本方案描述了一种比色法，用于通过桑德尔-科尔索夫反应（Sandell-Kolthoff反应）可靠评估化学品对人肝微粒体中脱碘酶1（DIO1）活性的影响。方案包含预定义的可接受标准和统计性能指标，支持将其纳入OECD试验指南的持续努力。
本文内容
摘要
摘要
该方法可用于鉴定抑制DIO1活性的受试物质，从而识别可能干扰甲状腺激素稳态的化合物。本文所述方案介绍了一种非放射性、比色法检测受试物质对人肝微粒体中脱碘酶1（DIO1）酶活性影响的方法。该检测基于Sandell-Kolthoff（SK）反应，通过定量反式三碘甲腺原氨酸（rT3）脱碘生成二碘甲腺原氨酸（T2）过程中释放的碘离子来进行。在碘离子存在下，黄色的四价铈被还原为无色的三价铈，可在415 nm处进行光度检测。在此标准化体系中，四价铈浓度设定为40 mM，以在所述条件下提高信号的稳定性和稳健性。为确保检测的可靠性与可重复性，设置了全面的对照体系：6-丙基-2-硫尿嘧啶（参比物质）、金硫葡萄糖（阳性对照）、1-硫代-β-D-葡萄糖钠盐（阴性对照）以及1%二甲基亚砜（溶剂对照）。本方案包含预实验以确定合适的受试浓度，对微粒体批次特异性的碘离子释放活性进行标准化，并在无微粒体条件下开展系统的化学干扰测试；此外可选做不含二硫苏糖醇（DTT）的后续评估，以识别依赖DTT产生的假象。DIO1-SK检测适用于中高通量筛选及机制毒理学研究。其稳健性、可扩展性以及适用于人源微粒体的特点，使其成为研究内分泌干扰作用的有力工具。本方案可支持法规层面的验证工作。
引言
内分泌干扰物（EDs）是一类干扰激素调节的化学物质，因此会对人类健康造成有害影响1,2。脱碘酶（DIO）是一类与细胞膜相关的酶，其活性位点的关键残基为硒代半胱氨酸。该酶家族包含三种不同的同工型（DIO1、DIO2 和 DIO3），共同调节循环中甲状腺激素（TH）的浓度，并控制其在细胞内的组织特异性可利用性3。甲状腺素（T4）作为前体激素，以及三碘甲腺原氨酸（T3）作为活性形式，在调节机体能量消耗、生长、发育过程和体温调节中发挥关键作用4。DIO 同工型在脱碘位点特异性、动力学特性及底物偏好方面具有不同特征3。DIO1 是成人肝脏中的主要脱碘酶同工型，对反式三碘甲腺原氨酸（rT3）和硫酸化碘代甲状腺原氨酸具有较强的底物亲和力；而 DIO2 优先利用 T4 和 rT3，DIO3 则主要作用于 T4 和 T3。利用人肝微粒体并以 rT3 作为底物，可选择性检测 DIO1 活性，从而最大限度减少其他同工型的干扰。尽管物质诱导的 DIO1 抑制作用的具体后果仍有待进一步阐明，但来自影响 DIO1 的人类基因突变的证据明确表明，DIO1 可干扰甲状腺激素系统5。因此，迫切需要建立可靠且可重复的方法来研究 DIO1 的抑制作用。
本文方法旨在利用基于Sandell-Kolthoff（SK）反应的非放射性比色法，在体外定量测定DIO1活性。DIO1催化反向三碘甲腺原氨酸（rT3）转化为二碘甲腺原氨酸（T2），此过程释放碘离子。SK反应可灵敏检测所释放的碘离子，从而通过碘离子释放活性（IRA）直接反映DIO1活性。该检测方法可用于评估受试物质对DIO1的抑制作用，支持机制毒理学研究、筛选或监管决策。该方法尤其适用于研究DIO1抑制作为导致甲状腺功能紊乱的不良结局通路中的分子起始事件，符合EURL ECVAM等国际验证机构所制定的相关框架要求。6,7该方法最初于2012年开发。8,9 并进一步优化6,7 为应对日益增长的对稳健、可重复且可扩展的需求 体外 可用于内分泌筛查测试组合的检测方法，特别是在甲状腺激素代谢背景下。最近，基于类似SK的装置在中等规模应用中的使用10 高通量筛选11 已发表，展示了基于SK方法的广泛适用性。
尽管DIO1-SK检测法通过定量IRA而非甲状腺激素（TH）产物来间接测量DIO1活性，但相较于其他技术仍具有多项优势。与依赖放射性标记底物的方法不同12 或基于质谱的甲状腺激素耗竭或生成的定量分析13SK反应通过在415 nm处检测碘化物的释放，提供了一种简单、可扩展且成本效益高的检测方法14尽管采用固相萃取的液相色谱-串联质谱法（SPE-LC-MS/MS）在定量反式三碘甲腺原氨酸（rT3）和二碘甲腺原氨酸（T2）方面具有高特异性和高灵敏度，但该方法需要昂贵的仪器设备，且较不适用于高通量筛查。相比之下，DIO1-SK 检测法可在标准实验室条件下实施，并已预先验证可用于人肝微粒体，表现出良好的重复性和预测能力。6,7在一项比较研究中，SK反应的结果（特别是碘化物的释放）与采用固相萃取-液相色谱-串联质谱法（SPE-LC-MS/MS）定量检测的甲状腺激素代谢物（rT3和T2）进行了直接比较。15研究结果表明，在多种测试物质及不同抑制效力下，两种方法之间具有高度一致性。对于所有测试物质，通过SK反应测得的碘化物释放活性（IRA）变化与质谱法测定的rT3和T2水平变化高度一致。这进一步支持了SK检测结果可作为DIO1活性替代指标的有效性。这些比较分析证实，SK检测法相较于更复杂的分析技术是一种稳健且可靠的替代方法，且可准确测定碘化物释放以评估DIO1抑制作用 体外.
