综述文章

阐明神经发育障碍疾病机制的方法

DOI：

10.3791/70127

⸱

2026年2月6日

 , 
1Department of Neurology, University of Maryland School of Medicine

本文内容

摘要

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针对患有神经发育障碍的个体，目前可用的疾病修饰治疗手段有限，且尚无治愈方法。为应对这一挑战，有必要开展研究以明确疾病机制并发现新的治疗靶点。在本综述中，我们详细介绍了若干在这些研究方向中处于前沿地位的技术方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经发育障碍（NDDs）在全球范围内影响着3.17亿儿童和青少年。尽管NDDs是一组异质性障碍，可影响多个器官系统，但癫痫、自闭症谱系障碍（ASD）和/或智力障碍（ID）是常见的临床表现。遗憾的是，目前针对NDDs的疾病修饰疗法极为有限，尚无治愈手段。然而，近年来基因编辑、细胞/分子检测以及干细胞模型已成为深入理解NDD根本病因、分类遗传变异以及更精确模拟人类疾病过程的有前景的技术。此外，包括基因编辑在内的多项技术已在临床中取得成功。在本综述中，我们详细阐述了若干用于功能性验证遗传变异的新方法、NDDs的干细胞模型以及新型基因编辑策略。理解并应用这些方法对于揭示NDDs新的疾病机制和治疗靶点，以及推动技术方法从实验室向临床转化至关重要。

引言

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神经发育障碍（NDDs）在全球范围内影响着3.17亿儿童和青少年1。这些障碍包括脑性瘫痪、脆性X综合征、Angelman综合征和结节性硬化症复合体等众多疾病。尽管NDDs是一组异质性疾病，可影响多个器官系统，但癫痫、自闭症谱系障碍（ASD）和/或智力障碍（ID）是常见的临床结局2。事实上，一项研究报道，在肯尼亚患有癫痫并伴有认知、视觉、听觉或运动功能障碍的儿童，其死亡率是无NDD群体的3至4倍1。

2003年，随着人类基因组计划的完成，神经发育障碍（NDDs）的研究发生了范式转变3。随后，通过全基因组关联研究（GWAS）定义多基因风险评分，以及2013年《精神障碍诊断与统计手册（第五版）》（DSM-5）对“"神经发育障碍"”的界定，进一步推动了该领域的发展4。尽管在理解NDDs的遗传病因方面已取得实质性进展，但针对特定NDDs的靶向治疗仍寥寥无几，且目前尚无能够改变自闭症谱系障碍（ASD）和/或智力障碍（ID）病程的疾病修饰疗法。

本文综述中描述的基因编辑、电生理学以及细胞/分子检测与方法处于神经发育障碍（NDD）研究的前沿。尽管我们并未详尽涵盖所有检测方法，但这些技术代表了识别疾病修饰疗法的尖端策略。其中一个例子是去泛素化酶（Deubiquitylating enzymes, DUBs），这是一类从蛋白质上移除泛素的酶。由于DUBs内部的突变与NDD相关，靶向其修饰可能成为治疗NDD的潜在策略5,6。此外，研究人员正在深入探究回路水平的通路，例如涉及GABAA受体亚基及其他通道病的通路，以阐明与癫痫、自闭症谱系障碍（ASD）和智力障碍（ID）相关的疾病机制7。另一项突出的技术是CRISPR/Cas基因组编辑（图1），这是一种强大的工具，可用于直接改变基因组，构建新的实验模型，并且最近已被用于治疗罕见遗传病8,9,10。CRISPR工具箱持续扩展，其中四种方法——CRISPRi（CRISPR干扰/抑制）、CRISPRa（CRISPR激活）、先导编辑（prime editing）和碱基编辑（base editing）——已成为具有重要影响的研究与临床创新。最后，本文详细介绍了诱导多能干细胞（iPSCs）应用方面的进展。iPSCs及其衍生的细胞类型使研究人员能够利用患者来源的细胞更准确地模拟多种NDD9,11,12。尤为重要的是，由iPSCs发育而来的类器官使得研究许多NDD背后的发育过程成为可能，其与人类疾病的关联性远高于啮齿类动物模型13,14。

