LINC00426 在2型糖尿病及糖尿病肾病中的诊断价值及其对肾细胞的调控作用

摘要

LINC00426 的下调通过诱导肾细胞凋亡和加剧炎症反应，促进糖尿病肾病（DKD）的进展。

摘要

本研究探讨了LINC00426在2型糖尿病（T2DM）和糖尿病肾病（DKD）中的诊断价值及其对肾细胞的调控作用。研究共纳入280例T2DM患者（其中DKD患者146例）和同期就诊的186例健康对照者。通过逆转录定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）证实，血清LINC00426在T2DM和DKD患者中呈下调表达。采用受试者工作特征曲线（ROC）分析评估LINC00426对T2DM和DKD的诊断价值，并通过多因素logistic回归分析识别DKD的独立危险因素。结果显示，LINC00426对两种疾病均具有诊断价值，且其表达水平与尿白蛋白/肌酐比值（UACR）呈负相关。LINC00426的下调可独立预测DKD的发生。高糖（HG）环境可抑制HK-2和HGMC细胞中LINC00426的表达。CCK8实验、流式细胞术和酶联免疫吸附测定（ELISA）结果表明，高糖环境还可抑制细胞增殖，同时促进细胞凋亡和炎症反应。相反，LINC00426的过表达可增强HK-2和HGMC细胞的增殖能力，抑制细胞凋亡，并减轻炎症反应。LINC00426的下调可能通过抑制肾细胞（HK-2和HGMC）增殖并促进细胞凋亡及炎症反应，从而加剧DKD的进展。

引言

2型糖尿病（T2DM）是一种慢性代谢性疾病¹。研究表明，T2DM及其并发症已成为全球重要的公共卫生问题^2,3，对人类健康和社会发展构成严重威胁。由于长期形成的不健康生活方式习惯⁴，T2DM的患病率逐年上升⁵。糖尿病肾病（DN）于2007年被重新命名为糖尿病肾病（DKD）^6,7。作为T2DM的常见并发症⁸，DKD在糖尿病患者中的发病率和死亡率持续逐年升高⁹。DKD在病程较长的糖尿病患者中常呈隐匿性发展¹⁰，或突然显现¹¹。DKD可导致肾功能障碍和内皮损伤^12,13。DKD主要表现为肾脏滤过系统受损后，大分子物质（如蛋白质）经尿液丢失¹⁴。然而，对于患者而言，血液生化指标（空腹血糖、胰岛素）仍是诊断T2DM的金标准，但DKD却难以被及时发现。传统的治疗方法无法及时识别或评估DKD的进展¹⁵。因此，提高对疾病的认知，并发现新的诊断生物标志物，对于T2DM和DKD的预防与治疗至关重要。

近年来，长链非编码RNA（lncRNA）在免疫¹⁶、癌症调控和代谢等多种功能中的作用日益受到关注¹⁷。越来越多的证据表明，lncRNA表达失调参与了包括糖尿病肾病（DKD）在内的复杂慢性疾病的发病机制^18,19。例如，Zhang等²⁰通过高通量测序发现，lncRNA evf-2可与hnRNP相互作用，通过增强细胞周期相关基因和炎症因子的表达促进DKD的发展。在DKD大鼠模型中，发现lncRNA USR0000B2476D参与免疫调控²¹。LINC00426是一种新发现的lncRNA，在炎症因子的调控中发挥重要作用²²。近期的比较微阵列研究表明，LINC00426可能作为2型糖尿病（T2DM）发展的潜在生物标志物²³。此外，生物信息学分析策略揭示LINC00426在肾细胞癌的免疫调控中亦有参与²⁴。大量研究还强调了炎症在糖尿病及DKD中的关键作用²⁵。已有研究表明，T2DM²⁶以及与前驱糖尿病相关的疾病状态²⁷，包括代谢综合征²⁸、肥胖²⁹和心血管代谢性心脏病³⁰，均与高水平的炎症负荷相关。此外，糖尿病微血管并发症，如神经病变³¹、肾病³²和视网膜病变³³，以及大血管并发症³⁴，均为慢性炎症反应。因此，研究LINC00426与T2DM及DKD之间的关系，对于发现新的诊断标志物并揭示DKD的发病机制具有重要意义。然而，目前关于LINC00426在T2DM和DKD中作用的研究仍较为有限，尚无临床证据阐明其在DKD患者中的表达模式、独立风险价值及诊断效能。

为填补这一研究空白，本研究纳入了466名受试者，通过RT-qPCR检测血清LINC00426的表达水平，采用逻辑回归分析识别DKD的独立危险因素，并进一步通过ROC分析评估LINC00426对T2DM和DKD的诊断价值。研究结果初步阐明了LINC00426在DKD中的表达特征及其临床意义，从而填补了现有知识空白，为DKD的发病机制研究及生物标志物探索提供了新的思路。