然而，SK 方法存在某些必须考虑的局限性：该方法易受到一些物质的干扰，这些物质可能含有游离碘化物作为杂质，或非酶促释放碘化物，或与检测组分（如二硫苏糖醇，DTT）发生反应。DTT 作为还原性辅因子被加入体系中，其作用是在催化循环过程中维持脱碘酶活性位点的硒代半胱氨酸处于还原状态，从而保障脱碘酶的催化活性。由于 DTT 是一种强还原剂，某些待测物质（或其杂质）可能发生氧化还原反应，从而影响比色检测信号，甚至在某些情况下引发与酶促碘化物释放无关的 DTT 依赖性检测干扰。此类干扰可能导致 DIO1 抑制作用出现假阴性结果，因为所测得的碘化物可能并非来源于 rT3 的酶促转化。因此，尽管 SK 检测法适用于常规筛选及大多数待测物质，但在怀疑存在检测干扰或待测物具有复杂化学性质时，可采用 LC-MS/MS 进行确证。
DIO1-SK 检测目前正准备作为经济合作与发展组织（OECD）测试指南纳入一项国际 PEPPER（内分泌干扰物表征方法验证的公私合作平台）项目，这凸显了该检测在法规应用以及内分泌干扰物测试策略国际协调方面日益重要的地位。该检测可整合到全面的体外测试组合中，既可用于化学品安全性评价，也可用于内分泌干扰机制的研究16。当与其他针对甲状腺不良结局通路中其他关键事件的检测联合使用时，有助于更全面地理解甲状腺激素干扰的机制。
此外，该方案具有良好的可扩展性和高重复性，适用于中高通量筛选。这在药物开发以及学术研究中评估大量物质时至关重要，最近的研究已对此进行了验证11。对于关注DIO1抑制作用的研究人员，无论其目的是筛选化合物、机制毒理学研究还是监管决策，都将受益于一种可靠、易用且多功能的检测方法。该方法的验证将使其成为研究甲状腺激素系统干扰以及评估化学品安全性的标准工具。
方案
注意：在进行主实验之前，必须完成一系列准备步骤，以确保DIO1-SK实验的准确性、可重复性和有效性。这些预实验操作包括制备填充离子交换树脂的滤板，这对于有效分离以及减少SK反应中的背景干扰至关重要。Sandell-Kolthoff反应需定期使用碘化物标准曲线进行标准化，以监测系统性变化并维持实验质量。同时需测定人肝微粒体的活性，以确定不同批次样品的碘化物释放能力，确保各实验间酶活性表现一致。上述步骤共同为后续主实验及数据分析奠定了坚实基础，有助于获得可重复且易于解释的实验结果。
1. 实验前准备工作
- 缓冲液与试剂的配制
- 提前按所述方法配制所有缓冲液和储备溶液 表1. 按照指示储存分装样品，以确保稳定性和可重复性。
- 在检测当天，为每块96孔板新鲜配制底物混合液。配制一份96孔板所需的底物混合液时，将5.75 mL HEPES/EDTA缓冲液（50 mM HEPES，2.16 mM EDTA，pH 7.0）、0.5 mL解冻的1 M DTT以及10 µL 6 mM rT3（溶于DMSO）混合，轻轻混匀，置于冰上保存，待用。
- 参考品的制备
- 配制10-1 在进行检测当天，使用适当的溶剂（如DMSO）新鲜配制6-PTU参考对照品的M储备溶液。
- 将该原液用去离子水稀释10倍2O (RI-C8) 以达到 10% 的 DMSO 浓度，并用含 10% DMSO 的二水合水（diH₂O）对该储备液进行系列稀释2如所述的 O 表2.
- 阳性对照的制备
- 配制10-2 阳性对照物Aurothioglucose的M储备液溶于适当溶剂（如DMSO）中，4 °C保存，可存放长达6个月。
- 在检测当天，将储备液稀释至10-3 M in diH2O 以达到 10% DMSO 的浓度。
- 阴性对照的制备
- 配制10-2 负对照1-硫代-β-D-葡萄糖钠盐的M储备液，需在进行检测当天新鲜配制。
- 在检测当天，将储备液稀释至10-3 M in diH2O 以达到 10% DMSO 的浓度。
注意：操作时务必采取适当的安全防护措施，尤其是在处理亚砷酸钠和硫酸等危险化学品时。所有试剂均应使用去离子水配制，并按照生产商的建议进行储存。底物混合液配制后，以及解冻的DTT分装液，仅限在检测当天一次性使用，不得再次冻存。
- 离子交换树脂的浇铸
- 使用一个合适的矩形透明容器进行制备。
- 加入约 250 g（或所需量）离子交换树脂至一个大容器中并进行洗涤。加入 10% 乙酸进行洗涤，让树脂悬浮液静置 10 分钟。
- 静置悬浮液10分钟后，轻轻倾斜并吸除上清液。总共至少洗涤5次，或直至无更多颜色渗入溶剂中为止。
- 最后一次洗涤步骤后，加入10%乙酸，使其约占总体积的50%。
- 将容器倾斜，使树脂移至一侧，并保持容器处于倾斜状态。静置约10分钟，待各相完全分离。
- 将一个96孔滤板置于96深孔板上方，在96孔滤板的每孔中加入100 µL 10%乙酸。
- 将用于树脂包埋的吸头尖端剪至约 1 cm 高度，以扩大末端开口，并向 96 孔滤板的每个孔中加入 300 µL 离子交换树脂。
注意：本工作中使用的吸头最大容量为 1,200 µL，可与多通道移液器配合使用。 - 通过离心将乙酸洗脱至96深孔板中，体积为100–200 × g 在带有微孔板甩出式转子的离心机中离心1 min。检查树脂是否在板上分布均匀。
- 用不透性塑料膜密封板，于4 °C保存，最长可保存6个月。
注意：如果离子交换树脂成分未彻底清洗干净，会影响SK反应。去除的上清液可直接用于SK反应（取50 µL上清液样品，加入50 µL铈溶液，最后加入50 µL亚砷酸盐溶液），并与10%乙酸样品（空白对照）进行比较，以确保树脂成分完全洗净。
- Sandell-Kolthoff反应的标准化
- 从相应的碘化物来源（如碘化物标准溶液）配制碘化物稀释液，使用去离子水中的相应碘化物标准品，推荐浓度分别为 1,500、1,000、750、500、400、300、200、100、50、25、10、5 和 1 nM 碘化物2O.
- 加入 50 µL 纯的 diH2O 作为对照，将50 µL制备好的碘化物稀释液按照前述板式布局，每组设三个复孔，加入96孔板中 图1.
- 向所有孔中加入50 µL 40 mM 铈溶液，并通过向所有孔中加入50 µL 25 mM 亚砷酸盐溶液启动反应。
- 加入亚砷酸盐溶液后，应尽快使用酶标仪在415 nm（±2 nm）波长下测定吸光度，每分钟记录一次光密度（OD），持续21分钟，并同时记录初始OD值。
- 按照第4节所述评估结果。
注意：通常，ΔOD 的背景值21分钟 > 0.3 在纯 diH 中2O对照组需要关注并进一步调查其潜在原因（例如，As或Ce批次中的污染、水质过低）。
- 评估微粒体活性
- 按照步骤1.2所述，配制参比物（6-PTU）的最高浓度溶液（RI-C8）。
- 按照所述方法制备六种微粒体稀释液 表3 以及如前所述的底物混合液 表1.