本简要综述详细阐述并拓展了上述介绍的技术。此外，还讨论了若干近期利用这些技术更深入理解神经退行性疾病的研究、当前文献中存在的空白以及未来的研究方向。

综述与观点

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诱导性多能干细胞及相关实验范式

诱导性多能干细胞已成为研究神经发育障碍（NDDs）的有力工具。事实上，在诱导性多能干细胞模型中发生的许多发育过程与人类大脑发育过程中观察到的现象相似，而这些过程在啮齿类动物大脑发育中并不存在15。因此，研究人员将干细胞模型（包括二维培养、类器官和组装体）与其他实验方法相结合，以更深入地理解神经发育障碍中的疾病机制11,13,14,16。

最近，类组装体被用于模拟唐氏综合征（DS）在胎儿发育期间神经发生受损这一关键特征16。研究人员利用DS患者的hiPSCs以及同基因型的正常核型hiPSCs诱导神经发生，并进一步分化为神经元。在培养85天后，通过免疫细胞化学染色和成像技术观察细胞周期。他们发现，DS来源的神经前体细胞无法退出细胞周期，且不能分化为成熟的神经元；同时还发现细胞周期缺陷会改变神经发生阶段，从而导致DS中神经发生受损16。

尽管许多干细胞模型主要关注神经元，但其他细胞类型（包括胶质细胞）在神经发育障碍（NDD）的病理过程中也发挥着重要作用17。最近一项研究聚焦于胶质细胞生成及星形胶质细胞在脆性X综合征（FXS）中的作用。研究人员利用人诱导多能干细胞（hiPSCs）培养星形胶质细胞前体细胞，并将其分化为前脑特异性的星形胶质细胞，这些细胞缺乏脆性X信使核糖核蛋白11。他们发现，这些星形胶质细胞的糖酵解和线粒体代谢出现失调。该研究团队先前的工作还表明，正常线粒体功能对于调控FXS患者来源神经元的动作电位发放至关重要11,18。尽管仍需进一步研究以阐明FXS中星形胶质细胞代谢与神经元放电异常的机制，但这些研究证明，星形胶质细胞既能驱动疾病病理进程，也可作为潜在的治疗靶点。

基因组编辑

弗朗西斯科·莫吉卡（Francisco Mojica）在20世纪90年代初发现了CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列），这是一种原核生物的适应性免疫系统，为基因组编辑奠定了基础19。在此基础上，詹妮弗·杜德纳（Jennifer Doudna）和埃马纽埃尔·沙彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）开创了一种名为CRISPR/Cas9的方法，该方法利用与Cas9核酸酶偶联的CRISPR系统，实现对特定基因的选择性识别和修改20。在最初的CRISPR/Cas9基因编辑研究发表后不久，研究人员便开始改造CRISPR/Cas系统，以揭示新的基因组信息，或以独特方式编辑基因。其中一种新颖的方法是CRISPRi，即一种沉默目标基因的技术21,22。通过使用无催化活性的Cas9核酸酶，并结合crRNA和tracrRNA，可阻断RNA聚合酶对启动子的访问，从而关闭特定基因或一组基因的表达22,23。CRISPRi筛选已被用于鉴定多种神经发育障碍（NDDs）的风险基因，并揭示这些基因功能丧失所导致的功能性变化。例如，最近一项在诱导多能干细胞（iPSC）衍生的类组装体（assembloids）中进行的CRISPRi筛选，检测了425个NDD相关基因对中间神经元发育的影响，发现多个候选基因的缺失会影响细胞骨架和内质网结构24。此外，一项CRISPRi筛选表明， ADNP（一种自闭症谱系障碍风险基因）的缺失会导致小胶质细胞对突触修剪的改变25。因此，CRISPRi筛选揭示了神经发育障碍中多种共同和不同的致病机制。

与CRISPRi互补，CRISPRa是一种用于增强基因表达的工具。该技术将催化失活的Cas9与转录激活因子偶联，并由向导RNA进行靶向。CRISPRa还被用于研究自闭症谱系障碍（ASD）和神经发育障碍（NDD）风险基因的激活如何改变疾病表型。尽管目前利用CRISPRa挽救NDD表型的研究尚少，但CRISPRa可能具有巨大的治疗潜力。例如，最近一项研究表明，激活 ITGB3（其单倍剂量不足与ASD相关）可挽救啮齿类动物中的神经网络功能及ASD表型23。事实上，许多NDD基因变异因单倍剂量不足而导致疾病，这提示CRISPRa有可能通过上调未受影响等位基因的表达，以改变疾病进程的方式发挥治疗作用。

