利用多普勒超声心动图评估射血分数保留型心力衰竭小鼠模型的冠状动脉血流储备

摘要

本方案描述了一种快速、无创的方法，用于评估射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）小鼠模型中的冠状动脉微血管功能障碍。通过多普勒超声引导定位左冠状动脉，测定冠状动脉血流速度在充血状态与基础状态下的比值，计算冠状动脉血流储备（CFR）。

摘要

射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）由于缺乏有效的治疗方法，且其潜在的病理生理机制尚不明确，已成为重大的全球健康负担和主要的临床挑战。冠状动脉微血管功能障碍（CMD）在HFpEF患者中高度普遍，可引发心肌缺血，进而损害左心室的舒张和收缩功能。鉴于微血管功能障碍是HFpEF的核心特征，CMD目前被认为是其发病机制中的重要因素。冠状动脉血流储备（CFR）定义为最大充血状态下与静息状态下的冠状动脉血流速度之比，是心肌缺血的重要指标。此外，CFR还可作为冠状动脉血管运动功能障碍的综合指标，反映心外膜冠状动脉和微血管共同对心肌灌注产生的血流动力学影响。本方案重点介绍利用多普勒超声心动图评估HFpEF小鼠模型中CFR变化的方法。在本研究中，对照组小鼠 在异氟烷诱导的血管扩张后，冠状动脉峰值血流速度较静息状态 增加 两倍以上 ，而HFpEF小鼠的这一反应则显著减弱。在HFpEF中，降低的CFR可预测不良预后，并反映潜在的微血管功能障碍，因此CFR成为研究疾病进展和指导患者筛选的关键工具。

引言

射血分数保留的心力衰竭（HFpEF）是心力衰竭的主要类型，且与不良预后相关。然而，目前尚无经证实可降低其发病率和死亡率的治疗方法。^1,2. 存在多种风险因素，包括高龄、高血压、糖尿病、血脂异常和肥胖 在……之下；构成……的基础 HFpEF 的复杂性与异质性³近年来，越来越多的证据表明，冠状动脉微血管功能障碍（CMD）是射血分数保留的心力衰竭（HFpEF）的独立且直接的危险因素，而非伴随共病。^4,5,6冠状动脉微血管功能障碍，涉及功能性和结构性异常，是射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）中发生心内膜下缺血、弥漫性间质纤维化和左心室功能障碍的基础。^7,8已针对心肌病在心血管疾病中的病理作用开展了大量研究^9,10一项临床研究表明，微血管功能障碍（以受损的冠状动脉血流储备，CFR为证据） <2.0）与左心室舒张功能恶化直接相关，可能成为射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）的潜在治疗靶点¹¹在保留射血分数的心力衰竭微血管功能障碍患病率（PROMIS-HFpEF）研究中，超声心动图评估显示，根据左冠状动脉血流储备（CFR）测量结果，75%的射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）患者存在冠状动脉微血管功能障碍（CMD）。¹²此外，异常的心肌做功指数（CMD）与不良预后风险增加相关，包括死亡风险显著升高^13,14因此，采用CMD作为 关键生物标志物 在动物模型中极大地促进了对射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）病理生理学的研究，并有助于验证疾病表型的成功复制。

目前，用于评估冠状动脉微血管功能的方法，如正电子发射断层扫描（PET）、心血管磁共振（CMR）、血流储备分数（FFR）和微循环阻力指数（IMR），由于实验动物体型较小且专用成像设备有限，难以应用于啮齿类动物研究。国际指南推荐冠状动脉血流储备（CFR）作为评估冠状动脉生理功能的工具^15,16。此外，CFR 是心肌缺血的可靠标志物、冠状动脉血管功能障碍的评估指标，也是心血管风险的重要预后指标¹⁷。利用多普勒超声心动图评估 CFR 是一种经过验证且可重复的方法，可用于评价临床前啮齿类动物模型中的整体冠状动脉血管功能。尽管既往研究已报道在心肌缺血-再灌注损伤的小鼠/大鼠模型中使用 CFR^18,19，但该方法尚未应用于射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）的动物模型。此外，本研究中描述的 CFR 评估方法——通过彩色多普勒超声心动图快速定位左冠状动脉（LCA）——可推广至多种动物模型，包括糖尿病性心肌病、高血压性心脏病以及慢性炎症或自身免疫性疾病模型。在本研究中，由于小鼠模型不存在心外膜冠状动脉狭窄，冠状动脉血流储备（CFR）的降低主要反映冠状动脉微血管功能障碍，而非心外膜和微血管共同作用的结果。因此，在该 HFpEF 模型中，CFR 可作为冠状动脉微血管功能障碍（CMD）的可靠替代标志物。

