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从类风湿关节炎患者中分离与鉴定原代成纤维样滑膜细胞

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DOI：

10.3791/70116

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2026年2月24日

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1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

本文内容

摘要

本方案描述了从类风湿关节炎患者滑膜组织中分离和鉴定高纯度原代成纤维样滑膜细胞（FLS）的方法，用于可靠的疾病建模和药物筛选。

摘要

类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性炎症性疾病，其主要病理特征为滑膜增生和进行性关节破坏。成纤维样滑膜细胞（FLS）被认为是RA发病机制中的关键细胞组分，具有侵袭性强、类似肿瘤的行为，介导软骨和骨组织的破坏。分离和纯化类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLS）是研究疾病机制和评估潜在治疗药物的重要工具。本文提供了一套完整的实验方案，用于从接受膝关节置换手术的RA患者中获取的切除滑膜组织样本中分离、培养并进行功能验证的人原代RA-FLS。该方法利用新鲜滑膜组织，采用胰蛋白酶和II型胶原酶依次进行酶消化处理，以最大程度地从组织基质中分离出RA-FLS。最后通过波形蛋白（Vimentin）免疫荧光染色和流式细胞术进行细胞鉴定，并结合TNF-α诱导的增殖功能检测进行补充验证。本方案可获得高纯度、具有特异性表型特征和炎症反应能力的RA-FLS培养物，为研究人员提供一种可靠的方法，以获取适用于药物筛选、机制研究及组织工程应用的短期培养、患者来源的RA-FLS。

引言

类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性炎症性疾病，以四肢关节对称性多关节炎为特征，全球患病率估计为0.5%–1%，并可能引发多种全身性和关节外并发症1,2,3,4,5。RA的核心病理特征是由自身免疫反应介导的慢性滑膜炎，进一步导致侵袭性血管翳组织形成，破坏关节软骨和软骨下骨6,7。其中，滑膜炎是RA最早期且最核心的病理标志。成纤维样滑膜细胞（FLS）作为滑膜组织中的主要常驻细胞，在调控滑膜炎症和骨破坏过程中起关键作用8,9。在RA的滑膜炎症反应中，类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLS）失去正常的"调节性"表型，转而呈现一种"促炎性"特征10。这种转变导致大量炎症细胞因子的产生，可能激活相关能量代谢通路，促进细胞增殖，并进一步放大滑膜炎症级联反应11,12,13。同时，RA-FLS与其他免疫细胞（如巨噬细胞、T细胞和B细胞）相互作用，维持持续的慢性炎症状态14,15。此外，RA-FLS表现出类似癌症的特性，包括迁移能力增强、侵袭性增加、增殖失控以及对凋亡的抵抗，并积极参与软骨和骨破坏过程16。

近年来，FLS 已被广泛应用于 体外 用于研究类风湿关节炎等关节炎症性疾病的模型，这一趋势部分源于当前一线药物治疗方案的局限性17,18,19它们被用于二维培养、三维模型和器官芯片系统中，以研究疾病机制、验证治疗靶点并开展药物筛选。20,21,22,23此外，RAFLS 可作为高级应用的基础，包括用于预测改善病情抗风湿药（DMARDs）反应的患者来源滑膜类器官以及基因编辑 通过 利用CRISPR/Cas9研究RA进展中的基因功能；以及作为工程化功能性滑膜组织移植物的细胞来源24,25,26.

