本方案描述了从类风湿关节炎患者滑膜组织中分离和鉴定高纯度原代成纤维样滑膜细胞（FLS）的方法，用于可靠的疾病建模和药物筛选。
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本方案描述了从类风湿关节炎患者滑膜组织中分离和鉴定高纯度原代成纤维样滑膜细胞（FLS）的方法，用于可靠的疾病建模和药物筛选。
类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性炎症性疾病，其主要病理特征为滑膜增生和进行性关节破坏。成纤维样滑膜细胞（FLS）被认为是RA发病机制中的关键细胞组分，具有侵袭性强、类似肿瘤的行为，介导软骨和骨组织的破坏。分离和纯化类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLS）是研究疾病机制和评估潜在治疗药物的重要工具。本文提供了一套完整的实验方案，用于从接受膝关节置换手术的RA患者中获取的切除滑膜组织样本中分离、培养并进行功能验证的人原代RA-FLS。该方法利用新鲜滑膜组织，采用胰蛋白酶和II型胶原酶依次进行酶消化处理，以最大程度地从组织基质中分离出RA-FLS。最后通过波形蛋白（Vimentin）免疫荧光染色和流式细胞术进行细胞鉴定，并结合TNF-α诱导的增殖功能检测进行补充验证。本方案可获得高纯度、具有特异性表型特征和炎症反应能力的RA-FLS培养物，为研究人员提供一种可靠的方法，以获取适用于药物筛选、机制研究及组织工程应用的短期培养、患者来源的RA-FLS。
类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性炎症性疾病，以四肢关节对称性多关节炎为特征，全球患病率估计为0.5%–1%，并可能引发多种全身性和关节外并发症1,2,3,4,5。RA的核心病理特征是由自身免疫反应介导的慢性滑膜炎，进一步导致侵袭性血管翳组织形成，破坏关节软骨和软骨下骨6,7。其中，滑膜炎是RA最早期且最核心的病理标志。成纤维样滑膜细胞（FLS）作为滑膜组织中的主要常驻细胞，在调控滑膜炎症和骨破坏过程中起关键作用8,9。在RA的滑膜炎症反应中，类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLS）失去正常的"调节性"表型，转而呈现一种"促炎性"特征10。这种转变导致大量炎症细胞因子的产生，可能激活相关能量代谢通路，促进细胞增殖，并进一步放大滑膜炎症级联反应11
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本研究收集了在中国中医科学院中日友好医院接受关节置换手术的类风湿关节炎患者的滑膜组织。所有患者在手术前均签署了书面知情同意书。所收集的信息和生物样本均采取严格措施，以确保患者隐私和数据安全。任何剩余的滑膜组织标本均按照生物安全规定进行处理。本研究中使用类风湿关节炎患者膝关节滑膜组织的方案已获得中日友好医院伦理委员会批准（批准号：2025-KY-223）。所用试剂和设备详见材料表。
1. 滑膜组织的获取与制备
注意：将手术中获取的滑膜组织置于装有0.9%生理盐水或PBS的无菌容器中，以防止从手术室转移至生物安全柜过程中发生污染。使用乙醇浸润后，再用青霉素-链霉素溶液洗涤，是防止细菌或真菌污染的关键步骤，以确保后续实验的成功。
2. 滑膜组织的消化
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通过该方案，我们成功分离并短期培养了患者来源的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLS）。图示为操作流程的示意图（图1）。在光学显微镜下，RA-FLS主要呈现纺锤形和不规则多边形的形态表型。细胞表现出广泛的胞质铺展，并具有细长的突起。在细胞间接触或重叠区域，细胞边界略显模糊。大多数细胞胞质相对透明，具有极性延伸。细胞核主要为椭圆形或细长形，多位于细胞中央或偏心位置（图2A）。
波形蛋白（Vimentin）免疫荧光染色显示，分离获得的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RA-FLS）中超过>98% 呈强阳性表达，且具有特征性的纤维状细胞骨架分布模式（图 2B-D）。流式细胞术分析进一步证实，超过 98% 的细胞同时表达波形蛋白和 CD90，而表达阴性标志物 CD68、CD14 或 CD11b 的细胞比例低于 2%，表明免疫细胞污染可忽略不计.......
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本方案建立了一种可重复的方法，用于从类风湿关节炎（RA）患者中分离并进行类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLS）的短期培养，其成功通过高细胞活力、特征性表型、特异性标志物表达以及对炎症刺激的功能性反应得到证实。
关键步骤与技术注意事项
该方法的可靠性取决于若干关键步骤。首先，新鲜的滑膜组织应在获取后4–6小时内立即进行酶消化处理。尽管组织可暂时在-80 °C保存，但保存时间不宜过长，以确保滑膜细胞的最佳活力31。其次，在初始组织处理过程中，必须仔细去除脂肪组织和骨组织，以防止脂肪细胞和成骨细胞污染，此类污染可能改变后续细胞培养的特性。第三，使用胰蛋白酶和II型胶原酶进行顺序酶消化，对于有效解离组织同时保持细胞活力至关重要。胰蛋白酶主要破坏细胞间连接，而胶原酶则特异性作用于滑膜基质的主要成分——细胞外基质。消化的时间和温度必须严格控制。4小时的胶原酶消化时间已优化至在充分释放细胞的同时将细胞损伤降至最低。消化不足会导致细胞得率低，而过度消化则会损害细胞膜完整性和受体功能，可能影响后续的功.......
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作者声明本研究工作中不存在利益冲突，并确认使用 Figdraw 生成图1符合该平台的许可条款。
本工作得到国家自然科学基金（编号：82074223 和 8207141673）以及中央政府层面重点项目：贵重中药资源可持续利用体系建设（编号：2060302）的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 标记的抗兔 IgG | Zhongshan Jingqiao Biotechnology | ZF-0511 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1X) | Gibco | 25200-072 | |
| 4% 多聚甲醛 | Solarbio | P1110 | |
| Alexa Fluor 674 标记的抗人 CD68 抗体 | biolegend | 562111 | |
| 无动物成分封闭液 | Cell Signaling Technology | 15019 | |
| APC 标记的抗人 CD90 抗体 | biolegend | 559869 | |
| BD FACSDiva 软件 8.0.2 | BD Biosciences | 657925 | |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | 647177 | |
| BV605 标记的抗人 CD11b 抗体 | biolegend | 563015 | |
| CellTiter 96 AQueous 一步法细胞增殖检测试剂（MTS） | Promega | G358A | |
| 胶原酶 II | Solarbio | C8150 | |
| 含 DAPI 的荧光封片剂 | Zhongshan Jingqiao Biotechnology | ZLI-9556 | |
| 含 DAPI 的荧光封片剂 | Zhongshan Jingqiao Biotechnology | ZLI-9556 | |
| 高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM） | HyClone | SH30022.01 | |
| 胎牛血清-超纯级（FBS） | 上海中侨新华生物技术有限公司 | ZQ0500 | |
| FITC 标记的抗人 CD14 抗体 | biolegend | 325604 | |
| PBS, 1× (pH 7.4) 磷酸盐缓冲液 | Servicebio | G4202 | |
| 青霉素-链霉素双抗溶液（100×） | 上海中侨新华生物技术有限公司 | CSP006 | |
| QuickBlock 通用蛋白封闭与抗体稀释缓冲液 | Beyotime | P0270-500ml | |
| 重组人 TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| 转录因子染色缓冲液 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | |
| 胰蛋白酶溶液（无 EDTA） | 北京莱百吉科技有限公司 | BL526A |
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