超分辨率成像与共享管理：具备多重探测的共焦点显微镜协议

Summary

该协议详细介绍了激光扫描共聚焦显微镜系统与多路复用阵列探测器的先进成像应用及共享资源管理，实现高分辨率的蜂窝和亚细胞成像。该工作流程支持从共聚焦到超分辨率（~120纳米）的多模态成像，使纳米级可视化更加便捷。

Abstract

超分辨率显微镜（SRM）克服了传统光学显微镜的绕射极限，实现了亚细胞结构的纳米级可视化。然而，受激发射耗尽显微镜（STED）、光激活定位显微镜（PALM）/随机光学重建显微镜（STORM）和结构照明显微镜（SIM）等技术的广泛采用，可能受到高光毒性、特殊样品制备或复杂作等因素的阻碍。在这里，我们介绍了一个综合协议，利用激光扫描共焦点平台与多路复用超分辨率探测器集成。该系统结合计算处理，使得在同一工作流程中实现共焦成像与超分辨率成像之间的直接过渡。该协议提供了一种用户友好的方法，实现快速、高分辨率和低光毒性成像。详细方法涵盖多模态成像能力，包括多色荧光、差分干涉对比（DIC）、三维Z堆重建、延时活细胞成像、大面积镶嵌以及多路复用阵列探测器提供的多种超分辨率模式。系统比较表明，超分辨率模式的横向分辨率约为120纳米，比传统广视显微镜的衍射极限提升约两倍，且在分辨率和信噪比（4-8倍）上均显著提升，相比同一平台上的标准共聚焦作。讨论还涵盖了支持该技术可持续运营的关键共享资源管理模式。这份综合指南为新手和有经验的研究人员及设施管理者提供了宝贵资源，帮助他们在生命科学研究中采纳并最大化这种可访问的先进成像技术的潜力。

Introduction

动态亚细胞结构的可视化是推动生命科学研究的基础。然而，传统光学显微镜的分辨率受绕射限制在约200纳米的横向范围，限制了其解析动态亚细胞过程的能力。为了克服这一障碍，开发了多种超分辨率技术。然而，STED显微镜、PALM/STORM和SIM等技术常常在多用户环境中的广泛应用上存在障碍，包括高光毒性、需要专用荧光团或样品制备、复杂的比对程序或密集的^{计算处理1,2,3}。

在此背景下，配备多路复用阵列探测器的共聚焦显微镜系统通过多像素检测和计算重新分配实现超分辨率成像，提供了有力的替代方案，显著降低了技术阈^值4。该方法利用32元素砷化镓磷化物（GaAsP）探测阵列，从每个扫描点收集更多光子。后续的智能反卷积算法会重新分配这些信息，有效地减少检测体积。该工艺实现了横向约120纳米和轴向350纳米的空间分辨率，比广视场显微镜的衍射极限提升约2倍，且信噪比相比标准共聚焦模式提升^4-8倍，且在同一仪器4、^5、6上。这种独特的组合——增强分辨率、优越的信号质量以及与常见荧光标记和协议的兼容性，是其广泛应用的主要优势。

因此，这种可访问的超分辨率显微镜在生命科学研究中得到了广泛应用，使得对细胞器形态、细胞骨架动力学、病毒-宿主相互作用以及固定和活细胞分子共定位的详细研究成为可能 ^7,8。其相对温和的特性使其特别适合对活样本进行长时间延时观察。

将这些先进系统整合进核心设施对于实现访问民主化至关重要，但其可持续且有效的运营也面临明显挑战。在如浙江大学医学院等机构核心设施中，最佳性能和影响力关键依赖于三大支柱：（1）标准化且可重复的影像协议，（2）严格的常规维护，以及（3）有效的共享访问管理框架。虽然在某些方面存在宝贵资源，如早期系统⁹的成像方法或一般设施管理原则^10,11，但目前缺乏一套整合现代多路复用阵列探测器平台详细且可复现协议并采用经过验证共享资源管理模型的综合指南。本协议文章旨在弥合这一鸿沟。

