往研究及我们尚未发表的初步数据44,45。
心电图（ECG）和超声心动图
治疗28天后，通过经胸超声心动图评估心脏功能。在2%异氟烷麻醉下（运动模式），采集M型图像以测定左心室舒张末期/收缩末期直径（LVIDd/s）。左心室射血分数（LVEF）和缩短分数（LVFS）随后根据连续三个心动周期的平均值计算得出。此外，在术前、结扎后15分钟以及实验终点时记录心电图，以监测心脏电活动。
取样及2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色
从腹主动脉采集的血液在1370 × g 条件下离心15分钟以分离血清，并将血清储存在-80 °C。迅速切除心脏和心外膜脂肪组织并称重。用于分子分析的EAT和梗死边缘区组织经液氮速冻后保存于-80 °C。其他组织样本则用4%多聚甲醛固定，用于组织学检查。此外，部分心脏样本在-20 °C冷冻后进行切片，并用TTC染色以评估梗死面积。所有材料和动物组织的使用与处理均符合实验室安全规范。
组织学检查
为进行组织病理学评估，将石蜡切片进行苏木精和伊红（H&E）染色以观察心肌形态。采用马松三色染色法评估心肌纤维化的程度及心外膜脂肪细胞的大小，并对胶原容积分数（CVF）进行定量分析。此外，通过苦味酸天狼星红（PSR）染色测定非梗死区I型与III型胶原的比例。所有切片均进行数字化扫描，以便定量分析。
免疫组织化学
将石蜡包埋的心肌切片进行脱蜡和水化。使用柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）进行抗原修复。切片用3% BSA封闭后，于4 °C与针对I型胶原、III型胶原、IL-33、ST2、MyD88、NF-κB p65和TGF-β1的一抗孵育过夜。随后，切片在室温下与HRP标记的二抗孵育1小时。采用DAB显色，苏木精复染细胞核。使用数字扫描仪采集图像，并通过图像分析软件定量阳性染色的积分光密度（IOD）。
酶联免疫吸附测定
采用市售的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，按照制造商的操作说明，对血清样本中hs-cTnI、NT-proBNP、IL-33和ST2的浓度进行定量检测。此外，还检测了血清、心肌匀浆液及心外膜脂肪组织裂解液中的IL-10和TNF-α水平。
蛋白质印迹（Western blotting）
从组织匀浆中提取总蛋白，并采用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度。等量蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂牛奶封闭后，膜在4 °C下与针对IL-10、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-33、ST2、NF-κB p65、TGF-β1和GAPDH（1:1000）的一抗孵育过夜。随后，膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1:5000）孵育，并使用ECL试剂显影。使用软件对条带强度进行定量，蛋白水平以GAPDH作为内参进行归一化处理。
统计学分析
所有统计学分析均使用医学统计学软件进行。数据以均值 ± 均值的标准误表示。对于两个独立组之间的比较，采用t检验。在多组比较的情况下，采用单因素或双因素方差分析，随后进行Tukey事后检验。所有分析中，P < 0.05 被认为具有统计学显著性。
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丹参酮IIA对心肌梗死大鼠心脏功能的影响（图1）
健康状况及体重变化：心肌梗死（MI）组大鼠整体状态较差，伴有腹部膨胀；而丹参酮IIA（TanIIA）组大鼠健康状况改善，摄食和饮水量增加，活动增多。4周后，TanIIA组大鼠的体重显著高于MI组（P < 0.01）（图1A）。死亡原因与心肌损伤或心力衰竭相关，治疗组的存活率显著高于MI组，且死亡时间明显延迟（P < 0.05）（图1B）。
心脏功能变化：与假手术组相比，心肌梗死（MI）组大鼠出现心脏肥大及心脏指数升高（P < 0.01）。中、高剂量治疗组以及XST组的心脏指数均较MI组显著降低（P < 0.01）（图1C）。心脏...
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本研究探讨了丹参酮IIA（TanIIA）对心肌梗死后心肌纤维化的影响及其潜在作用机制。主要研究结果如下：（1）TanIIA通过抑制心肌纤维化，减轻不良心脏重构并改善心脏功能。（2）TanIIA可通过减轻心外膜脂肪组织的炎症反应和氧化应激，从而抑制心肌纤维化。（3）TanIIA通过IL-33/ST2信号通路介导其抗纤维化作用。
心肌梗死是一种发病率和死亡率较高的心血管疾病，对患者的生活质量和预后具有重要影响46,47。尽管在降低心肌梗死（MI）死亡率方面已取得显著进展，但梗死后心肌纤维化仍是关键的病理过程。该过程可导致不良的心室重构，表现为心室扩张和左心室功能受损，最终使患者易发生心力衰竭和心源性猝死1,3,5。目前，丹参酮IIA（TanIIA）已成为治疗多种心血管疾病的常用选择，具...
