研究厚朴酚调控紫外线A诱导的皮肤光老化模型中转化生长因子β1/Smad信号通路的实验方案

摘要

本方案研究了和厚朴酚是否通过激活TGF-β1/Smad通路并降低MMP表达，从而改善UVA诱导的人皮肤成纤维细胞及小鼠皮肤光老化。

摘要

和厚朴酚（HNK）是从厚朴（Magnolia officinalis）中提取的关键成分，具有治疗皮肤疾病的潜力。目前，HNK对皮肤中长波紫外线（UVA）诱导的光损伤的影响及其作用机制尚不明确。本研究通过UVA照射构建了人皮肤成纤维细胞（HDF细胞）和无毛小鼠皮肤的光老化损伤模型。采用细胞活力检测法考察HNK对正常HDF细胞及UVA诱导损伤的HDF细胞活力的影响。使用不同试剂盒测定HDF细胞中SOD、GSH、CAT和MDA的水平，并利用DCFH-DA和二氢乙啶（Dihydroethidium）检测活性氧（ROS）水平。通过SA-β-半乳糖苷酶染色和TUNEL染色检测HDF细胞的衰老和凋亡情况，采用流式细胞术分析细胞周期进程。通过病理染色评估皮肤组织的组织病理学损伤。此外，采用免疫荧光和蛋白质印迹法（Western blot）检测Ki67、胶原蛋白、基质金属蛋白酶（MMP）以及TGF-β1/Smad信号通路相关蛋白的表达水平。结果显示，HNK（2.5–10 µM）处理对正常HDF细胞活力无不良影响，但可减轻UVA诱导的HDF细胞损伤，降低氧化应激和细胞凋亡水平。UVA可诱导HDF细胞衰老，引起S期阻滞，下调Ki67表达，减少胶原蛋白含量，并增加MMP的表达；而HNK能有效缓解上述UVA诱导的异常变化。此外，UVA照射导致小鼠皮肤出现更深的皱纹，皮肤含水量和胶原蛋白含量下降，表皮厚度增加；而皮下注射HNK可减轻皮肤组织的病理损伤，并提高皮肤含水量和胶原蛋白含量。进一步研究发现，HNK可激活TGF-β1/Smad信号通路，而TGF-β1抑制剂SB431542可削弱HNK对HDF细胞和小鼠皮肤光老化损伤的保护作用。综上所述，HNK可通过激活TGF-β1/Smad信号通路，降低MMP的表达，从而抑制UVA诱导的HDF细胞和小鼠皮肤光老化，具有作为改善光老化损伤药物的潜力。

引言

皮肤老化的过程十分复杂，主要分为两种形式：自然老化和光老化¹。研究表明，高达80%至90%的皮肤老化由环境中的外源性因素引起（例如紫外线、空气污染），其中长期紫外线辐射引起的光老化影响最为严重^2,3。紫外线辐射可分为UVC、UVB和UVA三类。由于UVC无法穿透臭氧层，目前关于光老化的研究主要集中于UVA（320-400 nm）和UVB（280-320 nm）^4,5,6。与UVB相比，UVA能量较低，但穿透性更强，可穿过表皮并深入真皮层，是导致严重皮肤老化的重要原因⁷。既往研究显示，57 mJ/cm²的UVB辐射与20 J/cm²的UVA辐射对HaCaT细胞造成的损伤程度相当⁸。皮肤光老化会引起皮肤功能和结构的改变，具体表现为皮肤表层组织松弛、皱纹加深、胶原蛋白流失以及肉眼可见的肤色发灰；严重时可出现多种良性、癌前病变甚至肿瘤^9,10。随着衰老与抗衰老研究的不断深入，光老化带来的健康风险已成为全球最重要的健康问题之一。因此，深入探究UVA诱导的光老化损伤背后的病理生理过程，对于开发新的治疗策略具有重要意义。