从类风湿关节炎患者滑膜组织中获取短期培养的RA-FLS是许多实验的初始步骤。与FLS细胞系相比，短期培养的、来源于患者的RA-FLS保留了患者间的异质性及疾病特异性特征，能够更真实地反映与疾病相关的转录因子及信号通路调控差异。因此，细胞产量、生长速率和功能表现可能受到患者个体因素（如年龄、病程、用药史和疾病活动度）的影响，导致一定程度的批次间差异。研究人员在使用前应评估组织来源的临床背景，并在早期传代（P3-P7）内开展实验，以维持细胞表型的稳定性。

本研究详细介绍了一种从膝关节滑膜组织中提取和鉴定类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLS）的简化方案。该方法采用连续的酶消化步骤（先使用胰蛋白酶，再使用II型胶原酶）并结合轻柔的机械解离。研究表明，与单酶处理或非顺序混合酶处理相比，此类优化的多步酶解策略通常具有更优的效果，后者可能会影响细胞活力和表型27,28,29,30。相比之下，本方案能够更高效、更温和地分离出高活力、高纯度的RA-FLS，最大限度地减少细胞损伤和表型丢失，确保细胞适用于后续功能实验。

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方案

本研究收集了在中国中医科学院中日友好医院接受关节置换手术的类风湿关节炎患者的滑膜组织。所有患者在手术前均签署了书面知情同意书。所收集的信息和生物样本均采取严格措施，以确保患者隐私和数据安全。任何剩余的滑膜组织标本均按照生物安全规定进行处理。本研究中使用类风湿关节炎患者膝关节滑膜组织的方案已获得中日友好医院伦理委员会批准（批准号：2025-KY-223）。所用试剂和设备详见材料表。

1. 滑膜组织的获取与制备

注意：将手术中获取的滑膜组织置于装有0.9%生理盐水或PBS的无菌容器中，以防止从手术室转移至生物安全柜过程中发生污染。使用乙醇浸润后，再用青霉素-链霉素溶液洗涤，是防止细菌或真菌污染的关键步骤，以确保后续实验的成功。

  1. 将新鲜的滑膜组织浸入含有 PBS 的 50 mL 离心管中，并转移至生物安全柜内。
  2. 将滑膜组织转移至含有 75% 乙醇的培养皿中，浸泡 30 秒以进行消毒。
  3. 使用无菌手术剪和镊子去除滑膜组织中的脂肪和骨组织，然后将剩余组织转移至新的培养皿中。
  4. 用含有 10% 青霉素/链霉素的 PBS 洗涤获得的滑膜组织 3 次。

2. 滑膜组织的消化

注意：使用胰蛋白酶破坏滑膜组织中的细胞连接和细胞外基质，以便后续进行细胞分离。应用II型胶原酶选择性降解细胞外基质结构，促进细胞从基质中解离。所有用于滑膜组织解剖的手术剪、镊子和细胞筛均需在使用前通过高压灭菌法进行灭菌。消化完成后，组织碎片应呈现松散状态，边缘散开，培养基可能略微浑浊。未消化的组织将保持致密且不透明。

  1. 用剪刀将组织反复剪切成约 1 mm × 1 mm 的碎片。
  2. 向组织中加入 0.25% 胰蛋白酶，在 37 °C 恒温摇床（100–150 rpm）或细胞培养箱中消化 30 分钟。
  3. 使用磷酸盐缓冲液（PBS）配制 10% 胎牛血清（FBS）溶液。
  4. 根据组织量将其转移至 15 mL 或 50 mL 离心管中，用含 10% 胎牛血清（FBS）的 PBS 中和并继续消化。
  5. 离心（4 °C，500 × g，5 分钟），弃去上清液，保留沉淀。
  6. 用 PBS 重悬沉淀。
  7. 离心（4 °C，500 × g，5 分钟），弃去上清液，保留沉淀。
  8. 将 100 mg II 型胶原酶加入 50 mL DMEM 培养基中，配制成 2 mg/mL 的 II 型胶原酶溶液。
  9. 将配制好的 II 型胶原酶溶液经 0.22 µm 滤膜过滤以实现灭菌。
  10. 加入 2 mg/mL II 型胶原酶，在 37 °C 恒温摇床（100–150 rpm）或细胞培养箱中消化 4 小时。