方案

本研究已获得中南大学湘雅三医院医学伦理委员会的批准。所有患者及其家属均表示支持，并签署了书面知情同意书。

样本采集
样本量使用 G*Power 软件进行计算。显著性水平（α）设定为 0.05，统计功效（1-β）为 0.8，效应量（f）为 0.25，并考虑了 10% 的脱落率。计算结果显示，在研究对照组、2 型糖尿病（T2DM）组和糖尿病肾病（DKD）组人群时，每组至少需要 123 名受试者。在实际研究中，对照组纳入 186 名受试者，T2DM 组纳入 134 名患者，DKD 组纳入 146 名患者。所有受试者均为 2022 年 7 月至 2023 年 6 月期间在中南大学湘雅三医院接受治疗的志愿者。其中，72 名患者无并发症，208 名患者存在一种或多种并发症。并发症主要包括糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病（DKD），其中 146 名患者被诊断为 DKD。糖尿病分型依据空腹胰岛素和空腹血糖水平确定；为避免诊断上的不确定性，排除了 1 型糖尿病患者。妊娠期糖尿病及特殊类型糖尿病病例亦被排除。

纳入标准如下：年龄 ≥ 18 岁；具有完整的医疗记录和相关资料；符合《2020 年中国2型糖尿病防治指南》³⁷。排除标准包括合并精神疾病、认知功能障碍或无法配合研究者；急性感染状态；器官功能衰竭；以及恶性肿瘤。

选取同期接受常规体检的186名健康个体作为对照组。对照组参与者必须满足以下标准：无糖尿病或其他代谢性疾病病史；空腹血糖正常（<6.1 mmol/L）、餐后2小时血糖（<7.8 mmol/L）和糖化血红蛋白（<5.7%）正常；无肾脏疾病或相关并发症病史，且肾功能指标正常（肾小球滤过率、尿白蛋白/肌酐比值）。

糖尿病相关指标检测
每位研究参与者入院时均记录基本人口学信息。次日早晨，采集每位受试者空腹状态下的5 mL静脉血，用于生化指标检测。空腹血糖（FBG）水平使用血糖仪进行分析³⁵。糖化血红蛋白（HbA1c）采用全自动HbA1c分析仪测定³⁶。在纳入研究后的24小时内收集尿液样本。尿白蛋白浓度通过免疫比浊法³⁸，使用蛋白分析仪进行测定³⁷。糖尿病肾病（DKD）患者的肾功能损害程度通过尿白蛋白与肌酐比值（UACR）进行评估，该指标是评估DKD早期肾损伤及疾病进展的公认指标^3,39。

细胞培养与处理
购得人肾小管上皮细胞HK-2和肾小球系膜细胞HGMC。具体而言，HK-2细胞在含有10%胎牛血清并添加1%抗生素溶液的K-SFM培养基中培养；HGMC细胞则在原代细胞完全培养基中培养。细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中维持培养。当细胞融合度超过70%时进行传代和转染操作。为建立高糖（HG）诱导模型，将细胞接种于6孔板中，每孔加入2 mL培养基，其中含30 mM D-葡萄糖，处理48小时（HK-2⁴⁰ 和 HGMC细胞⁴¹）。低糖对照组则使用5.5 mM D-葡萄糖加24.5 mM甘露醇处理。

将LINC00426的全长序列克隆至真核表达质粒pcDNA3.1中，构建pcDNA3.1 LINC00426过表达质粒。空pcDNA3.1载体作为阴性对照。细胞转染采用Lipofectamine 3000试剂，按照制造商说明书进行。简言之，将高糖诱导的HK-2和HGMC细胞接种于6孔板中，在细胞融合度达到70%–80%时进行转染。每孔中，将2.5 µg质粒DNA（pcDNA3.1或pcDNA3.1 LINC00426）与5 µL Lipofectamine 3000试剂在250 µL Opti-MEM培养基中室温混合孵育15分钟，参照既往研究¹⁰。随后将转染复合物逐滴加入含完全培养基的细胞中。在37 °C孵育6小时后，更换为新鲜培养基，继续培养42小时后进行后续实验。

总RNA提取与逆转录
剩余血液在3000 × g 条件下再次离心15分钟，收集上清液并储存在-80 °C。采用Trizol-酚-氯仿法从血清和细胞样本中提取总RNA，并根据先前研究⁴²使用等体积乙醇进行沉淀。使用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。利用RT试剂混合物通过基因PCR扩增仪将总RNA反转录为cDNA。反应条件为42 °C孵育15分钟，随后85 °C持续5秒。样本短暂保存于4 °C。