厚朴酚（HNK）提取自传统中草药Magnolia officinalis，是一种具有C₁₈H₁₈O₂化学式的重要的生物活性化合物¹¹。HNK具有多种药理活性，其酚羟基极易被氧化，具有较强的抗氧化和自由基清除作用¹²。此外，HNK还具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗抑郁、神经保护以及抗卵巢早衰等药理作用^13,14,15,16。动物实验和临床研究已证实口服HNK基本安全，未发现明显不良反应^17,18,19。近期研究表明，HNK可预防UVB诱导的皮肤癌²⁰，并抑制UVB引起的皮肤炎症反应和DNA高甲基化²¹，提示其在治疗皮肤疾病方面具有潜在应用价值。与广泛使用的抗光老化剂（如维生素C和白藜芦醇）相比，HNK具有独特且更优越的特性：其亲脂性结构使其经皮渗透能力优于亲水性的维生素C²²；同时，其光稳定性和体内生物利用度也高于白藜芦醇²³。这些临床前研究结果表明，HNK作为一种安全有效的候选物质，在护肤产品及针对紫外线诱导皮肤光损伤的临床干预中具有良好的转化前景。然而，目前尚未见关于HNK对UVA所致皮肤光老化损伤影响的报道。

转化生长因子-β1（TGF-β1）是一种多功能细胞因子，在细胞生长与发育、组织修复与再生以及细胞、组织和器官的生长发育中起关键作用^24,25。研究表明，TGF-β1主要通过Smad蛋白家族成员向细胞传递信号，从而特异性调控下游靶基因的转录。当TGF-β1信号被激活时，会导致Smad2和Smad3的磷酸化^26,27。近期研究显示，TGF-β1/Smad通路与皮肤纤维化及光老化之间存在密切关联^28,29。已有报道指出，雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin）可激活大鼠皮肤组织中的TGF-β1/Smad通路，进而促进神经酰胺的合成，而神经酰胺对维持皮肤水分和皮肤屏障功能具有重要作用³⁰。值得注意的是，有研究报道和厚朴酚（HNK）可调节肝星状细胞中的TGF-β1/Smad通路，从而改善肝纤维化³¹。因此，本研究建立了UVA诱导的光老化损伤的细胞和小鼠模型，采用2.5–10 µM HNK处理人皮肤成纤维细胞（HDF细胞），并在无毛小鼠中给予5 mg/kg或10 mg/kg HNK干预，旨在探讨HNK对光老化损伤的影响及其在调节TGF-β1/Smad通路中的潜在作用。本研究旨在为UVA诱导的皮肤光损伤开发新的治疗策略。

方案

所有细胞培养实验均按照机构生物安全指南进行，并在生物安全二级（BSL-2）实验室条件下操作。动物实验经中国人民解放军联勤保障部队第988医院动物伦理委员会批准后开展（批准编号：2023-089）。

所有实验操作均严格遵循机构和国家关于实验动物护理和使用的指南进行。实验结束时，通过腹腔注射过量的戊巴比妥钠（100 mg/kg）对小鼠实施安乐死。在饲养、处理和采样过程中，均尽可能减少动物的痛苦。本实验方案中使用的试剂、化学品、设备和软件均列于材料表中。

1. 细胞培养与处理

1. 在成纤维细胞培养基中培养人皮肤成纤维细胞（HDF）。将培养物置于37 °C、湿度饱和、含5% CO₂的环境中培养。
2. 每3天更换一次培养基，当细胞融合时以1:3的比例传代。
3. 使用UVA灯（发射光谱：320–400 nm）以5 J/cm²的剂量照射HDF。
4. UVA照射30分钟后立即更换新鲜培养基。连续8天每天重复一次UVA照射³²。
5. 在剂量筛选实验中，用2.5、5、10、20或40 µM HNK处理HDF，处理时间为24小时或48小时³³。在后续实验中，用2.5、5或10 µM HNK处理HDF 24小时后，再进行UVA照射（5 J/cm²）。
6. 在HNK+SB431542组中，将HDF暴露于10 µM HNK中4小时，然后与10 µM TGF-β1抑制剂SB431542共同孵育24小时，最后进行UVA照射（5 J/cm²）。