3. 成纤维样滑膜细胞的分离与培养

注意：所有细胞培养操作均须在生物安全柜中无菌条件下进行，并佩戴无菌手套以防止污染。

  1. 通过在DMEM基础培养基中添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素，制备完全DMEM培养基。
  2. 将100目细胞筛置于无菌培养皿上，将消化后的滑膜组织和液体倒入筛中。
  3. 将带有残留组织的细胞筛转移至另一无菌培养皿中。
  4. 使用20 mL无菌注射器活塞杆末端在筛网上研磨剩余组织，直至仅剩白色纤维状残余物，且无法再挤出细胞悬液为止。
  5. 用适量的完全DMEM培养基冲洗细胞筛。
  6. 收集所有滤液，离心（4 °C，500 × g，5 min），弃去上清液。
  7. 用PBS重悬沉淀，离心（4 °C，500 × g，5 min），弃去上清液。
  8. 用完全DMEM培养基重悬细胞。
  9. 进行细胞计数，并将细胞转移至培养瓶中。
  10. 将培养瓶置于细胞培养箱中（37 °C，5% CO₂）培养。
  11. 48小时后更换培养基。
  12. 当细胞达到完全汇合时，用胰酶消化并以1:3比例传代。

4. 采用波形蛋白免疫荧光染色鉴定类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLS）

注意：将用于洗涤细胞的 PBS 溶液在 37 °C 水浴中预先温育。本节中所有指定的试剂体积均以 48 孔板规格为标准。若使用其他规格的培养板，应根据生长面积按比例调整体积。

  1. 用胰蛋白酶消化细胞，重悬收获的细胞，并用完全DMEM培养基稀释至 1 × 104 cells/L。
  2. 将RA-FLS以每孔200 µL接种至48孔板中。
  3. 置于细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中，孵育24小时。
  4. 弃去培养基，用预热的PBS洗涤细胞3次。
  5. 加入4%多聚甲醛固定细胞10分钟，弃去固定液，再用PBS洗涤3次。
  6. 每孔加入150 µL含0.1% Triton X-100的PBS溶液。使用前通过涡旋振荡或轻柔颠倒确保充分混匀。
  7. 向各孔加入0.1% Triton X-100溶液，孵育10分钟以通透细胞。
  8. 弃去0.1% Triton X-100溶液，用PBS洗涤3次。
  9. 每孔加入150 µL无动物成分的封闭液，在室温下孵育1小时。
  10. 弃去封闭液，每孔加入150 µL波形蛋白一抗工作液（用抗体稀释液按1:200稀释）。
  11. 在4 °C下与一抗孵育过夜。
  12. 弃去一抗溶液，用PBS洗涤细胞5次。
  13. 每孔加入150 µL Alexa Fluor 488标记的抗兔IgG二抗（用通用抗体稀释液按1:50稀释），在37 °C避光孵育1小时。
  14. 弃去二抗溶液，用PBS洗涤细胞3次。
  15. 每孔加入一滴含DAPI的抗荧光淬灭封片剂，在避光条件下干燥10分钟。
  16. 使用配备20×物镜及适用于DAPI和FITC/GFP的滤光片组的倒置荧光显微镜观察并采集图像。
    注意：PBS洗涤操作为将PBS完全充满各孔，孵育5分钟，然后吸去PBS。此过程定义为一次洗涤循环。

5. 使用流式细胞术定量分析RA-FLS并评估其纯度

注意：使用波形蛋白（Vimentin）和 CD90 作为阳性标志物来鉴定类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLS），同时应用 CD68、CD14 和 CD11b 作为阴性对照，以排除免疫细胞污染。波形蛋白是一种细胞内特异性的中间丝蛋白，主要定位于 RA-FLS 的细胞质中。CD90 作为一种关键的表面标志物，在 RA-FLS 上高表达，可用于将其与免疫细胞区分开来。而 CD68、CD14 和 CD11b 特异性地表达于巨噬细胞、单核细胞和髓系细胞中，因此被用作阴性标志物以排除免疫细胞污染。应根据抗体结合的特异性为细胞表面标志物分配不同的荧光染料，并确保各荧光通道之间无重叠。例如，在本实验中，CD90 和 CD68 使用相同的荧光染料，因此不应将它们加入同一离心管中。在与波形蛋白抗体孵育前，需加入固定剂和通透剂以破坏细胞膜。若流式细胞仪具备足够的荧光通道，可将 CD90 和 CD68 等标志物分配至不同通道，进行多色同步分析，从而进一步提高检测效率和信息量。