碱基编辑和先导编辑是CRISPR工具箱中用于编辑基因组内特定核苷酸的精确方法。这两种方法均切割DNA的一条链，而不是像CRISPR/Cas9那样造成双链断裂（DSB）10,26。尽管碱基编辑比标准的CRISPR/Cas9编辑更具特异性，但其适应性较低，因此在转化应用方面不如先导编辑广泛。碱基编辑的优势在于能够通过将胞嘧啶替换为胸腺嘧啶或腺嘌呤替换为鸟嘌呤（以及 vice versa）来纠正点突变10。正因如此，碱基编辑可实现的突变类型受到限制。因此，尽管该方法具有实用性，但仅能执行转换突变，无法实现插入或缺失10。然而，先导编辑是一种高度可适应的基因组编辑形式，具有多种潜在应用。先导编辑利用一种先导编辑向导RNA（pegRNA）以及与逆转录酶融合的Cas9切口酶，能够实现单个核苷酸的插入、缺失或替换10。遗憾的是，由于技术更为复杂且可介导较大的基因改变，先导编辑的效率可能低于碱基编辑。因此，这两种方法可作为互补工具，在神经发育障碍的基因组编辑中均具有应用价值。先导编辑已成功用于治疗一名罕见遗传病患者27 ，并在儿童交替性偏瘫的啮齿类动物模型中显示出挽救疾病表型的潜力28。

细胞和分子检测

神经发育障碍（NDDs）由影响细胞功能的遗传变异以不同方式引起29,30,31研究神经发育障碍（NDDs）面临的一个主要挑战是如何确定特定患者的基因变异是否会导致细胞功能的有害改变。因此，迫切需要能够快速、准确地判断特定遗传变异是致病性还是良性变异的检测方法。一种有前景的新检测技术是泛素切割检测法。32去泛素化酶（DUB）是一类能够从蛋白质上移除泛素从而阻止其降解的酶。DUB既可能是神经发育障碍性疾病（NDDs）的潜在治疗靶点，也可能是其致病因素。迄今为止，已发现12种DUB的突变与NDDs存在明确的因果关系，包括郝-喷泉综合征、假TORCH综合征、小头畸形-毛细血管畸形综合征等。5确定特定患者变异是否导致疾病，体外 泛素切割实验已成为测量去泛素化酶（DUB）酶活性的金标准，用于对突变进行功能性验证。该方法可用于评估基因变异对去泛素化酶的影响。最近一项研究聚焦于一种在X连锁智力障碍105型中发生突变的去泛素化酶——泛素特异性蛋白酶27（Ubiquitin Specific Protease 27） (USP27X)研究人员成功展示了一种重组USP27X的表达与纯化方法，以及一种 体外 泛素链切割实验。该方法可用于确定调控神经元中蛋白质 turnover 的酶活性，因此可能对理解突触修剪异常、神经发育关键期以及蛋白质功能的潜在机制具有重要意义32有趣的是，关于去泛素化酶（DUBs）及其在疾病中作用的已发表论文较少，因此该检测方法的全部应用范围仍有待验证，尚需进一步研究探索。

由于许多神经发育障碍（NDD）也被归类为罕见病，临床遗传学在鉴定变异时常常因缺乏针对这些变异的既往发表的临床或功能研究，而将基因改变识别为“意义未明的变异”（VUS）7,33,34。因此，开发能够快速判断VUS是否具有致病性的检测方法，对于明确NDD的遗传病因至关重要。一个典型例子是GABAA 受体的变异。GABAA 受体的遗传变异是遗传性癫痫的主要病因之一，且与多种类型的癫痫发作及发育性癫痫性脑病相关7,35。最近一项研究探讨了GABAA 受体亚基，并尝试通过多模态方法判断这些变异是否在细胞内引起功能改变。 In silico 分析被用于识别VUS，并预测γ2亚基GABAA 受体变异的致病性。随后，研究人员界定了这些变异的分子效应，包括结构、理化和生物物理标志物7。上述各个层面均通过文献分析、 in silico 建模以及膜片钳电生理技术进行定义。在选定参考区域后，采用锥体神经元建模方法来检测GABAA 受体介导的抑制作用的影响。研究发现，两个β3亚基突变（β3N110D和β3T288N）以及两个γ2亚基突变损害了GABA能抑制功能7。该研究方案表明，多模态方法在判断VUS致病性方面通常具有重要价值。尽管该方法通量不高，但对于尚无特异性功能验证检测手段的其他与NDD相关的VUS（例如DUBs）也可能具有应用潜力——特别是当这些变异与电生理改变相关时。