总体目标是提供一份全面的、逐步指南，帮助你在共享资源环境中有效实施和利用多路复用阵列探测器的共聚焦系统，实现超高分辨率成像。It is designed for two primary audiences: researchers requiring resolution beyond conventional confocal limits (~250‬-300 nm) but for whom live-cell compatibility, ease of use, and throughput are also critical;以及设施管理者建立或优化此类服务。本文系统地详细介绍了系统配置、多模态成像协议（涵盖多色、三维、活细胞、铺砖和超分辨率模式），以及经过验证的共享管理模型。这份综合指南作为资源，最大化这一强大影像技术的潜力和可及性。

Protocol

所有涉及生物样本的实验均按照浙江大学医学院核心设施的指导方针和规定进行，并获得机构生物安全委员会批准（批准证书编号）。BSL20235710079）。

注意：除非另有说明，所有涉及细胞培养的程序必须在II类生物安全柜的无菌条件下进行。该协议假设显微镜系统已安装，激光功率已校准。材料 表中列出了关键试剂、耗材和设备（如成像碟、盖玻璃、安装介质）的详细规格及推荐供应商。

1. 样品制备

注意：成功的超分辨率成像始于最佳样品准备。使用高质量的1.5厚（0.17毫米）盖玻璃成像碟对于匹配高NA油浸物镜的校正圈并避免球差至关重要。除非另有说明，所有离心步骤应在300× 克 下进行，持续5分钟。

1. 多色超分辨率成像（如COS7单元）的固定单元样品制备
   注意：本方案描述了微管（Alexa Fluor 568）和线粒体（Alexa Fluor 488）的免疫染色，采用4'，6-二胺二-苯吲哆酮（DAPI）核染色，如图1所示。
   1. 在5%_CO2 加湿培养箱中，将COS7细胞培养成Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）并补充10%胎儿牛血清（FBS），温度为37°C。
   2. 将电池板嵌入35毫米玻璃底成像碟上，密度为1.0×10个⁵ 格每碟。让细胞附着并生长到60-70%的汇聚度（通常为24小时）。
   3. 抽吸培养基，并用预热（37°C）磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻清洗细胞一次。通过在PBS中加入1毫升4%对甲醛（PFA）定型细胞，并在室温（RT）下培养15分钟。
   4. 吸入PFA溶液（视为危险废物处理）。用2毫升PBS洗细胞三次，每次洗涤培养5分钟，并轻轻摇晃。
   5. 渗透与阻断：用1毫升渗透/阻断缓冲液（0.1% v/v）Triton X-100,1%牛血清白蛋白（BSA）PBS培养30分钟，RT环境。
   6. 初代抗体潜伏：将针对α-微管蛋白（小鼠单克隆）和TOMM20（兔多克隆抗体）混合的原级抗体混合，在抗体稀释缓冲液（1% BSA在PBS中）中，在4°C下（或RT下1-2小时）培养细胞。每个碟使用300微升的液体覆盖玻璃表面。
   7. 清洗：小心吸入初级抗体溶液。用含0.05% Tween-20（PBST）的2毫升PBS洗细胞三次，每次洗涤5分钟。
   8. 二级抗体和核染色：在抗体稀释缓冲液（1% BSA/PBS）中制备荧光二级抗体和DAPI混合物，并防光。
      1. 使用结合Alexa Fluor 568的驴抗小鼠IgG（1：500）和结合Alexa Fluor 488的驴抗兔IgG（1：500）。
      2. 核染色时可添加最终浓度为1 μg/mL的DAPI。将300微升该混合物涂入细胞，并在RT环境中在黑暗中孵育1小时。
   9. 最终清洗：吸取染色溶液，并用2毫升PBS洗细胞三次，每次洗涤5分钟。
   10. 安装介质：小心从成像盘抽取PBS，保持样品略带湿润。立即在玻璃底区域直接滴上一小滴（~20微升）硬化防衰落安装介质（如ProLong Gold）。
   11. 盖固：轻轻将一个#1.5高精度盖玻璃杯放入液滴上，避免气泡。让装体在RT中夜间在黑暗中固化，若需要更快固化，则可在37°C下固化2-4小时。
2. 用于延时成像的活细胞样本制备（例如，表达荧光蛋白标签的肝炎3B细胞）。
   注意：本方案描述了针对线粒体稳定表达荧光蛋白（如EGFP）的Hep3B细胞成像。
   1. 在补充10% FBS的最小必需培养基（MEM）中培养肝炎3B细胞。将板电池安装在35毫米玻璃底成像碟（1.5层玻璃）上，密度为0.8×10⁵cell/碟。允许细胞生长至约70-80%的汇聚度，以达到最佳健康和成像密度（通常为18-24小时）。
   2. 成像准备：成像当天，轻轻更换标准培养基，加入2毫升预平衡（37°C，5%_CO2 ，至少30分钟）、无酚红、低荧光成像培养基，补充10% FBS培养基，如有需要，使用25 mM HEPES缓冲液以稳定pH，置于_CO2 培养箱外。这减少了背景荧光，并在成像过程中保持生理pH值。
      注意：在开始延时采集前，应让天线在环境舱内预热显微镜台上适应至少30-45分钟，以确保温度、焦点和细胞健康稳定。