2. 细胞活力评估

1. 以每孔 1×10⁴ 个细胞的密度将 HDF 接种至 96 孔细胞培养板中。
2. 经不同处理后，向每孔加入 10 µL 10% 水溶性四唑盐试剂，使每孔终体积为 100 µL，并于 37°C 避光孵育 1.5 小时。
3. 使用酶标仪测定细胞在 450 nm 处的吸光度（OD450）值。

3. 超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH）水平的测定

1. 用1 mL预冷的PBS（0.01 M，pH 7.4）洗涤HDF，加入200 µL SOD样品制备液（来自SOD检测试剂盒），冰上裂解细胞15 min。
2. 将裂解液在8000 × g下离心 × g 4 °C下离心5分钟，收集上清液作为检测样品。
3. 使用BCA（二辛可宁酸）蛋白检测试剂盒测定上清液的蛋白浓度，并将样品调整至总体积50 µL中含有总蛋白50 µg。
4. 将50 µg蛋白样品与SOD检测缓冲液混合，调整终反应体积至200 µL，于37 °C避光孵育30分钟，随后测定OD450值。
5. 采用用于SOD检测的相同细胞裂解液上清，使用相应的检测试剂盒测定CAT、GSH和MDA水平。

4. 细胞内活性氧水平的测定

1. 将HDF细胞用不同条件处理，用500 µL PBS洗涤两次，再加入500 µL 10 µM活性氧荧光探针，充分混匀后于37 °C避光孵育20分钟。
2. 室温下以1000 × g 离心5分钟收集细胞，然后用500 µL PBS洗涤两次。
3. 将细胞重悬于500 µL细胞培养基中，然后通过流式细胞术分析染色情况。
4. 使用流式细胞术分析软件记录荧光强度，然后根据荧光强度计算活性氧水平（活性氧水平越高，绿色荧光越强）。

5. 衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-半乳糖苷酶）染色

1. 以每孔1×10⁶个细胞的密度将HDF接种至6孔细胞培养板中，培养至细胞贴壁。经不同处理后，用2 mL PBS洗涤HDF一次。
2. 向每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，在室温下固定细胞15分钟。
3. 用2 mL PBS洗涤细胞3次，每孔加入1 mL染色工作液，然后在37°C避光条件下过夜孵育。
4. 使用光学显微镜观察并拍照（衰老细胞呈蓝色）。

6. 细胞周期检测

1. 将HDF以每孔1×10⁶个细胞的密度接种至6孔板中；经不同处理后，用2 mL PBS洗涤细胞两次。
2. 在室温下以1000 × g离心5分钟收集细胞，加入1 mL 70%乙醇（细胞固定剂），并通过移液轻轻混匀。将固定后的细胞置于4°C冰箱中孵育12小时。
3. 每份样品配制500 µL染色溶液，将碘化丙啶（PI，终浓度50 µg/mL）与RNaseA（终浓度200 µg/mL）溶于PBS中。向细胞中加入500 µL染色溶液，在37°C避光孵育30分钟。
4. 使用流式细胞术检测荧光强度，并通过流式细胞仪进行细胞周期分析。

7. TUNEL 染色

1. 将不同处理组的HDF细胞暴露于1 mL 4%多聚甲醛中，在室温下孵育30分钟。
2. 向细胞中加入1 mL含0.3% Triton X-100的PBS，在室温下孵育5分钟。
3. 用PBS洗涤细胞两次，然后滴加500 µL TUNEL检测试剂，均匀覆盖细胞。在37°C避光孵育1.5小时。
4. 加入200 µL DAPI染色液覆盖细胞，在25 °C避光孵育10分钟。
5. 用可保存荧光信号的封片剂封片，然后使用荧光显微镜观察并拍照（TUNEL阳性细胞显示绿色荧光）。