方案

所有操作均符合南京鼓楼医院机构伦理委员会批准的方案（批准号：20011141），并遵循《动物研究：In Vivo 实验报告指南》（ARRIVE 指南）²⁰。本研究中，射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）模型建立于6至8周龄的雄性C57BL/6J小鼠（体重，~25 g）中。 实验期间，小鼠饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中，温度控制在（23 ± 1 °C），湿度维持在65%–70%，光照与黑暗周期为12小时交替。 所有动物均可 自由摄食和饮水。实验结束后，小鼠以1.5%异氟烷麻醉，随后通过颈椎脱位法实施安乐死。所用试剂与仪器列于材料表中。

1. 建立射血分数保留型心力衰竭小鼠模型

1. 将小鼠随机分为两组：对照组（CTRL）和射血分数保留的心力衰竭（HFpEF）组，每组八只小鼠。
2. 采用已建立的方案^{21,22,23,24,25}诱导HFpEF小鼠模型，具体如下：
   1. 给予6至8周龄小鼠高脂饮食（HFD，60%脂肪），并在饮水中添加0.5 g/L的N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME），连续处理8周。
      注意：L-NAME饮水需用棕色瓶配制以避免光照，每2–3天更换一次。
3. 对照组小鼠给予相同年龄匹配的正常标准饮食，并提供普通饮水，持续时间与HFpEF组相同。

2. 通过超声心动图评估冠状动脉血流储备

1. 在进行超声心动图评估之前，先对小鼠实施麻醉 通过 在麻醉舱内以100%氧气为气源，以1.5–2.0 L/min的流速给予1.5%气化异氟烷吸入。
   警告：异氟烷是一种挥发性麻醉剂。操作过程中应确保充分通风。向蒸发器中添加液态异氟烷时需佩戴腈类手套，以避免皮肤接触。
2. 确认动物对皮肤捏压及脚趾或尾部刺激无反应后，将其仰卧位固定于成像平台。
3. 将气体麻醉机从腔室输送切换至面罩输送，并在整个操作过程中维持1.5%的恒定麻醉浓度。
4. 通过在成像平台的铜片（心电图电极）上涂抹导电凝胶，并用胶带将动物四肢固定于铜片上，采集生理数据（心电图和呼吸信号）。
   注意：使用内置加热平台将异氟烷维持在1.5%用于麻醉维持，并保持核心体温接近37 °C。将目标呼吸频率维持在每分钟100–140次，以确保成像期间的生理稳定性。
5. 使用棉签涂抹脱毛膏去除胸部毛发。
6. 用浸水的纱布擦去多余的乳霜和松散的毛发，以准备成像。
   注意：必须彻底清除残留的脱毛膏，以避免皮肤刺激或毒性反应。
7. 在双眼涂抹无菌润滑性眼膏，以防止巩膜干燥。
8. 在心脏前区涂抹超声传导凝胶，并将成像平台置于与水平面约30°–45°的角度。
   注意：避免超声耦合剂中产生气泡。
9. 将高频超声探头缓慢放置于胸骨旁线，并使其与胸壁平行，以获取调整后的左心室长轴（PLAX）切面图像图1A).
10. 调整探头角度，确保其与胸壁轻柔接触，避免压迫。
11. 按压 明场模式 按钮以切换至亮度模式成像。
12. 调整探头和成像平台的角度以定位左冠状动脉（LCA）。
    注意：在声窗中识别左心室（LV）、左心房（LA）、左心室前壁（LVAW）、左心室后壁（LVPW）、室间隔（IVS）、主动脉（AO）、肺动脉（PA）、肺静脉（PV）、二尖瓣（MV）以及乳头肌。
13. 按下按钮激活彩色多普勒模式 彩色多普勒 触摸屏上的按钮。在实时显示中，远离主动脉瓣（朝向探头）的血流显示为红色。
14. 调整探头角度和位置，以显示从主动脉窦到远端分支处的完整左冠状动脉，同时尽量减少肺静脉血流的干扰。
15. 激活 脉冲波多普勒 (PW) 模式. 将 PW 测量窗置于与 LCA 血流方向平行的位置（图1B，C).
    注意：保持声束角度低于60°，并通过将多普勒取样线与冠状动脉血流方向平行，实时校正角度。
16. 选择 保存视频片段 以获取基线LCA血流速度波形。
17. 将异氟烷浓度增加至3%，并观察冠状动脉血流速度的逐渐升高。
18. 持续暴露于3%异氟烷45秒后，选择 保存视频片段 以捕获充血性冠状动脉血流速度。
    注意：持续监测左冠状动脉（LCA）血流。若脉冲多普勒（PW）取样容积因呼吸或心脏运动发生漂移，应暂停采集，返回彩色多普勒模式重新识别LCA，调整PW取样门位置后，继续进行PW模式采集。
19. 操作完成后，停止异氟烷吸入，并清除超声耦合剂。将小鼠置于加热垫上直至完全恢复意识，然后放回其笼中。