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作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文报道工作的竞争性财务利益或个人关系。
本研究由江西中医药大学中西医结合医学江西省一流学科（zxyylxk20220103）资助。额外经费来自王小敏支持的多个项目，包括江西省教育厅科学技术研究项目（GJJ2200940）、江西省高水平本科教学团队项目（2020008）、江西省研究生教学改革项目（JXYJG2019117）、江西省研究生优质课程项目（2020041）以及江西中医药大学本科生创新创业项目（2023091）。资助方参与了研究设计、发表决策及稿件撰写。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BCA 蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Corporation | PICPI23223 | |
| CAT 试剂盒 | 上海酶联生物科技有限公司 | 202211202 | |
| 胶原蛋白 I 抗体 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | GB114197 | |
| 胶原蛋白 III 抗体 | 沈阳万类生物科技有限公司 | WL03186 | |
| GAPDH 抗体 | Cell Signaling Technology 公司 | #5174 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software 公司 | 版本 9.0 | |
| GSH 试剂盒 | 上海酶联生物科技有限公司 | 202211131 | |
| 苏木精-伊红（H&E）染色液 | 北京索莱宝科技有限公司 | H8070;G1100 | |
| HRP 标记山羊抗兔 IgG 抗体 | 北京索莱宝科技有限公司 | SE134 | |
| Hs-cTnI 试剂盒 | 上海远捷生物科技有限公司 | 20220808 | |
| IL-10 抗体 | 沈阳万类生物科技有限公司 | WL03088 | |
| IL-10 试剂盒 | 上海远捷生物科技有限公司 | 202211172 | |
| IL-33 试剂盒 | 上海远捷生物科技有限公司 | 202211192 | |
| IL-33 抗体 | 沈阳万类生物科技有限公司 | WL04438 | |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院 | 版本 Fiji | |
| Image-Pro | Media Cybernetics, USA | 版本 6.0 | |
| 雄性 Sprague-Dawley (SD) 大鼠 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | SCXK(苏)2023-0009 | |
| Masson 染色试剂盒 | 武汉博菲生物科技有限公司 | 20221218 | |
| MDA 试剂盒 | 上海酶联生物科技有限公司 | 202211171 | |
| MyD88 抗体 | 沈阳万类生物科技有限公司 | WL02494 | |
| NT-proBNP 试剂盒 | 上海远捷生物科技有限公司 | 20220805 | |
| 核因子 kappa-B（NF-κB）（p65）抗体 | Abmart 公司 | TP56372 | |
| Open Babel | 开源化学信息学工具包项目 | 版本 2.3.2 | |
| 聚偏氟乙烯（PVDF）膜 | Merck Millipore | R9M2784 | |
| PSR 溶液 | 北京索莱宝科技有限公司 | G1472 | |
| SOD 试剂盒 | 上海酶联生物科技有限公司 | 202211201 | |
| ST2 抗体 | Proteintech Group 公司 | 11920-1-AP | |
| ST2 试剂盒 | 上海远捷生物科技有限公司 | 202211183 | |
| 统计产品与服务解决方案（SPSS） | IBM 公司 | 版本 26.0 | |
| 磺达肝癸钠注射液 | 上海第一生化药业有限公司 | 2012303 | |
| 超敏 ECL 发光试剂 | 大连美仑生物技术有限公司 | MA0186 | |
| TGF-β1 抗体 | ABclonal 公司 | A2124 | |
| 替坦维缬沙坦胶囊 | 湖南千金湘江药业股份有限公司 | 211120 | |
| TNF-α 试剂盒 | 上海远捷生物科技有限公司 | 202211202 | |
| TNF-α 抗体 | 沈阳万类生物科技有限公司 | WL01581 | |
| TTC 溶液 | 福州飞基因生物科技有限公司 | 20210620 | |
| 超高分辨率小动物超声成像系统 | VEVO公司 | Vevo 2100 |