- 加入10 µL体积分数为10%（v/v）的溶剂稀释液至二水合物中2O（例如，二甲基亚砜在二氢水中的浓度为10%）2O）和10 µL的10-2 将 M 6-PTU (RI-C8) 按照96孔板的布局设计，每组设三个复孔，加入96孔板中 图2.
- 加入 40 µL 用二水合水稀释的微粒体稀释液2O（每孔分别加入20、10、5、2.5、1.25、0.68和0 µg微粒体蛋白）至96孔板，具体加样布局见板式图。
注意：供应商通常会提供微粒体蛋白的储存浓度。若未提供，可采用标准的蛋白定量方法测定，但本研究中未使用此类方法。 - 向每个孔中加入 50 µL 新鲜配制的底物混合液，并用不透性塑料封板膜密封培养板。
- 将96孔板置于摇床中的培养箱内（37 °C，850 rpm），孵育2 h。
- 孵育结束后，将培养板置于冰上以终止反应。
- 进行离子交换，步骤参照2.2。
- 将离子交换步骤中获得的深孔板中的适量样品转移至新的96孔板，用于测定未稀释样品（50 µL样品）、1:2稀释（25 µL样品 + 25 µL 10%乙酸）和1:4稀释（12.5 µL样品 + 37.5 µL 10%乙酸），保持板式布局不变。
- 按照第4节所述评估结果，确定样品在10%乙酸中的稀释倍数以及仍能产生最大可能ΔOD的微粒体蛋白浓度21分钟 - 在未达到饱和平台期的 Sandell-Kolthoff 反应中的 BG 值。
注意：通常，碘化物释放量为 ΔOD21分钟 > 0.5 在每孔含 20 µg 微粒体蛋白样品的 1:4 或 1:2 乙酸稀释条件下容易达到，ΔOD 通常在该水平附近。21分钟 不建议使用更高的微粒体蛋白浓度，因为这会增加检测过程中的背景信号和非特异性结合。建议使用已确定的微粒体浓度和稀释倍数，重复进行6-PTU稀释系列的测定，以验证结果。
- 测试样品的溶解度评估
- 将待测样品在室温下用合适的溶剂（例如 DMSO）溶解至 100 mM 或 200 mg/mL。混合或涡旋振荡，并通过显微镜目视检查溶解情况。
- 若未完全溶解，可超声处理最多5分钟，然后再次检查。若仍未溶解，可在37 °C加热最多60分钟，再重新检查。
- 若不溶解，则进一步稀释或以较低浓度配制新的母液，并重复实验步骤。如果DMSO不适用，可尝试用水或乙醇作为替代溶剂。
- 溶解后，用二水合氢氧化物按1:10比例稀释2O（10% 溶剂），并重复评估（根据需要进行混合、超声、加热）。
- 为模拟检测条件，用检测缓冲液配制1%的待测物稀释液，并重复溶解度检查。
- 测试物品制备与剂量范围探索
- 在步骤1.8的溶解度评估中确定的合适溶剂（优选DMSO）中，将受试品配制成最高可溶浓度的储备液。
- 在预实验中，使用储备液和含10% DMSO的去离子水，通过连续1:10（v/v）稀释步骤配制八个测试品稀释液。2O.
- 进行预实验以评估受试品的抑制特征，执行第2节中描述的步骤。如果受试品在任一浓度下显示≥25%的抑制率，则应调整最终实验的浓度范围，使其至少包含三个处于线性抑制范围内的浓度点，以及两个抑制率低于10% IRA的浓度点（如适用）。
- 如果测试样品显示 <所有测试浓度下均出现25%抑制时，可使用相同的稀释系列进行最终的实验运行。在此情况下，浓度预实验可计入三次必需的独立实验运行之一。
注意：为确保结果的可重复性和可靠性，每种待测物品应至少进行两次、理想情况下三次独立实验。若选择其他稀释比例以更充分覆盖活性范围，允许偏离1:10的稀释比例。本检测策略中的25%截断值（见步骤1.9.3和1.9.4）用于区分待测物品效应与阴性对照，既考虑了基线活性的变异性，又提供了额外的安全余量。该阈值可确保抑制特征的可靠分类。
图1：碘离子标准曲线的孔板布局。 本图显示了用于生成碘离子标准曲线的96孔板布局。孔中包含浓度范围从1 nM到1,500 nM的碘离子系列稀释液，以及仅含去离子水（diH2O）的对照孔。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：微粒体蛋白滴定与参照物测试的板布局。 本图展示了用于微粒体蛋白滴定和参照抑制剂（6-PTU）测试的96孔板布局。各列孔中微粒体蛋白浓度逐行递增，部分孔含有6-PTU，部分不含6-PTU。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 进行 DIO1–SK 检测
- 测试品与微粒体的孵育
- 按照步骤 1.2 所述方法制备参比品，以及按照步骤 1.3 和 1.4 所述方法制备阳性对照和阴性对照。根据步骤 1.8 和 1.9 所述方案，配制适当浓度的测试品。
- 按照表 1所述方法配制底物混合液，并通过将已预冷解冻并分装的微粒体溶液用去离子水（diH2O）稀释至预定蛋白浓度，制备微粒体悬液。将微粒体悬液置于冰上，待孵育时使用。
- 按照图 3 和图 4（若同时评估两种以上测试品）所示的板布局，向各孔中加入 10 µL 的参比品浓度梯度溶液、阳性对照、阴性对照、溶剂对照（10% (v/v) 溶剂溶于 diH2O）以及测试品的不同浓度溶液。
- 向所有孔中加入 40 µL 微粒体悬液。向样品孔中加入 50 µL 新鲜配制的底物混合液。
- 用不透性塑料封板膜密封反应板，置于摇床孵育器中（37 °C，850 rpm）孵育 2 小时；孵育结束后将反应板立即置于冰上以终止反应。
- 孵育结束后将反应板置于冰上以终止反应。
注：为保持样品完整性，反应板可在冰上保存至检测前。首次检测板包含参比品的八个浓度梯度，而同一天内后续每块检测板仅包含参比品的最高浓度，以便在需要时为额外测试品预留更多孔位。
- 通过填充离子交换树脂的 96 孔滤板进行分离
- 将步骤 1.5 中制备好的填充离子交换树脂的 96 孔滤板置于一个 96 孔深孔板上方，并向滤板的每个孔中加入 150 µL 10% 乙酸，以润湿柱中的树脂。