反转录定量实时聚合酶链式反应（RT-qPCR）
使用 SYBR qPCR 预混液进行 RT-qPCR 检测。通过定量 PCR 仪器对血清中 LINC00426 的表达水平进行定量。以 β-微管蛋白（β-tubulin）作为内参基因，采用 2^−ΔΔCt 法对数据进行归一化处理。β-tubulin 的平均 Ct 值约为 25，在所有血清样本中的范围为 23 至 27，Ct 值的变异系数（CV）为 2.5%。单因素方差分析（One-way ANOVA）结果显示，对照组、2 型糖尿病（T2DM）组和糖尿病肾病（DKD）组之间的 β-tubulin Ct 值无显著差异，表明其表达稳定，适合作为血清 LINC00426 表达量归一化的内参基因。反应所用引物列于补充表 1中。反应条件：95 °C 预变性 10 分钟；95 °C 变性 10 秒、60 °C 退火延伸 30 秒，共 40 个循环；最后在 60 °C 延伸 15 秒。

Western印迹分析
Western印迹分析按照我们既定的实验方案进行。简言之，细胞用含有1%蛋白酶抑制剂混合液的RIPA裂解缓冲液裂解。室温孵育30分钟后，进行蛋白质定量。蛋白样品在95 °C下变性，取等量30 µg蛋白进行SDS-PAGE分离，随后电转至0.45 µm PVDF膜上。膜在室温下用脱脂牛奶封闭2小时。针对Bax、Bcl-2、Caspase-3、IκBα和p-P65的一抗以1:1000比例用TBST稀释，β-actin一抗则以1:3000比例稀释。膜于4 °C与一抗孵育过夜。随后，膜在室温下与相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1小时。使用ECL底物在凝胶成像系统上显影蛋白条带。条带灰度值使用ImageJ软件进行定量分析。

细胞计数试剂盒-8（CCK8）
用0.25%胰蛋白酶（无EDTA）消化转染后的细胞约3分钟，然后以800 × g 离心5分钟。收集细胞沉淀，重悬于细胞培养基中。将100 µL细胞悬液（含2 × 10³个细胞）接种至96孔板中。在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时，使细胞贴壁后，加入10 µL CCK8溶液。将首次加入CCK8溶液的时间点记为0小时。使用酶标仪分别在0、24、48和72小时测定450 nm处的吸光度。

流式细胞术
转染对细胞凋亡的影响通过Annexin V-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）染色液进行评估。转染后，细胞采用与上述相同的胰蛋白酶消化方法进行消化。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞并重悬。通过在800 × g 条件下离心5分钟收集细胞沉淀。取100 µL（约1 × 10⁵ 个细胞）转移至流式细胞术检测管中，在室温下以800 × g 离心5分钟，弃去上清液。将细胞重悬于195 µL Annexin V-FITC结合缓冲液中。向混合液中加入5 µL Annexin V-FITC和10 µL PI染色液，充分混匀。室温避光孵育20分钟。随后将处理后的流式管置于冰浴中临时保存。分析前，将细胞悬液通过200微米孔径滤网过滤并重悬。使用流式细胞仪系统在488 nm/636 nm激发光下采集细胞信号。

酶联免疫吸附测定（ELISA）
使用市售的肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）ELISA试剂盒检测细胞炎症因子。具体检测步骤如下：向标准品孔中加入100 µL适当稀释的标准品溶液；向所有空白孔中加入100 µL细胞基础培养基；向样本孔中加入50 µL细胞上清液和50 µL 1×检测缓冲液。随后，向相应的孔中加入50 µL检测抗体溶液。用封板膜覆盖微孔板，在室温下孵育2小时。弃去孔内液体，用洗涤缓冲液洗涤6次。为获得最佳结果，请确保孔内液体被彻底甩干。再次向每孔中加入100 µL链霉亲和素工作液，密封微孔板，并在室温下孵育45分钟。最后，加入100 µL显色底物溶液，避光孵育20分钟。然后加入100 µL终止液，并轻轻混匀。此时溶液将呈现不同深浅的澄清黄色液体。使用酶标仪在450 nm和630 nm波长下测定溶液的光密度（OD）。这两个数值之差对应于样本中炎症因子的浓度。

统计学分析
数据采用 commercially available 统计软件进行处理和分析。所有实验结果均包含三个有效的重复样本。组间比较采用独立样本 t 检验和方差分析（ANOVA）。多重比较使用 Tukey 法进行。ROC 曲线用于评估 LINC00426 对 2 型糖尿病（T2DM） 和糖尿病肾病（DKD）的诊断价值。Logistic 回归分析用于评估 DKD 的危险因素。P < 0.05 被认为具有统计学意义。

