研究厚朴酚调控紫外线A诱导的皮肤光老化模型中转化生长因子β1/Smad信号通路的实验方案

摘要

本方案研究了和厚朴酚是否通过激活TGF-β1/Smad通路并降低MMP表达，从而改善UVA诱导的人皮肤成纤维细胞及小鼠皮肤光老化。

摘要

和厚朴酚（HNK）是从厚朴（Magnolia officinalis）中提取的关键成分，具有治疗皮肤疾病的潜力。目前，HNK对皮肤中长波紫外线（UVA）诱导的光损伤的影响及其作用机制尚不明确。本研究通过UVA照射构建了人皮肤成纤维细胞（HDF细胞）和无毛小鼠皮肤的光老化损伤模型。采用细胞活力检测法考察HNK对正常HDF细胞及UVA诱导损伤的HDF细胞活力的影响。使用不同试剂盒测定HDF细胞中SOD、GSH、CAT和MDA的水平，并利用DCFH-DA和二氢乙啶（Dihydroethidium）检测活性氧（ROS）水平。通过SA-β-半乳糖苷酶染色和TUNEL染色检测HDF细胞的衰老和凋亡情况，采用流式细胞术分析细胞周期进程。通过病理染色评估皮肤组织的组织病理学损伤。此外，采用免疫荧光和蛋白质印迹法（Western blot）检测Ki67、胶原蛋白、基质金属蛋白酶（MMP）以及TGF-β1/Smad信号通路相关蛋白的表达水平。结果显示，HNK（2.5–10 µM）处理对正常HDF细胞活力无不良影响，但可减轻UVA诱导的HDF细胞损伤，降低氧化应激和细胞凋亡水平。UVA可诱导HDF细胞衰老，引起S期阻滞，下调Ki67表达，减少胶原蛋白含量，并增加MMP的表达；而HNK能有效缓解上述UVA诱导的异常变化。此外，UVA照射导致小鼠皮肤出现更深的皱纹，皮肤含水量和胶原蛋白含量下降，表皮厚度增加；而皮下注射HNK可减轻皮肤组织的病理损伤，并提高皮肤含水量和胶原蛋白含量。进一步研究发现，HNK可激活TGF-β1/Smad信号通路，而TGF-β1抑制剂SB431542可削弱HNK对HDF细胞和小鼠皮肤光老化损伤的保护作用。综上所述，HNK可通过激活TGF-β1/Smad信号通路，降低MMP的表达，从而抑制UVA诱导的HDF细胞和小鼠皮肤光老化，具有作为改善光老化损伤药物的潜力。

引言

皮肤老化的过程十分复杂，主要分为两种形式：自然老化和光老化¹。研究表明，高达80%至90%的皮肤老化由环境中的外源性因素引起（例如紫外线、空气污染），其中长期紫外线辐射引起的光老化影响最为严重^2,3。紫外线辐射可分为UVC、UVB和UVA三类。由于UVC无法穿透臭氧层，目前关于光老化的研究主要集中于UVA（320-400 nm）和UVB（280-320 nm）^4,5,6。与UVB相比，UVA能量较低，但穿透性更强，可穿过表皮并深入真皮层，是导致严重皮肤老化的重要原因⁷。既往研究显示，57 mJ/cm²的UVB辐射与20 J/cm²的UVA辐射对HaCaT细胞造成的损伤程度相当⁸。皮肤光老化会引起皮肤功能和结构的改变，具体表现为皮肤表层组织松弛、皱纹加深、胶原蛋白流失以及肉眼可见的肤色发灰；严重时可出现多种良性、癌前病变甚至肿瘤^9,10

方案

所有细胞培养实验均按照机构生物安全指南进行，并在生物安全二级（BSL-2）实验室条件下操作。动物实验经中国人民解放军联勤保障部队第988医院动物伦理委员会批准后开展（批准编号：2023-089）。

所有实验操作均严格遵循机构和国家关于实验动物护理和使用的指南进行。实验结束时，通过腹腔注射过量的戊巴比妥钠（100 mg/kg）对小鼠实施安乐死。在饲养、处理和采样过程中，均尽可能减少动物的痛苦。本实验方案中使用的试剂、化学品、设备和软件均列于材料表中。