  1. 使用无EDTA的胰蛋白酶消化第三代RA-FLS细胞。
  2. 用完全DMEM培养基终止消化，离心（4 °C，500 × g，5 min），弃去上清液。
  3. 用PBS重悬细胞沉淀，进行细胞计数，并用PBS将细胞浓度调整至1 × 10⁶ 个细胞/mL。
  4. 将细胞分装至三个离心管中，每管加入200 µL细胞悬液。
  5. 向1号管中加入CD11b抗体（用通用抗体稀释液按1:100稀释），终体积为100 µL，涡旋混匀。
    1. 室温避光孵育15 min后，向1号管中加入1 mL固定/破膜试剂，涡旋混匀，避光孵育30 min。
    2. 向1号管中加入1 mL固定/破膜缓冲液以终止破膜过程，涡旋混匀，离心（4 °C，500 × g，5 min），弃去上清液。
    3. 配制100 µL波形蛋白（vimentin）和CD68抗体混合液（两种抗体均用通用抗体稀释液按1:100稀释），加入1号管中，涡旋混匀，避光孵育30 min。
    4. 向1号管中加入1 mL固定/破膜缓冲液，涡旋混匀，离心（4 °C，500 × g，5 min），弃去上清液。
    5. 向1号管中加入100 µL Alexa Fluor 488标记的抗兔IgG二抗（用通用抗体稀释液按1:50稀释），涡旋混匀，避光孵育30 min。
    6. 向1号管中加入1 mL缓冲液，涡旋混匀，离心（4 °C，500 × g，5 min），弃去上清液。
    7. 向1号管中加入300 µL缓冲液，涡旋混匀，用于上机样品制备。
  6. 向2号管中加入CD90和CD14抗体（均用通用抗体稀释液按1:100稀释），终体积为100 µL；3号管不加抗体作为阴性对照。
    1. 室温孵育15 min后，向2号和3号管中各加入1 mL PBS。
    2. 将2号和3号管离心（4 °C，500 × g，5 min），弃去上清液，每管加入300 µL缓冲液，涡旋混匀，用于上机样品制备。
  7. 对制备好的样品进行流式细胞术检测。
  8. 使用兼容软件分析流式细胞术数据并进行统计学分析。

6. 使用 MTS 法检测 TNF-α 诱导的类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞增殖

  1. 使用无EDTA的胰蛋白酶消化第三代RA-FLS细胞。
  2. 用完全DMEM培养基终止消化，离心（4 °C，500 × g，5 min），弃去上清液。
  3. 用完全DMEM培养基重悬细胞沉淀，进行细胞计数，并稀释至1 × 10⁵ 个细胞/L。
  4. 将重悬的细胞以每孔100 µL接种至96孔板中。
  5. 将培养板置于细胞培养箱中孵育，待细胞贴壁后，分为空白对照组和干预组。
  6. 向干预组加入10 ng/mL TNF-α，向空白对照组加入等体积的PBS。
  7. 干预24小时后，每孔加入10 µL MTS试剂，继续在细胞培养箱中孵育。
  8. 孵育1小时后，使用酶标仪在490 nm处测定吸光度（OD值）。
  9. 根据各孔的OD值计算细胞增殖活力。