2. 显微镜系统的启动、初始化及基本对准

1. 显微镜主单元、激光发射模块（包含405、488、561和640纳米固态激光器）、LED光源和控制计算机供电。
   1. 让激光预热并稳定至少15-20分钟。这对于稳定的激光功率输出至关重要，尤其是在定量或延时实验中。
2. 启动显微镜作系统。
3. 在主界面中，选择“显微镜”>“初始化”，或按照软件的启动向导作。
4. 在软件中，进入“采购”面板。在物镜下拉菜单中，选择“Plan-Apochromat 63 x/ 1.40 Oil ”或适合你实验的物镜。
5. 直接在物镜前镜头上滴一滴浸油（折射率=1.518）。避免引入气泡。
6. 对于活细胞成像，至少在成像前45-60分钟激活环境舱和主动聚焦稳定系统（例如“确定聚焦”>）。温度设为37°C，CO2为5%，湿度为>60%。让系统稳定下来。用腔室传感器验证稳定性。
7. 系统现已准备好进行样品装载和成像参数设置。

3. 多色荧光成像

1. 将准备好的样品放置在显微镜台上。小心地将舞台抬起，直到盖子玻璃接触到浸入油。
2. 在获取软件中，点击“获取”标签，选择 创建新实验。
3. 添加多条成像轨迹（通道），对应所用荧光团。对于 图1中的例子，可以配置：
   1. 轨道1（DAPI）：激发405 nm，探测410-480 nm。
   2. 轨道2（Alexa Fluor 488）：激发488 nm，探测495-550 nm。
   3. 轨迹3（Alexa Fluor 568）：激发561纳米，探测570-620纳米。
4. 对于每个轨道，将共聚焦针孔直径设置为1空气单位（1天文单位）。
5. 通过以下迭代过程优化每个通道的激光功率和探测器增益：
   1. 选择第一个通道（例如DAPI）。切换到“实时”扫描模式。
   2. 将初始激光功率设为较低值（例如0.1-0.5%）。将 探测器增益 设定在其线性范围内的适中值（例如，GaAsP PMT为700 V）。
   3. 逐渐增加激光功率，直到目标结构在实时图像背景之上清晰可见。
   4. 打开 直方图 显示。确保没有像素饱和（直方图没有堆叠在右边）。必要时降低激光功率。
   5. 调整 探测器增益 以获得明亮、低噪声的图像。避免增益超过850伏，以防止过多噪声。
   6. 对所有剩余荧光通道重复步骤3.5.1-3.5.5。
      注意：平衡激光功率、增益和像素滞留时间，以最大化信噪比同时最大限度减少光损伤。对于活细胞，优先考虑低功耗和短停留时间。
6. 设置图像格式（像素数）和像素停留时间。
   1. 将像素大小设置为满足奈奎斯特准则：像素尺寸≤（分辨率 / 2.3）。对于标准共軛焦成像（横向分辨率~250纳米），像素尺寸设定为≤108纳米。
   2. 如果有，使用软件的“奈奎斯特 ”采样按钮自动计算。
   3. 设置像素停留时间。使用较长的停留时间（例如1.0-2.0微秒）以获得更高的信噪比，或使用较短的停留时间（例如0.5-1.0微秒）以获得更快的成像。
7. 确保在轨道之间选择“顺序扫描”模式，以减少串扰。
8. 点击“开始”即可获取一张图片。保存图片并保留相关的元数据。