1. 细胞培养与处理

1. 在成纤维细胞培养基中培养人皮肤成纤维细胞（HDF）。将培养物置于37 °C、湿度饱和、含5% CO₂的环境中培养。
2. 每3天更换一次培养基，当细胞融合时以1:3的比例传代。
3. 使用UVA灯（发射光谱：320–400 nm）以5 J/cm²的剂量照射HDF。
4. UVA照射30分钟后立即更换新鲜培养基。连续8天每天重复一次UVA照射³²。
5. 在剂量筛选实验中，用2.5、5、10、20或40 µM HNK处理HDF，处理时间为24小时或48小时³³。在后续实验中，用2.5、5或10 µM HNK....

结果

HNK 缓解 UVA 引起的 HDF 细胞氧化应激损伤
通过细胞活力检测分析了不同浓度 HNK 处理 24 小时或 48 小时对 HDF 细胞活力的影响，以筛选合适的浓度和处理时间。结果显示，2.5、5 和 10 µM 的 HNK 在处理 24 小时或 48 小时后对正常 HDF 细胞的活力无显著影响，表明在这些剂量下 HNK 对正常细胞无毒性。值得注意的是，2.5、5 和 10 µM 的 HNK 能够缓解 UVA 所诱导的 HDF 细胞活力下降，提示 HNK 可保护 HDF 细胞免受 UVA 损伤，且 24 小时处理的效果优于 48 小时。当 HNK 浓度升高至 20 和 40 µM 时，正常 HDF 细胞及 UVA 处理的 HDF 细胞活力均显著下降，提示高浓度 HNK（20–40 µM）对 HDF 细胞具有一定毒性作用（图 1A, B）。因此，在后续实验中选择 2.5、5 和 10 µM HNK 处理 HDF 细胞 24 小时。UVA 照射后，HDF 细胞中 SOD 和 CAT 活性显著降低，GSH 含量也明显减少，而 MDA 和 ROS 水平显著升高，表.......