- 在配备适用于微孔板的摆动转子离心机中，以 100–200 × g 离心 1 分钟，使乙酸通过离心进入下方已使用的 96 孔深孔板中。
- 将已使用的 96 孔深孔板更换为一个新的 96 孔深孔板。
- 向步骤 2.1.6 中孵育后的 96 孔板各孔中加入 133 µL 10% 乙酸，并短暂振荡混匀。
- 将上一步制备的样品各 175 µL 转移至填充离子交换树脂的 96 孔滤板中，保持原始板布局不变。
- 在配备适用于微孔板的摆动转子离心机中，以 100–200 × g 离心 1 分钟，使样品通过树脂进入 96 孔深孔板。随后移除填充离子交换树脂的 96 孔滤板。
注：含样品的 96 孔深孔板可用不透性塑料封板膜密封，并在 4 °C 下保存至少 3 个月。此步骤允许在发生人为或技术误差、Sandell-Kolthoff 反应稀释因子调整，或需在后续数日进行补测时，重新进行检测。
- Sandell-Kolthoff 反应
- 根据所用微粒体批次在 10% 乙酸中确定的样品稀释因子（见步骤 1.7），向一个新的 96 孔板中加入 50 µL 未稀释或适当稀释的样品。
- 向所有孔中加入 50 µL 40 mM 铈溶液（按表 1所述方法配制），然后向所有孔中加入 50 µL 25 mM 亚砷酸盐溶液（按表 1所述方法配制）以启动反应。
- 加入亚砷酸盐溶液后应尽快开始检测，使用酶标仪在 415 nm（±2 nm）波长下每分钟记录一次光密度（OD），持续 21 分钟，并同时记录初始 OD 值。
图3：两种待测样品平行测试的微孔板布局。 96孔板布局，用于在多个浓度下对两种待测样品进行三复孔检测，同时设置阴性对照、阳性对照、溶剂对照和参考品的复孔。作为当天的第一个检测板使用。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：三种测试项平行测试的孔板布局。用于在多个浓度下对三种测试项进行三复孔测试的96孔板布局，包含阴性对照、阳性对照和溶剂对照的重复孔。参考品仅在其最高浓度下设置，因其已在第一块板上完成全部浓度测试（见 图3）。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 干扰检测（±微粒体和±DTT）
- 按照步骤1.2所述，配制参比品（6 PTU）的最高浓度溶液（RI C8），并配制供试品的储备液及其稀释液（包括供试品的最高浓度）。
- 按照步骤1.7中的规定浓度，将小心解冻后的分装微粒体用去离子水稀释，制备每孔所需的微粒体悬液2O. 将微粒体悬液置于冰上保存，直至使用。
- 制备两种底物混合液：按前述方法加入 DTT 的标准底物混合液 表1，以及另一种除不加DTT外其他成分完全相同的底物混合液（仅省略DTT）。
- 将样品加入至96孔板指定的孔中，依据 图5：10 µL RI C8，10 µL 体积分数为10%的DMSO水溶液2O（溶剂对照），以及每种受试品稀释液各10 µL。
- 向指定为“含微粒体”的孔中加入 40 µL 微粒体悬液，向其他孔中加入 40 µL diH2加入到标记为“无微粒体”的孔中，按照 图5.
- 在冰上，向标记为“含DTT”的孔中加入50 µL含DTT的底物混合液，向标记为“不含DTT”的孔中加入50 µL不含DTT的底物混合液（图5).
- 用不透性塑料封板，在摇床培养箱中孵育（37 °C，850 rpm）2小时。
- 孵育结束后，将培养板置于冰上以终止反应。
- 按照第2.2和2.3步所述进行离子交换分离，并通过SK反应定量碘化物，然后按照第4节所述评估结果。
注意：此单板设置（图5在平行实验中，通过比较最高浓度测试物在有无微粒体以及有无DTT条件下的反应，以区分DIO1酶活性与检测干扰。若在无微粒体孔中IRA增加≥20%，表明存在SK干扰（即与DIO1无关的碘离子释放/检测信号），该物质将被归类为“不适用于DIO1 SK检测”，并被排除在分析之外。通过比较有无DTT条件下的差异，有助于识别DTT依赖性的碘离子释放作为另一种干扰机制。
图5：干扰测试的板布局。 本图展示了用于干扰测试的96孔板布局，其中测试样品、参考样品和溶剂对照均在有无微粒体的情况下进行检测，同时在有DTT和无DTT的条件下分别进行测试。请点击此处查看该图的放大版本。
4. 数据评估
- DIO1 活性评估
- 测定 ΔOD21分钟 通过从所有样本的初始测量值（0 分钟）中减去 21 分钟时的数值来计算：
- 通过从 ΔOD 的平均值中减去背景值，计算 ΔOD-BG。21分钟 受抑制的10的值 3 M 6-PTU（RI）对照组的ΔOD值21分钟 所有样本的值：
- 通过将测试项（TI）的ΔOD值除以相应溶剂对照组的值，对测试项的数值进行归一化处理21分钟-背景标题 通过ΔOD的平均值计算数值21分钟 -BG干细胞 相应溶剂对照（SC）的值，计算得到碘化物释放活性（IRA）的百分比值。
- 在统计分析软件中绘制不同浓度测试物的IRA值，以IRA值为纵轴（线性），测试物浓度为横轴（对数）。
- 使用曲线拟合算法来可视化浓度-反应关系（例如，在所选统计软件中选择“[抑制剂] 对 反应 — 可变斜率（四参数）”）。“Top”表示最大反应值，“Bottom”表示最小反应值，“HillSlope”描述曲线的陡峭程度。
- 确定 IC50 参考品项，以及适用时，测试品项。
- 计算对数IC的变异系数（CV）50 参考项的百分比估计值：
- 计算经溶剂对照归一化的阴性对照的IRA（%）：
- 计算经溶剂对照归一化的阳性对照的IRA（%）：
- 计算 z’-因子：
- 为验证实验的有效性，将计算值与验收标准进行比较 表4.
注意：必须满足所有标准才能获得有效的检测运行。 - 根据测试物质的最大抑制率和IC值，将其分类为完全抑制剂、部分抑制剂或非抑制剂。50 值，如汇总所示 表5.
