在此，我们介绍一种通过鼻内滴注建立小鼠脓毒症免疫抑制模型的实验方案 肺炎克雷伯菌 并通过多种指标验证了该模型。
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本文内容
摘要
摘要
脓毒症是由宿主对感染产生异常反应所导致的危及生命的器官功能障碍。肺炎是引发脓毒症的主要原因。动物模型是研究脓毒症发病机制和评估新治疗策略的重要工具。既往的脓毒症动物模型缺乏自然感染途径，难以准确模拟临床感染过程。
本研究通过鼻内滴注Klebsiella pneumoniae（KP）建立小鼠脓毒症免疫抑制模型，以模拟自然呼吸道感染途径。使用不同浓度KP建模后，在12小时检测细胞因子白细胞介素-6（IL-6）水平以评估炎症反应，在24小时检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酸激酶（CK）和血尿素氮（BUN）水平以评估器官损伤。建模后7天分析模型的生存率。通过检测淋巴细胞和白细胞百分比、单核细胞中主要组织相容性复合体II类（MHC-II）的表达比例，以及CD4+ T细胞中IL-10和TGF-β1的平均荧光强度（MFI），评估小鼠的免疫抑制状态。建模7天后，通过鼻内滴注铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）进行二次感染。在二次感染后24小时检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细菌载量，并在14天内评估死亡率，以进一步评价模型的免疫抑制程度。
通过鼻腔接种高浓度的Klebsiella pneumoniae可有效诱导免疫抑制。其目的是模拟由自然呼吸道感染途径引发的脓毒症，并为动物脓毒症研究提供标准模型。
引言
脓毒症是由宿主对感染产生异常反应所导致的危及生命的器官功能障碍1,2,3。它是重症监护病房（ICU）患者死亡的主要原因之一。全球每年有4890万例脓毒症病例，相关死亡人数达1100万4。尽管抗感染治疗和器官支持技术近年来取得了进展，但脓毒症的发病机制仍未完全阐明，且缺乏特异性治疗手段。因此，脓毒症已成为临床医学研究的重点与挑战之一4。
动物模型在基础医学和转化医学研究中发挥着不可替代的作用，是研究脓毒症发病机制和评估新型治疗策略的重要工具。通过模拟人类脓毒症的病理生理过程，这些模型不仅有助于探索免疫紊乱和器官功能障碍等关键机制，还为药物筛选和干预策略的开发提供了实验平台。在众多动物模型中，小鼠因其明确的遗传背景、丰富的免疫系统研究基础以及易于操作的特点，成为脓毒症研究中最常用的动物模型。
目前，已有多种基于不同范式的脓毒症动物模型，包括内毒素模型、细菌输注模型、盲肠结扎穿刺（CLP）模型以及升结肠支架腹膜炎（CASP）模型5。然而，这些模型缺乏自然感染途径，难以真实反映临床感染过程。研究表明，肺....
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方案
本文所描述的所有实验程序均经第三军医大学动物福利与伦理委员会批准（SCXK(PLA)20120031）。
1. 实验动物
- 使用C57BL/6小鼠，雄性，8–10周龄，体重23–28 g（动物许可证号：SCXK (湘) 2019-0004）。将小鼠饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中，自由摄食和饮水。饲养条件如下：室温（24 ± 2ºC），湿度50%–55%，光照-黑暗周期为12 h/12 h。
2. 细菌制备
- 选用合适的菌株。此处使用Klebsiella pneumoniae美国典型培养物保藏中心（ATCC）菌株43816。
- 准备适当的培养基（LB肉汤培养基）。
- 准备用于接种的细菌。
- 挑取单个菌落接种于5 mL LB肉汤培养基中，在37 °C、220 rpm条件下振荡培养过夜（12 h）。
- 将过夜培养的细菌转接到新鲜LB肉汤培养基中，继续培养3–4 h，直至达到高密度生长期（600 nm处的光密度[OD600] ≈ 0.8）。
- 将细菌溶液稀释后，取100 µL加入含有固体培养基的培养皿底部，置于37 °C培养箱中培养12 h，计数菌落数量，获得浓度....