8. 免疫荧光染色

1. 将不同处理组的HDF细胞接种至12孔板中。当细胞密度达到50%–60%时，加入1 mL 4%多聚甲醛处理细胞，室温孵育25 min。
2. 逐滴加入1 mL 5%牛血清白蛋白（BSA）以封闭细胞表面，室温孵育30分钟。
3. 加入500 µL一抗Ki67（1:300）、胶原蛋白I型（1:100）、基质金属蛋白酶（MMP）-1（1:50）或MMP-3（1:100），逐滴加入，4°C孵育过夜。
4. 次日，将细胞与500 µL异硫氰酸荧光素（FITC）标记的二抗共同孵育 （1:100）于37°C避光孵育1小时。
5. 加入200 µL DAPI染色液以覆盖细胞，避光孵育10分钟，使用荧光显微镜观察，并用图像分析软件进行分析（I型胶原和MMP-1阳性细胞呈红色荧光，Ki67和MMP-3阳性细胞呈绿色荧光）。

9. 酶联免疫吸附测定（ELISA）

1. 向 MMP-1 或 MMP-3 ELISA 试剂盒板孔中加入 100 µL HDF 细胞培养上清液，在 37°C 下孵育 2 小时。
2. 用 200 µL PBS 洗涤孔板 3 次，然后每孔加入 100 µL 相应抗体，在 37°C 避光孵育 1 小时。
3. 用 200 µL 洗涤缓冲液（试剂盒提供）冲洗孔板 3 次，甩干多余液体，每孔加入 100 µL 链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP），在 37°C 避光孵育 30 分钟。
4. 用 PBS 冲洗后，根据试剂盒说明书加入底物 A 和 B 各 100 µL，在 37°C 避光孵育 10 分钟。
5. 加入 50 µL 终止液，充分混匀，使用酶标仪测定 OD₄₅₀ 值，并计算浓度。

10. 光老化损伤小鼠模型的构建

1. 将 SPF 级雌性 SKH1 无毛小鼠（15–20 g，4–5 周龄）饲养于 22 °C、相对湿度 55%–60% 的环境中，自由摄食饮水。定期对饲养设施进行消毒，包括食槽、水瓶和饮水嘴。
2. 将小鼠随机分为对照组（n=6）和模型组（n=18）。对模型组小鼠以 0.35 J/cm² 的 UVA 照射，持续 8 周³⁴；对照组小鼠置于相同环境中，但不进行 UVA 照射。
3. 将模型组小鼠均分为 3 个亚组（每组 n=6）。
4. 在 UVA 照射期间，对其中两个亚组每周两次皮下注射 HNK，剂量分别为 5 mg/kg 和 10 mg/kg，体积为 100 µL（分别记为 5 mg/kg HNK 组和 10 mg/kg HNK 组）；对第三个亚组每周两次皮下注射 100 µL 生理盐水（记为 UVA 组）。
5. 在模型建立成功后评估皮肤皱纹形成情况及皮肤含水量³⁵。
6. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（100 mg/kg）处死小鼠，随后取背部皮肤组织用于后续实验。

11. 皮肤I型胶原含量的测定

1. 采集50 mg小鼠背部皮肤组织，在液氮中充分研磨，加入500 µL预冷的RIPA裂解缓冲液，冰上裂解30 min。
2. 将裂解液在8000 × g下离心 × g 4 °C下离心5分钟，收集上清液，按照说明书使用I型前胶原C肽检测试剂盒测定胶原含量。

12. 苏木精-伊红（HE）染色

1. 将小鼠皮肤组织置于10 mL 4%多聚甲醛中室温固定24小时，梯度乙醇（50%、75%、95%、100%，每种浓度各5分钟）脱水，石蜡包埋，并切成4 µm切片。
2. 将切片在65°C烘烤8小时，二甲苯中脱蜡两次，每次10分钟，再于室温下用梯度乙醇复水。
3. 用苏木精溶液染色8分钟，流水冲洗1分钟，分化液分化30秒，室温下伊红染色1分钟。
4. 染色切片经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察（细胞核呈蓝紫色，细胞质、胶原纤维和红细胞呈不同程度的粉红色）。