- 测定 ΔOD21分钟 通过从所有样本的初始测量值（0 分钟）中减去 21 分钟时的数值来计算：
结果
图6概述了DIO1‑SK检测方法的工作流程以及在实验室中成功建立该方法所需的关键标准化步骤。图6A总结了该检测的各个连续阶段，包括使用人肝微粒体、与待测物及对照品孵育、通过离子交换分离提取碘离子，以及利用Sandell–Kolthoff（SK）反应进行碘离子的比色定量。图6B强调了确保方法稳健性和结果有效性的标准化策略，包括：（i）SK反应的标准化，（ii）针对每批微粒体的活性测试，（iii）溶解度评估和干扰测试，（iv）预试验确定浓度范围，以及（v）根据首次有效检测运行结果调整待测物浓度。
该策略的核心环节是针对不同批次的微粒体活性检测，因为不同批次的人肝微粒体在rT3脱碘活性上可能存在显著差异，因此在常规物质测试前，必须确定每个新批次所需的适当酶浓度。
这种分阶段测试策略对于实施至关重要：只有在验证了检测方法的基础性能（对照、SK反应行为和微粒体活性）并标准化了检测条件后，才能获得有效且可解释的抑制谱结果。
图6： DIO1 SK 检测流程及标准化步骤。（A）该流程图展示了人肝微粒体的使用、96孔板的设置、与待测物及对照物的孵育、碘离子提取，以及通过 SK 反应进行比色定量的过程。各步骤按顺序呈现，以突出检测的主要阶段。（B）标准化步骤包括 Sandell-Kolthoff 反应的标准化、批次特异性的微粒体活性测试、溶解度评估和干扰测试、预实验确定浓度范围，以及根据首次有效检测运行结果调整待测物浓度。请点击此处查看该图的放大版本。
基于图6所示的工作流程与标准化框架，图7展示了实验室如何确定合适的微粒体蛋白浓度（以及离子交换后稀释倍数），以在保持参考抑制剂呈S型抑制响应的同时，实现足够的动态范围。图7A显示，ΔOD21min‑BG 随微粒体蛋白浓度的增加而升高，并依赖于离子交换后的稀释程度（未稀释、1:2、1:4）。选择在保持S型响应的前提下产生最高ΔOD21min‑BG的稀释倍数用于后续实验（示例：1:2稀释）。图7B比较了不同微粒体蛋白量下的6‑PTU抑制曲线，以确定仍能产生S型曲线的最低蛋白浓度（示例：每孔5 µg蛋白），从而在灵敏度与背景信号之间取得平衡。
重要的是，各实验室在采用该方法时都必须执行此优化步骤，因为所需的蛋白浓度取决于所用微粒体批次的活性，因而需要针对不同批次进行酶浓度的标准化。
图7： 微粒体活性及6-PTU的抑制作用。 （A）该图显示随着每孔微粒体蛋白量（log10[µg 蛋白/孔]）增加，经背景（BG）校正的Sandell-Kolthoff信号（ΔOD21 min – BG）随之升高的情况，测试条件为未稀释、1:2和1:4稀释。在具有最高ΔOD21 min – BG值且呈S形曲线的稀释度中，将选择1:2稀释用于后续实验。（B）参考抑制剂6-丙基-2-硫尿嘧啶（6-PTU）的浓度-反应曲线，显示在不同微粒体蛋白载量（5、7.5和10 µg 蛋白/孔）下，碘离子释放活性（IRA，以%表示）随log10[浓度（M）]的变化。IRA数值以溶剂对照组为基准进行归一化处理。两幅图中的数据点均代表一次典型微粒体活性测试中，每种条件下三个技术重复（孔）的平均值±标准差。曲线通过非线性回归拟合，采用四参数逻辑斯蒂模型（“可变斜率”，抑制剂vs.反应）。在呈现S形曲线的最低蛋白浓度中，将选择5 µg/孔用于后续实验。请点击此处查看该图的放大版本。
一旦完成工作流程和标准化步骤（图6），并为所选微粒体批次确定了适当的微粒体蛋白浓度（图7），即可建立核心检测参数，进而开展常规物质测试。在此阶段，可在标准化的孔板格式中将待测物质与板内对照组（参考物质、溶剂对照、阳性/阴性对照）同时进行评估，从而实现对抑制谱的可靠归一化处理和一致性的结果解读。
图8 基于碘化物释放活性（IRA）的浓度-反应行为展示检测的区分能力。参考抑制剂6-PTU（图8A）表现出IRA随浓度依赖性降低，呈现预期的S形抑制曲线，符合检测性能验证的预期特征。单宁酸（图8B) 显示出与参照抑制剂相当的抑制特征（最大抑制率 > 90%）的条件下。测试物质的三个最高浓度表现出负的IRA值。IRA值 <0% 并不代表具有生物学意义的“碘化物负释放”，而是源于计算过程（背景扣除及对溶剂对照组的归一化），该过程可能将溶剂对照组中的微小波动传递为负的归一化值。因此，在结果解读中，低于 0% 的 IRA 值被视为等同于 0%（基线）。邻苯二甲酸二丁酯（图8C) 在测试的浓度范围内未表现出抑制作用（最大抑制率低于25%），属于非抑制剂特征。综上，这些特征表明该检测方法能够在标准化条件下区分抑制性与非抑制性行为。该测试系统还可识别部分抑制剂，其最大抑制率介于25%至90%之间（数据未显示）。有关此类别划分的更多细节详见 表5.
图8：DIO1–SK检测的剂量-反应行为可区分抑制剂与非抑制剂。 剂量-反应曲线显示了碘化物释放活性（以%表示的IRA）相对于log10浓度（M）的变化情况，分别为（A）参考抑制剂6-PTU、（B）代表性抑制剂（单宁酸）和（C）代表性非抑制剂（邻苯二甲酸二丁酯）。IRA值在扣除背景信号后进行归一化处理，以溶剂对照组为基准。数据点表示单次独立实验的平均值±标准差（n = 3），每次实验中每个浓度设置三个技术重复孔。曲线通过非线性回归拟合，采用四参数逻辑斯蒂模型（“可变斜率”模型，抑制剂 vs. 反应）。在结果解读中，IRA值低于0%的视为等同于0%（基线水平）。这些数据表明，该检测方法对参考抑制剂可产生典型的S型抑制曲线，并可在标准化条件下确认浓度-反应曲线是否具有抑制性或非抑制性。请点击此处查看该图的放大版本。
在有效的检测运行中，溶剂对照组（SC）的 ΔOD21min 信号应与完全抑制的参考条件（6‑PTU，RI‑C8）明显分离。在一个示例数据集（10 次独立运行）中，每块板包含 n = 9 个技术重复的 SC 和完全抑制参考条件（10−3 M 的 6‑PTU）。在不同板之间，板平均 SC 的 ΔOD21min 值范围为 1.383 至 1.819（均值 ± 标准差：1.565 ± 0.114），而被抑制的 6‑PTU 条件下的板平均 ΔOD21min 值范围为 0.258 至 0.771（均值 ± 标准差：0.473 ± 0.087）。本检测中 ΔOD 的计算基于 OD0min 与 OD21min 之间的差值，检测有效性通常由 z′‑因子阈值 >0.5 来支持。
在10次独立的检测运行中，6-PTU产生了呈S形的浓度-反应曲线，其IC50值范围为1.20E-06 M至5.02E-06 M（均值±标准差：2.74E-06 M ± 1.13E-06 M）。参考范围为1.00E-06至1.00E-05的IC50值的可接受标准基于既往验证研究的数据。然而，IC50值受所用特定微粒体批次的显著影响，可能表现出较大变异性。尽管如此，这些变异预计仍会保持在同一数量级内。