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结果
鼻腔滴注后12小时，1 × 108 KP组小鼠血清IL-6水平显著升高（p < 0.0001，n = 5）（图2A）。鼻腔滴注后24小时，1 × 108 KP组小鼠血清ALT（p < 0.01，n = 5）（图2B）、AST（p < 0.01，n = 5）（图2C）、CK（p < 0.01，n = 5）（图2D）和BUN（p < 0.001，n = 5）（图2E）水平均高于对照组。1 × 106 KP组和1 × 108 KP组小鼠在第1至第3天出现眼睑闭合、眶周分泌物增多、寒战以及对外界刺激反应性降低的表现。此外，小鼠倾向于聚集成团，活动减少。鼻腔滴注KP后第三天，两组小鼠的体重均显著下降（p < 0.0001）（
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讨论
脓毒症是一种复杂的临床综合征，其晚期特征性的免疫抑制状态是导致患者死亡的关键因素12,13。因此，能够准确模拟脓毒症诱导免疫抑制病理生理过程的临床前模型，对于深入探究其机制以及开发新的治疗方法至关重要。在本研究中，我们成功建立并验证了一种通过鼻内滴注肺炎克雷伯菌（KP）诱导的小鼠脓毒症模型，该模型的核心特征是能够稳定地复制出与临床高度相关的免疫抑制状态。
为确保模型的可靠性和可重复性，我们在建立过程中采用了一系列标准化设计。标准高毒力菌株 肺炎克雷伯菌 ATCC 43816 (KPPR1)14,15 选择了该菌株用于本实验方案。该菌株的毒力特征已得到充分验证，能够稳定诱导感染相关的病理改变，为模型的可重复性奠定了基础。鼻腔滴注的标准化操作设计是确保感染途径一致性的核心。针对操作过程中可能出现的咳嗽或类似叹气样呼吸等潜在问题，我们建立.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（82222038 和 81970259）、国防生物技术优秀青年人才项目（2023-JCJQ-ZQ-001 和 01-SWKJYCJJ06）以及重庆市杰出青年科学基金（CSTB2022NSCQ-JQX0017）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生化培养箱 | YSEI | SHH-150L | 细菌培养 |
| C57BL/6J 小鼠 | Vital River Laboratories | 8-10 周龄，雄性 | |
| CD116b | BioLegend | 101257 | 流式抗体（抗小鼠） |
| CD25 | BD bioscience | 740447 | 流式抗体（抗小鼠） |
| CD3 | BioLegend | 100203 | 流式抗体（抗小鼠） |
| CD4 | BioLegend | 100544 | 流式抗体（抗小鼠） |
| CD45 | BioLegend | 103116 | 流式抗体（抗小鼠） |
| CD8 | BioLegend | 100752 | 流式抗体（抗小鼠） |
| 细胞染色缓冲液 | BioLegend | 420201 | |
| 恒温摇床 | Honour | HNY-100B | 细菌培养 |
| 流式细胞仪 | Beckman Coulter | CytoFLEX | 流式细胞术分析 |
| 高速离心机 | Beckman Coulter | AIIEGRA | |
| IDEXX catalyst one | IDEXX | Catalyst One | 生化分析 |
| IL-10 | BioLegend | 505026 | 流式抗体（抗小鼠） |
| 胰岛素注射器 | WEGO | 1mL | 采血 |
| 肺炎克雷伯菌 ATCC 43816 | biobw.org | bio-81659 | |
| LB 培养基（粉末） | Solarbio | L1010 | LB 液体培养基 |
| LB 培养基（粉末） | Solarbio | L1015 | LB 琼脂平板 |
| LY6C | BioLegend | 128010 | 流式抗体（抗小鼠） |
| Ly6G | BioLegend | 127606 | 流式抗体（抗小鼠） |
| MHC-II | BioLegend | 107622 | 流式抗体（抗小鼠） |
| 微量移液器 | Eppendorf | P100 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Solarbio | R1010 | |
| 分光光度计 | Eppendorf | Eppendorf6131 | 光密度测定 |
| 统计分析软件 | GraphPad Software | Graphpad Prism10.0 | |
| 无菌无酶移液器吸头 | Biosharp | 200μL | |
| TF 稀释缓冲液 | BD Pharmingen | 51-90008101 | |
| TF 固定/透化缓冲液 | BD Pharmingen | 51-90008100 | |
| TF 透化/洗涤缓冲液 | BD Pharmingen | 51-90008102 | |
| TGF-β1 | BioLegend | 141406 | 流式抗体（抗小鼠） |
| Varioskan LUX 多功能微孔板读板仪 | Thermo Scientific | Varioskan LUX |
参考文献
- Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Shankar-Hari, M., et al.
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