结果

健康个体与2型糖尿病患者基线特征的比较
本研究共招募了280名2型糖尿病（T2DM）患者和186名健康个体作为对照组。对参与者病历资料的分析（见表1）显示，对照组的平均年龄为58.91 ± 17.63岁，T2DM患者的平均年龄为59.50 ± 17.14岁。然而，两组在性别或肥胖比例上均无显著差异。进一步比较发现，与对照组相比，T2DM患者的体重指数（BMI）、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、血压、空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HbA1c）和空腹胰岛素水平均显著升高（P < 0.0001）。T2DM患者的高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平则明显降低。

T2DM 患者中 LINC00426 的表达及其诊断价值
临床分析显示，T2DM 患者血清样本中 LINC00426 的表达水平显著降低（P < 0.0001，图 1A）。ROC 分析表明，LI...

讨论

糖尿病肾病（DKD）是2型糖尿病（T2DM）中一种严重的微血管并发症。其最早的表现为微量白蛋白尿；在早期阶段检测到该异常可能有助于延缓DKD的进展。然而，微量白蛋白尿在常规尿液分析中敏感性不足，因此常被忽视⁴³。本研究发现，LINC00426在T2DM患者中表达下调，对T2DM和DKD均具有诊断价值。此外，LINC00426可能通过减少高糖环境下肾小管上皮细胞的凋亡并降低细胞炎症水平，从而发挥对DKD的保护作用。

本研究结果显示，UACR预测糖尿病肾病（DKD）的AUC为0.917（0.890–0.944），敏感度为81.3%，特异度为87.6%。LINC00426预测DKD的ROC为0.856（0.816–0.895），敏感度为79.59%，特异度为73.66%。既往研究发现，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL）⁴⁴预测DKD的ROC为0.705（0.646–0.765），敏感度为60.4%...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶	Gibco	25200056
Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒	Beyotime	C1062S
细胞培养用抗生素	Gibco	R-015-10
Aristo 特异性蛋白检测仪	GOLDSITE	GPP-100
Bax 抗体	Cell signaling Technology	2772
BCA 蛋白定量检测试剂盒	Beyotime	P0013B
Bcl-2 (124) 小鼠单克隆抗体	Cell signaling Technology	15071
β-肌动蛋白 (13E5) 兔单克隆抗体	Cell signaling Technology	4970
血糖监测仪	Yuwell	710
Caspase-3 抗体	Cell signaling Technology	9662
CCK-8 试剂	Sigma	96992
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711
氯仿	Sigma-Aldrich	C2432
Clarity Western ECL 底物	Bio-Rad	1705061
恒温细胞培养箱	SaiLun	DHP-9032
D-葡萄糖	MedChemExpress	HY-B0389
流式细胞仪	Beckman coulted	CytoFLEX	氯仿
荧光定量 PCR 仪	Roche	Light Cycler 96
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F0193
全自动糖化血红蛋白分析仪	Hanyu medical	HLC-723G11	苯酚
基因 PCR 扩增仪	Bio Rad	S1000
肾小球系膜细胞，HGMC	Sunncell Biotechnology Co., Ltd.	SNP-H252
人基础 IL-1β ELISA 检测试剂盒	Invitrogen	ECH002
人 IL-6 ELISA 检测试剂盒	Invitrogen	EH2IL6
人肾小管上皮细胞，HK-2	Sunncell Biotechnology Co., Ltd.	SNL-165
人 TNF-α ELISA 检测试剂盒	Invitrogen	KAC1751
IκBα (L35A5) 小鼠单克隆抗体	Cell signaling Technology	4814
K-SFM 培养基	Invitrogen	17005-042
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000015
甘露醇	Sigma-Aldrich	M9647
多功能酶联免疫吸附测定仪	TECAN	GENios Plus
NF-κB p65 (D14E12) 兔单克隆抗体	Cell signaling Technology	8242
脱脂奶粉	Biosharp	BS102-500g
Opti-MEM™ I 低血清培养基	Invitrogen	31985062
P3000 试剂	Invitrogen	L3000-015
PBS 缓冲液	Sangon Biotech	E607080
苯酚	Sigma-Aldrich	P1037
磷酸化 NF-κB p65 (Ser536) (93H1) 兔单克隆抗体	Cell signaling Technology	3033
原代细胞完全培养基	Sunncell Biotechnology Co., Ltd.	SNPM-H252
Prime Script RT 试剂盒	Takara	RR037A
PVDF 膜	Merck Millipore	SE1M003M00
蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液	Beyotime	P1045
Trizol	Invitrogen	15596026CN
紫外分光光度计	Thermo	Nanodrop 2000