可以使用 z′-因子来总结检测的质量，该因子同时反映了信号窗口和对照组的变异性。在所述数据集中，六条参考曲线对应的 z′-因子范围为 0.544 至 0.774（均值 ± 标准差：0.658 ± 0.062），符合通常采用的可接受标准 z′ > 0.5。
在实际操作中，可通过检测背景值的偏差和/或未达到预设的可接受标准来识别不理想的实验运行。例如，当纯双蒸水空白对照在 Sandell-Kolthoff 反应中显示 ΔOD > 0.3 时，提示背景过高，需进行调查（如试剂污染或水质问题）。此类背景升高会降低检测的动态范围，并增加对照组的变异性，从而导致无法满足可接受标准，包括 z′‑因子低于 0.5。出现明显技术性干扰（如沉淀或异常变色）的孔将作为异常值被排除在评估之外。通过箱线图异常值检验确定的异常值也予以排除。若在剔除异常值后仍未能满足可接受标准，则该次检测运行被视为无效，必须重复实验。
| 试剂/缓冲液 | 配制信息 |
| 酸性硫酸铈铵溶液（40 mM (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O, 0.5 M H2SO4）（250 mL） | 将6.32 g (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O和125 mL去离子水加入250 mL容量瓶中，再加入125 mL 1 M H2SO4，定容至250 mL。室温保存，最长6个月。 |
| DTT（1 M分装液） | 将已配制或购买的1 M DTT水溶液分装至1.5 mL微量离心管中，每管0.5 mL，-20°C保存，最长6个月。 |
| HEPES（50 mM）/ EDTA（2.16 mM）缓冲液（pH 7.0） | 使用250 mL容量瓶，加入12.5 mL 1 M HEPES溶液、201 mg乙二胺四乙酸（EDTA），用去离子水定容至250 mL。4°C保存，最长3个月。 |
| rT3溶液（“底物混合管”） | 将rT3溶于DMSO中，终浓度为6 mM，分装至15 mL离心管中，每份10 μL，-20°C保存，最长6个月。 |
| 亚砷酸钠溶液（25 mM NaAsO2, 0.8 M NaCl, 0.5 M H2SO4）（250 mL） | 将0.81 g NaAsO2、11.7 g NaCl和125 mL去离子水加入250 mL容量瓶中，再加入125 mL 1 M H2SO4，定容至250 mL。室温保存，最长6个月。 |
表1：缓冲液和试剂的配制。 本表详细列出了DIO1 SK测定中所用全部缓冲液和储存液的配制步骤及保存说明，包括HEPES/EDTA缓冲液、DTT、rT3溶液、酸性硫酸铈铵溶液和亚砷酸钠溶液。
| 参照物稀释液名称 | 参照物稀释液浓度 [M] | 10% DMSO [µL] | 参照物 | 检测中参照物的终浓度 [M] |
| RI-C8 | 1.00E-02 | 450 | 50 µL 的 10-1 M 参照物储备液 | 1.00E-03 |
| RI-C7 | 1.00E-03 | 450 | 50 µL 的 RI-C8 | 1.00E-04 |
| RI-C6 | 1.00E-04 | 450 | 50 µL 的 RI-C7 | 1.00E-05 |
| RI-C5 | 3.16E-05 | 342 | 158 µL 的 RI-C6 | 3.16E-06 |
| RI-C4 | 1.00E-05 | 450 | 50 µL 的 RI-C6 | 1.00E-06 |
| RI-C3 | 3.16E-06 | 450 | 50 µL 的 RI-C5 | 3.16E-07 |
| RI-C2 | 1.00E-06 | 450 | 50 µL 的 RI-C4 | 1.00E-07 |
| RI-C1 | 1.00E-07 | 450 | 50 µL 的 RI-C2 | 1.00E-08 |
表2：参照物稀释液的制备。 本表总结了参照物（6-PTU）系列稀释液的制备方法，包括浓度、DMSO体积以及在检测中使用的终浓度。
| 每孔微粒体含量 [µg] | 二水 [µL] | 微粒体稀释液 [µL] | 测定中最终酶浓度 [µg/mL] |
| 20 | 780 | 20 µL 的 20 mg/mL 微粒体储备溶液 | 200 |
| 10 | 400 | 每孔含 20 µg 微粒体的稀释液 400 µL | 100 |
| 5 | 400 | 每孔含 10 µg 微粒体的稀释液 400 µL | 50 |
| 2.5 | 400 | 每孔含 5 µg 微粒体的稀释液 400 µL | 25 |
| 1.25 | 400 | 每孔含 2.5 µg 微粒体的稀释液 400 µL | 12.5 |
| 0.68 | 400 | 每孔含 1.25 µg 微粒体的稀释液 400 µL | 6.8 |
表3：微粒体稀释液的配制。 本表提供了每孔微粒体蛋白的稀释方案，包括为达到检测所需的最终微粒体蛋白浓度所需添加的双蒸水体积和微粒体储备液体积。
| 接受标准 | 建议的截断值 |
| 数值型 | |
| 参比品的 IC50 [M] | 1*10-05 - 1*10-06 |
| 参比品 log IC50 估计值的变异系数 [%] | < 3 |
| IRA 阴性对照 [%] | 80 - 120 |
| IRA 阳性对照 [%] | < 20 |
| z’-因子 | > 0.5 |
| 二值型 | |
| 参比品的曲线形状（是否呈S形？） | 是 |
| 参比品的最终浓度-反应曲线由三个重复实验中至少六个浓度点组成 | 是 |
| 测试品的最终浓度-反应曲线由三个重复实验中至少六个浓度点组成 | 是 |
表4：DIO1 SK 检测的可接受标准。本表列出了检测有效性的可接受标准，包括 IC₅₀ 范围、变异系数、对照组的 IRA 值、z' 因子以及浓度-反应曲线的要求。这些可接受范围源自先前报道的 DIO1‑SK 验证研究6，其中包括基于五次独立实验的重复性评估，该评估为参考 IC₅₀ 范围提供了依据。在一组包含10次独立实验的示例数据中，z′ 因子的表现范围为 0.544 至 0.774（均值 ± 标准差：0.658 ± 0.062），支持了本研究中所采用的 z′ 可接受阈值。
| 分类（按功效） | 子分类（按效力） | 抑制活性 | 阈值 |
| 类别 1：完全抑制剂 | A：强效完全抑制剂 | 在与参考物质 6-PTU 相当的浓度下完全抑制 DIO1 活性 | 最大抑制率大于 90%，且 IC50 等于或低于 6-PTU 的 IC50 上限范围 |
| B：弱效完全抑制剂 | 在高于参考物质 6-PTU 的浓度下完全抑制 DIO1 活性 | 最大抑制率大于 90%，且 IC50 高于 6-PTU 的 IC50 上限范围 | |