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结果

通过该方案，我们成功分离并短期培养了患者来源的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLS）。图示为操作流程的示意图（图1）。在光学显微镜下，RA-FLS主要呈现纺锤形和不规则多边形的形态表型。细胞表现出广泛的胞质铺展，并具有细长的突起。在细胞间接触或重叠区域，细胞边界略显模糊。大多数细胞胞质相对透明，具有极性延伸。细胞核主要为椭圆形或细长形，多位于细胞中央或偏心位置（图2A）。

波形蛋白（Vimentin）免疫荧光染色显示，分离获得的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RA-FLS）中超过>98% 呈强阳性表达，且具有特征性的纤维状细胞骨架分布模式（图 2B-D）。流式细胞术分析进一步证实，超过 98% 的细胞同时表达波形蛋白和 CD90，而表达阴性标志物 CD68、CD14 或 CD11b 的细胞比例低于 2%，表明免疫细胞污染可忽略不计...

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讨论

本方案建立了一种可重复的方法，用于从类风湿关节炎（RA）患者中分离并进行类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLS）的短期培养，其成功通过高细胞活力、特征性表型、特异性标志物表达以及对炎症刺激的功能性反应得到证实。

关键步骤与技术注意事项
该方法的可靠性取决于若干关键步骤。首先，新鲜的滑膜组织应在获取后4–6小时内立即进行酶消化处理。尽管组织可暂时在-80 °C保存，但保存时间不宜过长，以确保滑膜细胞的最佳活力31。其次，在初始组织处理过程中，必须仔细去除脂肪组织和骨组织，以防止脂肪细胞和成骨细胞污染，此类污染可能改变后续细胞培养的特性。第三，使用胰蛋白酶和II型胶原酶进行顺序酶消化，对于有效解离组织同时保持细胞活力至关重要。胰蛋白酶主要破坏细胞间连接，而胶原酶则特异性作用于滑膜基质的主要成分——细胞外基质。消化的时间和温度必须严格控制。4小时的胶原酶消化时间已优化至在充分释放细胞的同时将细胞损伤降至最低。消化不足会导致细胞得率低，而过度消化则会损害细胞膜完整性和受体功能，可能影响后续的功...

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披露

作者声明本研究工作中不存在利益冲突，并确认使用 Figdraw 生成图1符合该平台的许可条款。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（编号：82074223 和 8207141673）以及中央政府层面重点项目：贵重中药资源可持续利用体系建设（编号：2060302）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 488 标记的抗兔 IgGZhongshan Jingqiao BiotechnologyZF-0511
0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1X)Gibco25200-072
4% 多聚甲醛SolarbioP1110
Alexa Fluor 674 标记的抗人 CD68 抗体biolegend562111
无动物成分封闭液Cell Signaling Technology15019
APC 标记的抗人 CD90 抗体biolegend559869
BD FACSDiva 软件 8.0.2BD Biosciences657925
BD LSRFortessaBD Biosciences647177
BV605 标记的抗人 CD11b 抗体biolegend563015
CellTiter 96 AQueous 一步法细胞增殖检测试剂（MTS）PromegaG358A
胶原酶 IISolarbioC8150
含 DAPI 的荧光封片剂Zhongshan Jingqiao BiotechnologyZLI-9556
含 DAPI 的荧光封片剂Zhongshan Jingqiao BiotechnologyZLI-9556
高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）HyCloneSH30022.01
胎牛血清-超纯级（FBS）上海中侨新华生物技术有限公司ZQ0500
FITC 标记的抗人 CD14 抗体biolegend325604
PBS, 1× (pH 7.4) 磷酸盐缓冲液ServicebioG4202
青霉素-链霉素双抗溶液（100×）上海中侨新华生物技术有限公司CSP006
QuickBlock 通用蛋白封闭与抗体稀释缓冲液BeyotimeP0270-500ml
重组人 TNF-αPeprotech300-01A
转录因子染色缓冲液eBioscience00-5523-00
Triton X-100SolarbioT8200
胰蛋白酶溶液（无 EDTA）北京莱百吉科技有限公司BL526A

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