13. 马松染色

1. 使用Masson三色染色试剂盒³⁶对小鼠皮肤组织的石蜡切片进行染色。将石蜡切片置于二甲苯中脱蜡两次，每次10分钟；加入Weigert铁苏木精染色液，染色10分钟。
2. 用酸性乙醇分化液分化30秒，流水冲洗5分钟，然后在室温下滴加Ponceau-品红染色液染色10分钟。使用Masson蓝液进行返蓝处理，再用蒸馏水冲洗1分钟。
3. 按蒸馏水:弱酸溶液（试剂盒提供）= 2:1的比例配制弱酸工作液；滴加1 mL弱酸工作液，室温下洗涤30秒。
4. 倾去多余液体，滴加1 mL磷钼酸溶液，室温处理2分钟。再滴加1 mL弱酸工作液，洗涤30秒。
5. 倾去多余液体，滴加1 mL苯胺蓝染色液，染色1分钟。随后滴加1 mL弱酸工作液，洗涤30秒。
6. 在95%乙醇中快速脱水2秒，再于无水乙醇中脱水两次，每次10秒。
7. 干燥后，用二甲苯透明切片，中性树胶封片。在显微镜下观察各组胶原纤维的分布情况（胶原纤维呈蓝色，肌纤维、细胞质和红细胞呈鲜红色，细胞核呈明显的蓝黑色）。

14. 皮肤组织活性氧水平的测定

1. 取小鼠皮肤组织的冷冻切片（在切除后1小时内制备），将1 mL清洗液滴加至切片表面，室温静置10分钟。
2. 甩去清洗液，然后将1 mL 10 µM活性氧探针溶液均匀滴加于切片上；37 °C避光孵育30分钟。
3. 用PBS缓冲液冲洗切片两次，加盖盖玻片，使用荧光显微镜观察（活性氧阳性区域呈现红色荧光；活性氧水平越低，红色荧光信号越弱）。

15. 生化指标检测

1. 根据相应检测试剂盒的说明书收集小鼠血清并准备检测试剂。
2. 使用相应的试剂盒检测小鼠血清中天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）的活性。
3. 使用相应的试剂盒测定小鼠血清中血尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）的水平。

16. 蛋白质印迹

1. 取50 mg组织或1×10⁶个细胞，加入200 µL RIPA裂解缓冲液，冰上裂解30分钟，以提取蛋白质。
2. 在4 °C条件下以8000 × g离心5分钟，收集上清液。使用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定细胞和组织中的蛋白含量。
3. 将样品蛋白在12% SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离，并在4 °C条件下将分离后的蛋白转移至PVDF膜上。
4. 用5% BSA在室温下封闭PVDF膜3小时。用TBST（含20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl和0.1% Tween-20）洗涤膜3次，然后在4°C下与以下一抗孵育过夜：P53（1:1000）、P21（1:1000）、P16（1:100）、I型胶原（collagen I，1:1000）、Cyclin A2（1:500）、细胞周期依赖性激酶2（CDK2，1:1000）、MMP-1（1:500）、MMP-3（1:1000）、TGF-β1（1:1000）、Smad2（1:100）、Smad3（1:1000）、p-Smad2（1:1000）或p-Smad3（1:1000）。
5. 第二天，用TBST洗涤膜3次，然后在室温下加入1 mL羊抗兔IgG（1:10000）孵育2小时。均匀加入500 µL增强型化学发光（ECL）试剂，使用凝胶成像系统扫描膜。
6. 使用图像分析软件进行灰度值分析。以目标蛋白灰度值与GAPDH灰度值的比值表示其相对表达水平。

17. 统计分析

1. 对于 体外 基于细胞的实验，所有实验均独立重复三次（n=3，生物学重复）。
2. 对于 体内 动物实验中，每组包含6只小鼠（n=6），符合实验动物福利与伦理的3R原则。
3. 所有结果均以均值 ± 标准差表示。使用统计分析软件进行统计分析。数据正态性通过Shapiro-Wilk检验进行检验。
4. 对于符合正态分布的数据，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行多组间比较，组间两两比较则使用 Tukey 事后检验。对于非正态分布的数据，采用非参数的 Kruskal-Wallis 检验。 P< 0.05 表示存在显著性差异。
5. 使用绘图软件生成图表。