| 类别 2：部分抑制剂 | — | 未达到完全抑制，但高于阴性对照和溶剂对照 | 最大抑制率介于 25% 至 90% 之间 |
| 类别 3：非抑制剂 | — | 不抑制 DIO1 活性（与阴性对照和溶剂对照相同） | 最大抑制率低于 25% |
表5：根据DIO1抑制效价和功效对测试物品进行分类。 根据测试物品对DIO1活性的最大抑制程度，将其分为三类功效组（完全抑制剂、部分抑制剂或非抑制剂）。完全抑制剂进一步根据其效价进行亚分类，依据是其IC₅₀相对于参考物品6-PTU的数值。
讨论
DIO1-SK 检测法为评估 DIO1 活性提供了一种非放射性、成本效益高且可扩展的替代方法，可取代传统的放射性标记检测或质谱法。该方法已针对人肝微粒体完成预验证，并且与固相萃取-液相色谱-串联质谱（SPE-LC-MS/MS）测定的甲状腺激素水平结果高度一致，证实了其可靠性和监管适用性，这一点也体现在其已被纳入 OECD 测试指南工作计划中。由于 Sandell-Kolthoff（SK）反应操作简便，即使不具备先进仪器设备的实验室也可开展该检测。
本方案相较于先前发表的DIO1-SK方法，对若干实际操作细节进行了更详细的说明，以进一步支持在常规96孔板格式下的稳健性和可重复性。这些说明重点包括对照设计的原理（溶剂对照、阴性对照和阳性对照）、采用新制备的离子交换树脂板而非重复使用先前制备的树脂板的原因，以及优化的SK反应条件，后者提高了多孔板检测中的操作稳健性，同时保持了与以往标准化研究一致的生物学解释6,7。
尽管该方法具有诸多优势，但在准确量化DIO1介导rT3转化为T2过程中释放的碘离子时，仍需严格把控若干关键步骤。这一检测通过Sandell-Kolthoff反应实现，该反应要求精确的时间控制和一致的试剂操作，以确保结果的可重复性。SK反应是一种快速的催化过程，其中碘离子可加速亚砷酸盐将黄色的铈（IV）还原为无色的铈（III）；颜色变化的速率与碘离子浓度成正比。由于在加入砷溶液后反应迅速进行，因此必须立即开始测定。在96孔板体系中，若砷溶液的添加速度缓慢或不一致，将导致各孔之间产生显著的变异。因此，强烈建议使用多通道移液器或自动化分液装置，以确保所有孔中试剂的均匀且快速添加。
为了最大限度地提高不同孔之间以及不同板之间的可比性，SK反应中的试剂添加顺序应与所述工作流程保持一致：铈作为显色底物存在，反应通过添加亚砷酸盐启动，后者定义了反应起始时间，因此需要快速且同步的加样操作。本实验体系未评估其他试剂添加顺序，因此在重复本方案时，不建议更改添加顺序。此外，铈的浓度可能影响SK检测的实际性能特征（例如信号窗口和稳健性）。尽管在早期检测标准化过程中已确定25 mM铈为经过验证的标准条件，但已有先前研究6表明，更高浓度（如40 mM）可扩大信号窗口并提高z′-因子，同时不影响IC50值或生物学解释。在本方案中，采用40 mM铈以确保在检测条件下碘离子能够完全且迅速地形成复合物，并提升常规基于微孔板检测的稳健性和信号稳定性。验收标准（如z′-因子、参考抑制剂的IC50值）基于既往验证研究中观察到的历史性能数据，旨在作为常规检测性能的核查依据。
使用人肝微粒体引入了生物学变异性，因此必须对微粒体批次特异性的碘离子释放活性进行标准化。需要仔细制备填充离子交换树脂的过滤板，以避免树脂在过滤板上分布不均，并确保将碘离子与可能的干扰物质完全分离。在树脂操作流程方面，选择新鲜制备填充离子交换树脂的过滤板，以最大程度降低因树脂饱和、碘离子或蛋白残留以及重复使用导致结合效率下降而带来的额外变异风险。尽管从技术上讲重复使用树脂和过滤板是可行的，但本研究未系统评估其潜在风险。若树脂的结合能力下降，或前次运行后树脂床中残留基质成分，则重复使用可能导致批间漂移。对于考虑回收使用的实验室，建议在重复使用后验证树脂性能（例如通过监测背景值和标准曲线表现，并确保碘离子捕获的一致性），一旦观察到背景升高、动态范围缩小或分离效果不稳定，应停止重复使用。建议采用一次性使用的树脂填充过滤板，因为本实验方案正是基于该方法学专门建立的。
此外，必须在适当的溶剂中测定每种受试物的溶解度，因为所测试的最大浓度受溶解度限制（通常在1% DMSO条件下最高为1 mM）。由于所有受试化合物均以DMSO作为溶剂进行施加，溶剂对照组可定义在与检测相关的条件下DIO1的基础活性，并作为归一化和比较的最合适参照条件。相比之下，硫代-β-D-葡萄糖钠盐被用作阴性对照，因其在结构上与阳性对照物金硫葡萄糖（ATG）相似，但在碘甲状腺原氨酸脱碘反应中无化学活性，且不会干扰微粒体氧化还原系统或DIO1的催化活性。加入该对照有助于区分由化合物添加、操作或检测基质相互作用引起的非特异性效应与真正的DIO1特异性效应。未采用无处理/无溶剂对照作为主要参照条件，因为其无法反映实际检测环境中所有含化合物孔中均存在DMSO的情况；因此，溶剂对照才是检测结果解读的相关基线。
故障排除的重点是识别SK反应中的干扰物质。含碘、螯合或强氧化性物质可能会人为影响比色读数14,17,18为解决这一问题，本方案包含不使用微粒体的干扰测试。此外，使用二硫苏糖醇（DTT）作为辅因子也可能导致某些受试物质发生非酶促的碘离子释放。在此类情况下，建议采用SPE-LC-MS/MS等正交方法来确认DIO1抑制作用。通过非特异性变性效应（如表面活性剂）引起的非特异性干扰可能导致假阳性结果，因此应采用识别常见干扰物的一般性策略，使用 计算机模拟 工具或整合性测试方法可能具有重要价值。
该检测方法存在若干局限性。它容易受到测试物质的干扰，这些物质可能与检测试剂组分发生反应，或在不依赖DIO1活性的情况下释放碘离子。该检测方法无法区分对DIO1的特异性抑制与对酶功能或结构完整性的非特异性干扰。为提高特异性，可平行分析其他微粒体酶的抑制情况，通过比较不同酶活性检测中的抑制效力，可能获得进一步的证据。
识别潜在干扰物的另一种策略是纳入完整性或活性检测，这在基于细胞的体外（in vitro）检测中常用于确定最高测试浓度。尽管目前尚无针对DIO1-SK检测的直接完整性测试方法，但将其纳入体外（in vitro）测试组合中，可整合来自其他基于细胞检测的细胞毒性数据，以指导浓度选择。若无法获得此类跨检测信息，则DIO1-SK检测中的最高浓度受限于溶解度，这可能无法反映体内实际暴露水平。然而，可采用毒代动力学方法更准确地界定和解释体外测试浓度。
