本研究提出了一种非侵入性方法， 体内 利用双光子和二次谐波生成显微技术，对小鼠毛囊周期全过程中的毛干形态、黑色素动态变化及真皮胶原密度进行纵向监测，为脱发治疗研究提供一种可靠的实验方法框架。
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研究文章
* These authors contributed equally
† These authors contributed equally
本研究提出了一种非侵入性方法， 体内 利用双光子和二次谐波生成显微技术，对小鼠毛囊周期全过程中的毛干形态、黑色素动态变化及真皮胶原密度进行纵向监测，为脱发治疗研究提供一种可靠的实验方法框架。
传统的毛囊周期评估依赖于侵入性的组织学方法，限制了连续的纵向观察。本研究假设，无创光学成像技术，特别是双光子激发荧光（TPEF）和二次谐波生成（SHG），能够准确追踪并定量分析 体内 毛发纤维、黑色素和胶原蛋白在多个毛囊周期中的动态变化。对C57BL/6小鼠的毛发纤维进行了监测 在体 在生长期、退行期和休止期，采用皮肤镜、摄影和电子显微镜进行观察。具体而言，使用800 nm激发下的双光子激发荧光（TPEF）成像来定量分析黑色素动态变化，而使用950 nm激发下的二次谐波生成（SHG）成像来观察毛囊间胶原的变化。为确保准确性， 体内 光学测量结果经过交叉验证：通过皮肤摄影观察整体组织外观，并结合苏木精-伊红（HE）染色检测毛球部表达，以确认黑色素动态变化；通过偏振液态晶体成像系统分析天狼星红染色切片中的纤维密度与取向，以验证胶原变化。研究结果表明，在生长期（anagen期），毛干直径和黑色素生成逐渐增加，同时伴随间质胶原密度显著降低；在退行期（catagen期）和休止期（telogen期），黑色素水平逐渐下降，胶原密度则逐步恢复至基线水平。本研究建立了一种经过验证的、非侵入性的 在体内 评估毛囊综合动态变化的方法学，为脱发治疗活性成分的临床前评价提供可靠的实验框架。
C57BL/6小鼠的毛囊具有同步性和规律性，为实验提供了便利，使其成为研究皮肤疾病的常用动物模型1,2。C57BL/6小鼠出生后第七周，毛囊进入第二个休止期3。若无人工干预，该休止期将持续至出生后第十二周4。这一较长的休止期是研究中常用的时点，用于同步毛囊的生长周期5。对小鼠进行人工脱毛后，毛囊会立即开始进入生长期6。
进入生长期后，隆突区的干细胞增殖并分化为外根鞘，向下生长以增加毛囊长度7。随着毛囊加深，毛干基部向上延伸8。 bulb 区的干细胞持续分化为毛干和内根鞘9。在生长期，皮肤中胶原蛋白和黑色素的分泌也发生快速变化10，在毛囊发育过程中发挥重要作用11,12。在与脱发相关的研究中，黑色素分泌通常通过皮肤颜色进行评估，难以实现精确定量
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所有涉及脊椎动物实验对象的方法均按照机构指南进行。所有动物实验程序均经中国中医科学院实验研究中心机构动物护理和使用委员会批准（方案编号：ERCCACMS11-2210-03）。本研究中使用的所有材料均列于材料表中。
动物准备与宏观观察
6–7周龄、体重为20 ± 2 g的雄性C57BL/6小鼠购自商业供应商。小鼠被分为组织学分析队列（n = 39）和连续观察队列 体内 成像队列（n = 3）。所有小鼠背部毛发均被脱除，以同步毛囊周期。从脱毛后第2天至第26天，每隔一天观察一次毛发生长状态。成像队列小鼠背部每隔一天进行一次拍照，持续至第26天，使用相机拍摄，保持15 cm的固定焦距，并确保一致的标准实验室环境光照条件，以准确记录宏观变化。
体内 TPEF 与 SHG 成像
在脱毛后第 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 和 26 天进行成像实验。使用异氟烷对小鼠进行麻醉。通过观察呼吸频率并轻捏脚趾以检测足部反射，确保小鼠完全失去意识。将麻醉后的小鼠固定在双光子显微镜的载物台上。进行黑色素的 TPEF 成像时，显微镜配置 25 倍水浸物镜（数值孔径 = 1.05），激发波长设定为 800 nm。对黑色素的自发荧光进行 z 轴层扫成像，总扫....