结果

HNK 缓解 UVA 引起的 HDF 细胞氧化应激损伤
通过细胞活力检测分析了不同浓度 HNK 处理 24 小时或 48 小时对 HDF 细胞活力的影响，以筛选合适的浓度和处理时间。结果显示，2.5、5 和 10 µM 的 HNK 在处理 24 小时或 48 小时后对正常 HDF 细胞的活力无显著影响，表明在这些剂量下 HNK 对正常细胞无毒性。值得注意的是，2.5、5 和 10 µM 的 HNK 能够缓解 UVA 所诱导的 HDF 细胞活力下降，提示 HNK 可保护 HDF 细胞免受 UVA 损伤，且 24 小时处理的效果优于 48 小时。当 HNK 浓度升高至 20 和 40 µM 时，正常 HDF 细胞及 UVA 处理的 HDF 细胞活力均显著下降，提示高浓度 HNK（20–40 µM）对 HDF 细胞具有一定毒性作用（图 1A, B）。因此，在后续实验中选择 2.5、5 和 10 µM HNK 处理 HDF 细胞 24 小时。UVA 照射后，HDF 细胞中 SOD 和 CAT 活性显著降低，GSH 含量也明显减少，而 MDA 和 ROS 水平显著升高，表...

讨论

紫外线是损害细胞和生物体的环境因素之一。已有研究表明，由于UVA具有较强的穿透能力，是到达地球表面的主要紫外线类型³⁸。成纤维细胞是真皮中重要的功能细胞，其衰老可直接或间接导致皮肤老化³⁹。HDF细胞模型和无毛小鼠模型中的UVA诱导光老化损伤被广泛应用于皮肤光老化研究^40,41。因此，参考既往研究构建了UVA诱导的光损伤细胞和动物模型（HDF细胞每日5 J/cm²，连续照射8天；小鼠每周照射数次，每次0.35 J/cm²，持续8周）^32,33,34。该照射方案避免了单次过量照射引起的急性细胞坏死和组织损伤，更接近现实中长期日光暴露所导致的慢性累积性皮肤损伤，且已被证实可诱导出与人类皮肤病理变化高度一...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ALT 活性检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	P2711M	丙氨酸转氨酶活性检测试剂盒
Amplex Red CRE 检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0291S	肌酐检测试剂盒
抗荧光淬灭封片剂	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	P0126	荧光信号保存用封片介质
AST 活性检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	P2715S	天冬氨酸转氨酶活性检测试剂盒
BCA 蛋白检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	P0012	蛋白浓度测定试剂盒
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	V900933	非特异性结合封闭试剂
BUN 检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0574S	血尿素氮检测试剂盒
CAT 检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0051	过氧化氢酶活性检测试剂盒
CCK-8 试剂	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	96992	一种水溶性四唑盐类细胞活力检测试剂
CDK2 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-79024	用于 CDK2 检测的一抗
化学发光试剂 ECL	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-K1005	增强型化学发光检测试剂
胶原蛋白 I 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA1-26204	用于胶原蛋白 I 检测的一抗
周期蛋白 A2 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-34682	用于周期蛋白 A2 检测的一抗
DAPI 染色液	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9542	细胞核染色染料
DCFH-DA 荧光探针	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-D0940	活性氧荧光探针
分化液	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	C0161s	苏木精染色中分化步骤所用试剂
二氢乙啶探针	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0063	活性氧探针
成纤维细胞培养基	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, China	SNPM-H342	成纤维细胞生长用完全培养基
FITC 标记的山羊抗兔 IgG	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F-2765	异硫氰酸荧光素（FITC）标记的二抗
流式细胞仪	BD biosciences, San Jose, CA, USA	BD FACSCaliburTM	流式细胞分析仪
FlowJo 软件	BD biosciences, San Jose, CA, USA	v10.8	流式细胞术分析软件
荧光显微镜	Leica, Heidelberg, Germany	DM IL LED	用于荧光成像的显微镜
GAPDH 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA1-987	蛋白归一化内参抗体
凝胶成像系统	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	iBright CL1500	用于蛋白检测的成像系统
山羊抗兔 IgG	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	31460	免疫检测用二抗
Graphpad Prism 9.0 软件	GraphPad Software, San Diego, CA, USA	Prism 9.0	绘图软件
GSH 检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0053	谷胱甘肽含量检测试剂盒