讨论

紫外线是损害细胞和生物体的环境因素之一。已有研究表明，由于UVA具有较强的穿透能力，是到达地球表面的主要紫外线类型³⁸。成纤维细胞是真皮中重要的功能细胞，其衰老可直接或间接导致皮肤老化³⁹。HDF细胞模型和无毛小鼠模型中的UVA诱导光老化损伤被广泛应用于皮肤光老化研究^40,41。因此，参考既往研究构建了UVA诱导的光损伤细胞和动物模型（HDF细胞每日5 J/cm²，连续照射8天；小鼠每周照射数次，每次0.35 J/cm²，持续8周）^32,33,34。该照射方案避免了单次过量照射引起的急性细胞坏死和组织损伤，更接近现实中长期日光暴露所导致的慢性累积性皮肤损伤，且已被证实可诱导出与人类皮肤病理变化高度一.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ALT 活性检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	P2711M	丙氨酸转氨酶活性检测试剂盒
Amplex Red CRE 检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0291S	肌酐检测试剂盒
抗荧光淬灭封片剂	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	P0126	荧光信号保存用封片介质
AST 活性检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	P2715S	天冬氨酸转氨酶活性检测试剂盒
BCA 蛋白检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	P0012	蛋白浓度测定试剂盒
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	V900933	非特异性结合封闭试剂
BUN 检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0574S	血尿素氮检测试剂盒
CAT 检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0051	过氧化氢酶活性检测试剂盒
CCK-8 试剂	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	96992	一种水溶性四唑盐类细胞活力检测试剂
CDK2 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-79024	用于 CDK2 检测的一抗
化学发光试剂 ECL	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-K1005	增强型化学发光检测试剂
胶原蛋白 I 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA1-26204	用于胶原蛋白 I 检测的一抗
周期蛋白 A2 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-34682	用于周期蛋白 A2 检测的一抗
DAPI 染色液	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9542	细胞核染色染料
DCFH-DA 荧光探针	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-D0940	活性氧荧光探针
分化液	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	C0161s	苏木精染色中分化步骤所用试剂
二氢乙啶探针	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0063	活性氧探针
成纤维细胞培养基	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, China	SNPM-H342	成纤维细胞生长用完全培养基
FITC 标记的山羊抗兔 IgG	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F-2765	异硫氰酸荧光素（FITC）标记的二抗
流式细胞仪	BD biosciences, San Jose, CA, USA	BD FACSCaliburTM	流式细胞分析仪
FlowJo 软件	BD biosciences, San Jose, CA, USA	v10.8	流式细胞术分析软件
荧光显微镜	Leica, Heidelberg, Germany	DM IL LED	用于荧光成像的显微镜
GAPDH 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA1-987	蛋白归一化内参抗体
凝胶成像系统	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	iBright CL1500	用于蛋白检测的成像系统
山羊抗兔 IgG	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	31460	免疫检测用二抗
Graphpad Prism 9.0 软件	GraphPad Software, San Diego, CA, USA	Prism 9.0	绘图软件
GSH 检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0053	谷胱甘肽含量检测试剂盒
HE 染色试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	C0105S	用于组织形态学分析的组织学染色试剂盒
HNK	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-N0003	和厚朴酚（honokiol），生物活性化合物
人皮肤成纤维细胞	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, China	SNP-H342	原代人皮肤成纤维细胞
IBM SPSS Statistics 26.0 软件	IBM Corporation, Armonk, NY, USA	IBM SPSS Statistics 26.0	统计分析软件
ImageJ 软件	Wayne Rasband, National Institute of Mental Health, USA	version 1.54h	图像分析软件
Ki67 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	MA5-14520	用于细胞增殖标志物检测的一抗
光学显微镜	Leica, Heidelberg, Germany	DM3000	用于明场成像的光学显微镜
Masson 三色染色试剂盒	Solarbio, Beijing, China	G1340	胶原蛋白和结缔组织染色试剂盒
MDA 检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0131S	丙二醛水平检测试剂盒（脂质过氧化标志物）
酶标仪	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	1410101	基于细胞实验的吸光度测定仪器
MMP-1 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-27210	用于基质金属蛋白酶-1 检测的一抗
MMP-1 ELISA 试剂盒	Enzyme-linked Biotechnology, Shanghai, China	ml038199	生物样本中 MMP-1 的定量检测试剂盒
MMP-3 抗体	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab52915	用于基质金属蛋白酶-3 检测的一抗
MMP-3 ELISA 试剂盒	Enzyme-linked Biotechnology, Shanghai, China	ml105322	生物样本中 MMP-3 的定量检测试剂盒
中性树胶	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	C0173	封片介质
P16 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-20379	用于 p16 蛋白检测的一抗
P21 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	MA5-14949	用于 p21 蛋白检测的一抗
P53 抗体	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab131442	用于 p53 蛋白检测的一抗
多聚甲醛	Solarbio, Beijing, China	P1110	细胞和组织固定试剂
PI	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	ST512	用于细胞周期分析中 DNA 染色的碘化丙啶
前胶原 I 型 C 肽检测试剂盒	TAKARA, Tokyo, Japan	MK101	胶原蛋白合成检测试剂盒
p-Smad2 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	44-244G	用于磷酸化 Smad2 检测的一抗
p-Smad3 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	44-246G	用于磷酸化 Smad3 检测的一抗
PVDF 膜	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	88520	用于 Western 印迹的蛋白转印膜
RIPA 裂解缓冲液	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	P0013B	用于细胞和组织裂解液的蛋白提取缓冲液
RNaseA	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	ST579	DNA 染色过程中去除 RNA 的核糖核酸酶
SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	C0602	细胞衰老检测试剂盒
SB431542	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-10431	TGF-β1 信号通路抑制剂
SDS-PAGE 凝胶	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	WG1403BX10	用于蛋白电泳的聚丙烯酰胺凝胶
SKH1 无毛小鼠	Vitalriver, Beijing, China		用于皮肤光老化研究的动物模型
Smad2 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	51-1300	用于 Smad2 检测的一抗
Smad3 抗体	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	51-1500	用于 Smad3 检测的一抗
SOD 检测试剂盒	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0101S	超氧化物歧化酶活性检测试剂盒
TGF-β1 抗体	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab215715	用于 TGF-β1 检测的一抗
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	X-100	用于细胞膜通透化的非离子型去垢剂
TUNEL 检测试剂	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	C1086	用于 DNA 断裂检测的细胞凋亡检测试剂
二甲苯	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	247642	用于组织脱蜡的有机溶剂