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小鼠毛发观察
小鼠毛发生长的摄影观察结果如下所示 图1A毛发从皮肤表面开始出现于第10天，持续发育维持在第12至第16天p < 0.05）。毛发覆盖度在第18天至第26天期间随之趋于稳定（p > 0.05) (图1B）。此外，皮肤镜检查有助于无创地 体内 毛发生长动态的观察。第2天，皮肤呈现均匀的粉红色，无毛发。到第8天，毛干可见于表皮下方；到第10天，毛干被观察到已穿出皮肤表面。从第10天至第16天，毛干逐渐增粗，至第16天达到最大直径。到第26天，皮肤恢复为粉红色、无毛发的状态（图1A).
C57BL/6小鼠发育出四种不同类型的毛发——针毛、粗毛、次毛和锯齿状毛，它们系统性地分布于较大的初级毛囊和较小的次级毛囊之间（图1C）
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C57BL/6 小鼠模型被选用的原因在于其第二次休止期从第7周到第12周保持稳定。由于26天的观察窗口完全处于这一静止阶段内，所观察到的显著动态变化明确由脱毛诱导的毛囊周期进展所驱动，完全排除了自然年龄相关波动的干扰。当在休止期进行脱毛处理时，毛囊会立即进入生长期。据作者所知，本研究提出了一种新型的非侵入性 体内 利用双光子和二次谐波生成成像观察小鼠毛囊周期的方法32,33毛囊在第6天处于生长期III阶段，第10天处于生长期VI阶段。第18天进入退行期III阶段，第20天进入退行期V阶段，第24天进入休止期；这些结果与传统组织病理学切片所获得的结果高度一致。4此外，由于这种非侵入性方法无需在实验终点处死动物，因而为未来研究奠定了坚实的方法学基础，可实现对同一卵泡微环境中的多周期动态进行长期连续追踪34尽管具有这一潜力，但尚未有系统性研究对此进行考察 体内 C57BL/6小鼠毛囊生长周期中黑色.......
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作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。本文的预印本可在 BioRxiv 公共知识库中获取，参考文献如下42。
本工作得到了中国中医科学院创新基金（编号：CI2025C001）、中国中医科学院科学技术创新项目（项目编号：NLTS2025004）以及中央级公益性科研院所基本科研业务费（项目编号：JJPY2025002）的资助。
作者贡献： 概念化设计，Gaiying He 和 Yi Wang；调查研究，Menghua Liu、Xiaoyu Wang 和 Fenglong Wang；数据管理，Menghua Liu；撰写——初稿准备，Menghua Liu；经费获取，Yi Wang。所有作者均已阅读并同意该论文的发表版本。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C57BL/6小鼠， | 北京维通利华实验动物技术有限公司 | SCXK (京) 2021-0006 | 用于动物模型 |
| 数码单反相机 | 佳能 | EOS 80D | 用于拍摄小鼠背部的图像 |
| H&E 染色试剂盒 | LtdSolarbio 科学 & 技术公司 | G1120 | 用于组织切片染色 |
| 倒置显微镜 | Olympus | BX51 | 用于拍照 |
| 异氟烷 | RWD Life Science Co. | R510-22-16 | 用于动物麻醉 |
| Mai Tai DeepSee | SpectraPhysics | Mai Tai HP | 用于体内TPEF和SHG成像 |
| 医用电子皮肤镜 | 中国创宏医疗科技有限公司 | CH-DSIS-2000 | 用于皮肤颜色的活体成像 |
| 偏振光显微镜 | 奥林巴斯 | BX51-P | 用于成像偏振红染色 |
| 扫描电子显微镜（SEM） | 日立高新技术公司 | SU8010 | 用于毛干超微结构观察 |
| Sirius Red 染色试剂盒 | Solarbio | G1472 | 用于胶原纤维染色 |
| 小型动物麻醉机 | RWD Life Science Co. | R500 | 用于动物麻醉 |
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