尽管并非一种新颖的方法，膜片钳电生理学仍是研究神经元电学特性的金标准，因此也可用于理解遗传改变如何影响神经元的基本特性。与神经发育障碍（NDDs）相关的是通道病36尽管通道病有多种类型，但其中的变异主要涉及 SCN1A 已被深入研究，是Dravet综合征的主要病因——一种特别严重的发育性癫痫性脑病36功能验证 SCN1A 使用自动化膜片钳与组合方法已实现对变异体的研究 计算机模拟 模拟。利用该方法，研究人员能够解析多个意义未明的变异（VUS），并基于神经元功能变化建立基因型-表型关联。37在另一项采用类似方法的研究中，使用了iPSC模型结合自动膜片钳电生理技术 计算机模拟 用于对T型钙通道基因变异进行分类的模型38. 重点关注 CACNA1G，一种在多种神经元中编码Cav3.1的基因， CACNA1G 被突变以构建 Cav3.1 的 18 种变异体，随后将这些变异体瞬时转染至神经元中。接着进行自动膜片钳记录，随后进行手动膜片钳和计算分析。研究发现，自动膜片钳与手动膜片钳获得的结果相似，且计算方法能够确定特定遗传变异所诱导的功能性改变38尽管计算模型能够相对快速地预测基因变异的功能后果，但电生理学方法仍然耗时较长，且需要高度专业化的技能，这限制了其在验证大量变异时的应用价值。

多电极阵列（MEAs）用于测量小群体细胞周围或大规模细胞网络中的电活动。该方法与膜片钳电生理学不同，前者侧重于多细胞模型，而后者主要针对单一离子通道或单个细胞39,40。因此，MEA能够揭示不同脑区之间的相互作用，并可用于在神经网络尺度上研究疾病。许多研究已采用MEA来探究癫痫和自闭症谱系障碍（ASD）的实验模型14,39。MEA的一个关键特性是能够确定不同类型神经元细胞之间的相互作用方式（例如谷氨酸能神经元、GABA能中间神经元、前体细胞和胶质细胞）14。这使得MEA成为研究脑类组装体（brain assembloids）的优良方法。Pan等人开展的一项研究即利用该方法研究了神经元网络的发育过程。研究人员使用来自包皮成纤维细胞的人多能干细胞（hPSC）14 ，首先通过病毒标记，随后进行培养以生成类组装体。然后将这些类组装体黏附于MEA培养板上并进行记录14。重要的是，由于这些类组装体可稳定存在，并能持续进行记录和药理学实验约50天，因此该实验范式可用于分析治疗与神经发育障碍（NDDs）相关癫痫的潜在药物。事实上，该方法也可用于检测任何已知或怀疑存在神经元网络特性改变的神经发育障碍14。

结论

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神经发育障碍（NDDs）可能是严重的疾病，目前缺乏靶向治疗手段，且尚无治愈方法。事实上，大多数疗法旨在控制疾病症状（例如，用于癫痫的抗癫痫药物）。然而，近年来技术的进步催生了新型基因编辑技术、检测方法以及模型系统，使科学家能够探究 NDDs 的根本病因 （图 1）。本综述详细介绍了当前在探索 NDDs 及相关病理新型治疗方法前沿所采用的一些策略。基因编辑技术将使研究人员能够直接靶向致病突变，从而更深入地理解疾病机制，并有望通过精准基因治疗为患者提供治疗方案。新型检测方法可实现对遗传变异的快速功能分类，而干细胞模型则有助于科学家理解驱动 NDDs 的早期发育机制，并可用于测试新型治疗药物。本综述中详述的技术构成了未来研究的基础，旨在更深入地理解 NDDs 的发病机制，并推动治疗这些疾病的新型临床策略的发展。随着该领域持续发展，未来的研究应将产前检测、胎儿治疗、高内涵成像和药物基因组学等技术与本综述中介绍的方法相结合。

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图1：技术方法主要优势与局限性的总结。 本文详细描述并在配套方法合集中展示的方法已在此汇总。每种技术均列出了其主要优势与一项主要局限性。每种技术的关键参考文献列于“方法”栏下方。请点击此处查看该图的放大版本。

披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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本研究由NIH NINDS RO1NS131223基金资助，受资助者为PHI。 图1 使用BioRender制作。

参考文献

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