DIO1-SK 检测在内分泌干扰物的毒理学筛选和作用机制研究中具有重要价值。该检测针对甲状腺激素稳态中的一个关键事件，可整合到in vitro（体外）测试组合中。其稳健性、可重复性以及对不同实验条件和通量需求的适应性，使其成为化学品安全性评价和法规验证的有力工具。该检测在标准化条件下可提供可靠的in vitro（体外）DIO1抑制测量结果，并支持将受试物质与特征明确的参考抑制剂（6-PTU）进行分类比较。然而，目前关于in vivo（体内）DIO1抑制的数据十分有限，因此尚无法将in vitro（体外）DIO1抑制结果与in vivo（体内）效应直接关联，以评估其in vivo（体内）预测能力。因此，检测结果应被解读为对甲状腺激素代谢中某一关键事件产生干扰的机制性证据，并需结合其他证据线（例如其他甲状腺作用模式检测和必要时的正交测量）进行综合分析。重要的是，DIO1–SK 检测已在多项以验证为目标的研究中得到评估（包括方法优化/标准化、预测性评估以及稳健性/准确性分析）6,7,15，随着该方法逐步推进至经合组织（OECD）的采纳实施，本文提供了详细的分步操作说明，旨在促进该方法在更多实验室间的顺利转移和一致执行。
披露
作者 K.S.、N.H.、D.F.-W. 和 R.L. 为化工公司巴斯夫股份公司（BASF SE）的员工，该公司今后可能利用 DIO1 检测方法开发并注册商业产品。
致谢
作者感谢 Andreas Weber 博士在 DIO1-SK 检测方法初期建立过程中所做的工作。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-硫代-β-D-葡萄糖钠盐 | Sigma-Aldrich | T6375-1G | CAS 10593-29-0 |
| 3,3’,5’-三碘甲腺原氨酸 (rT3) | Santa Cruz Biotechnology | sc-209692 | CAS 5817-39-0 |
| 6-丙基-2-硫尿嘧啶 (6PTU) | Supelco | P3755-10G | CAS 51-52-5 |
| 乙酸 | Thermo Fisher | 9526-33 | CAS 64-19-7 |
| 分析天平 | NA | NA | 可精确称量至30 g，读数精度为0.1 mg |
| 亚砷酸钠 (NaAsO2) | Thermo Fisher | 041533.AP | CAS 7784-46-5 |
| 检测板（96孔板格式） | Merck | Z707902-108EA | 例如组织培养板，96孔，平底，聚苯乙烯，0.34 cm²，无菌，108/箱，TPP |
| 金硫葡萄糖 (ATG) | Sigma-Aldrich | A0606-5MG | CAS 12192-57-3 |
| 离心管 15 和 50 mL | Merck | Z707724-800EA, Z707716-320EA | 例如 TPP 离心管，体积 15 和 50 mL，聚丙烯 |
| 配备摆动转子的离心机，适用于微孔板 | NA | NA | 高度应足以容纳一个96深孔板并叠加一个96孔滤板（至少约6 cm高） |
| 硫酸铈铵 (Ce(NH4)4(SO4)4) | Sigma-Aldrich | 22269-100G-F | CAS 10378-47-9 |
| CO2 培养箱 | NA | NA | 可维持 37°C 温度、5% CO2 及 ≥90% 湿度 |
| 深孔板（96孔板格式） | Supelco | 575653-U | 例如 SPE 96-深孔方孔收集板，每孔体积 2 mL，聚丙烯材质 |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | AppliChem | A3672,0250 | CAS 67-68-5 |
| 二硫苏糖醇 (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779-1G | CAS 3483-12-3 |
| 乙二胺四乙酸 (EDTA) | Sigma-Aldrich | APO456787707-500G | CAS 6381-92-6 |
| 滤板（96孔板格式） | Merck | WHA77002810 | 例如 Micro-Plates，96孔，透明聚苯乙烯，800 µL，DNA 结合，Whatman |
| 气密性板封膜 | Thermo Fisher | 232698 | 例如密封胶带，聚酯材质，无菌，Nunc |
| HEPES | Pan Biotech | P05-01100 | CAS 7365-45-9 |
| 人肝微粒体 | Biovit | X008070 | 例如 INVITROCYP 150-供体混合人肝微粒体 |
| 碘离子（离子色谱标准品） | Supelco | 41271-100ML | 例如用于离子色谱的碘离子标准品，1000 mg/L 水溶液，Sigma-Aldrich |
| 离子交换树脂（如 Dowex 50WX2） | Roth | 334.4 | CAS 12612-37-2；目数 100-200 |
| 微量离心管 1.5 mL | Merck | EP0030120086-1PAK | 例如 Eppendorf® Safe-Lock 微量离心管，体积 1.5 mL，本色 |
| 可每步分配 50 至 300 µL 的多通道分配器 | NA | NA | NA |
| 可每步分配 10 至 100 µL 的多通道移液器 | NA | NA | NA |
| 配备电极和校准缓冲液的 pH 计 | NA | NA | 可读取 ±0.1 pH 单位 |
| 用于吸光度测定的光度计 | Tecan Trading AG | NA | 例如 Sunrise 吸光度读数仪，INSTSUN-3 |
| 可分配 1 至 10 µL 的移液器 | NA | NA | NA |
| 可分配 10 至 100 µL 的移液器 | NA | NA | NA |
| 可分配 100 至 1000 µL 的移液器 | NA | NA | NA |
| 用于较大体积的移液器 | NA | NA | 血清移液管，例如 10、25、50 mL |
| 板式振荡器 | Thermo Fisher | NA | 例如 Thermo Scientific H+P MONOSHAKE VORTEXER 微孔板振荡器，直接控制 |
| 重复移液器 | NA | NA | NA |
| 氯化钠 (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-25G | CAS: 7647-14-5，例如氯化钠，ACS 级试剂，≥99.0 % |
| 统计分析软件 | NA | NA | 能够进行反映检测特性的回归分析，并可计算抑制浓度，例如 GraphPad Prism 8，GraphPad |
| 硫酸 (H2SO4) | Supelco | 1007311000 | CAS 7664-93-9 |
| 容量瓶 | NA | NA | 经认证具有确定体积 |
参考文献
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