HE 染色试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	C0105S	用于组织形态学分析的组织学染色试剂盒
HNK	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-N0003	和厚朴酚（honokiol），生物活性化合物
人皮肤成纤维细胞	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, China	SNP-H342	原代人皮肤成纤维细胞
IBM SPSS Statistics 26.0 软件	IBM Corporation, Armonk, NY, USA	IBM SPSS Statistics 26.0	统计分析软件
ImageJ 软件	Wayne Rasband, National Institute of Mental Health, USA	version 1.54h	图像分析软件
Ki67 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	MA5-14520	用于细胞增殖标志物检测的一抗
光学显微镜	Leica, Heidelberg, Germany	DM3000	用于明场成像的光学显微镜
Masson 三色染色试剂盒	Solarbio, Beijing, China	G1340	胶原蛋白和结缔组织染色试剂盒
MDA 检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0131S	丙二醛水平检测试剂盒（脂质过氧化标志物）
酶标仪	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	1410101	基于细胞实验的吸光度测定仪器
MMP-1 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-27210	用于基质金属蛋白酶-1 检测的一抗
MMP-1 ELISA 试剂盒	Enzyme-linked Biotechnology, Shanghai, China	ml038199	生物样本中 MMP-1 的定量检测试剂盒
MMP-3 抗体	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab52915	用于基质金属蛋白酶-3 检测的一抗
MMP-3 ELISA 试剂盒	Enzyme-linked Biotechnology, Shanghai, China	ml105322	生物样本中 MMP-3 的定量检测试剂盒
中性树胶	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	C0173	封片介质
P16 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-20379	用于 p16 蛋白检测的一抗
P21 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	MA5-14949	用于 p21 蛋白检测的一抗
P53 抗体	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab131442	用于 p53 蛋白检测的一抗
多聚甲醛	Solarbio, Beijing, China	P1110	细胞和组织固定试剂
PI	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	ST512	用于细胞周期分析中 DNA 染色的碘化丙啶
前胶原 I 型 C 肽检测试剂盒	TAKARA, Tokyo, Japan	MK101	胶原蛋白合成检测试剂盒
p-Smad2 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	44-244G	用于磷酸化 Smad2 检测的一抗
p-Smad3 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	44-246G	用于磷酸化 Smad3 检测的一抗
PVDF 膜	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	88520	用于 Western 印迹的蛋白转印膜
RIPA 裂解缓冲液	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	P0013B	用于细胞和组织裂解液的蛋白提取缓冲液
RNaseA	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	ST579	DNA 染色过程中去除 RNA 的核糖核酸酶
SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	C0602	细胞衰老检测试剂盒
SB431542	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-10431	TGF-β1 信号通路抑制剂
SDS-PAGE 凝胶	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	WG1403BX10	用于蛋白电泳的聚丙烯酰胺凝胶
SKH1 无毛小鼠	Vitalriver, Beijing, China		用于皮肤光老化研究的动物模型
Smad2 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	51-1300	用于 Smad2 检测的一抗
Smad3 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	51-1500	用于 Smad3 检测的一抗
SOD 检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0101S	超氧化物歧化酶活性检测试剂盒
TGF-β1 抗体	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab215715	用于 TGF-β1 检测的一抗
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	X-100	用于细胞膜通透化的非离子型去垢剂
TUNEL 检测试剂	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	C1086	用于 DNA 断裂检测的细胞凋亡检测试剂
二甲苯	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	247642	用于组织脱蜡的有机溶剂