3. 统计学分析

1. 在分析软件中追踪三个连续的心动周期，取其平均值以获得基线及峰值左冠状动脉（LCA）血流速度。将冠状动脉血流储备（CFR）计算为充血期峰值舒张期冠状动脉血流速度与基线峰值舒张期冠状动脉血流速度（CFV）的比值。
2. 在实验操作者与数据分析人员之间实施双盲设计。使用Shapiro–Wilk检验评估数据正态性。对符合正态分布的数据采用双尾非配对Student’s t检验进行分析；对非正态分布的数据采用Mann–Whitney U检验进行分析。

结果

本研究共使用16只小鼠（HFpEF组，n = 8；CTRL组，n = 8）。在胸骨旁长轴（PLAX）切面下，通过彩色多普勒引导识别左冠状动脉，并采用脉冲波（PW）多普勒测量冠状动脉血流速度。在每只小鼠1.5%（基础状态）和3%（充血状态）异氟烷浓度下获取充分且可重复的图像后²⁶，通过至少3个连续心动周期的测量值取平均确定冠状动脉血流储备（CFR）；代表性结果见图2。每只小鼠在同一次成像过程中仅进行一次充血刺激。

初始评估包括在评价冠状动脉微血管功能障碍之前，通过心尖四腔观超声心动图验证HFpEF小鼠模型是否成功复制。研究结果表明，HFpEF组的E/A比值和E/e'比值均显著升高，提示存在舒张功能障碍（图3A,B）。此外，与对照组相比，HFpEF小鼠的等容舒张时间（IVRT）显著延长，提示左心室主动舒张功能受损（补充图1A）。同时，HFpEF小鼠的体重显著高于对照组，反映了高脂饮食诱导的代谢表型...

讨论

本研究介绍了一种采用 非侵入性、操作简便且可重复的方法，用于评估HFpEF动物模型中的大血管和微血管功能障碍。多普勒超声心动图用于评估冠状动脉血流储备，已被欧洲心脏病学会认可为一种经过验证且可重复的方法¹⁵。在C57BL/6J小鼠的正常生理条件下，冠状动脉血流储备预期值应≥2.0。本研究中，与CTRL组相比，HFpEF小鼠的CFR显著降低，提示冠状动脉微循环受损^4,20,27。

实时同步B型和脉冲波多普勒成像是一种评估小血管的有价值工具。然而，由于脉冲重复频率（PRF）的限制，实时条件下的速度量化仍局限于低速血流状态。操作者可通过优化参数（特别是缩小多普勒速度标尺）来增强小血管的可视化效果并改善多普勒数据采集。在图像采集过程中，存在若干技术挑战，需主动进行故障排查。关于 信号丢失问题，在高脂饮食联合L-NAME诱导的HFpEF小鼠...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物生理监测仪	Fujifilm	VEVO 3100	监测心率、呼吸频率和体温
C57小鼠	GemPharmatech Co., Ltd
相机	Canon,Japan	EOS R50	记录成像平台和超声探头的位置
脱毛膏	Veet,French		脱毛
纱布	Curity	CAR-6339-PK	无菌
异氟烷	REWARD	R510-22-10	麻醉
N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）	Sigma-Aldrich	N5751	HFpEF小鼠模型构建
研究级饲料，60%脂肪	Research Diets, Inc.	D12492	高脂饮食
手术恒温加热垫	Globalebio, China	GE0-20W	温度控制
超声耦合剂	Parker Laboratories	W60698L	超声传导凝胶
Vevo 3100 临床前成像平台	Fujifilm	VEVO 3100	超声心动图检查
VevoLAB 软件	Fujifilm	VevoLAB 3.2.6	超声心动图数据分析