4. 差分干涉对比（DIC）成像

1. 在采集软件的“采集”标签中，选择“添加新通道 ”，并配置为透射光检测。
2. 在软件中选择合适的透射光检测器（通常称为T-PMT（透射光光电倍增管）或ESID（外部系统接口探测器）。
3. DIC棱镜和偏振片配置：
   1. 在硬件控制面板或软件界面中，选择与你目标镜匹配的DIC棱镜（例如，63倍物镜为“DIC III”）。
   2. 将选定的棱镜插入光路。
4. 调整偏光镜和DIC滑块以获得最佳对比度：
   1. 旋转分析仪（偏光片），直到“实时”图像中的背景显得暗或非常暗。
   2. 在观察实时图像时，缓慢地以小幅度调整DIC滑块位置。
   3. 优化直到细胞特征（如膜、细胞核）在中性灰色背景上呈现明显的阴影投射、伪三维浮雕。
5. 将DIC的照明波长设置为可见光范围（例如488 nm或546 nm）。
6. 调整透射光通道的透射强度（激光或灯光功率）和探测器增益，以获得清晰且不饱和的图像。
7. 获取DIC图像。

5. 用于三维重建的Z栈采集

注意：在定义Z叠之前，请将所有成像参数（激光功率、增益、针孔、像素大小）配置在第3节所述的单一最优焦平面上。这确保了所有光学部分设置的一致性。

1. 在“获取”标签中，选择“Z-stack”模式。
2. 定义兴趣量：
   1. 使用高速实时扫描，聚焦于最顶层的感兴趣结构。
   2. 点击“设置优先”（或“顶部”）。
   3. 仔细聚焦到最底层的兴趣结构。
   4. 点击“最后设置”（或“底部”）。软件会显示总深度。
3. 将Z步长设定为满足奈奎斯特采样标准的轴向。（通常为d_r/2.3，其中d_r 为轴向分辨率）。对于63倍/1.4 NA的油物镜，使用0.3-0.4微米。
4. 或者，使用软件中的“最优”或“奈奎斯特”按钮自动计算步长。
5. 按照第3节描述，为每个通道配置成像参数（激光功率、增益、针孔=1 AU）。对于弱信号，可以考虑比单一二维图像略高激光功率或增益。
6. 开始采集，收集整个图像栈。
   注意：总采集时间 = （单个片的帧时间） × 片数
   请做好计划，尤其是现场采样。
7. 三维重建与可视化：
   1. 可以使用软件的“处理”模块（例如3D投影功能），或者在专用软件如ImageJ/Fiji中打开图像栈。
   2. 生成最大强度投影（MIP），以在单一二维图像中查看所有对焦信号。
   3. 要实现真正的3D表现，应用体积渲染。根据需要调整亮度、透明度和光照。
   4. 生成正交视图（XZ和YZ截面），以检查轴向范围和定位。

6. 活细胞的延时成像

1. 按照第1.2节描述准备活细胞。并将天线安装在环境舱内预热显微镜台上。
2. 如第2.6节所述，让样品适应至少45-60分钟以确保稳定。
3. 导航到拥有健康且间距良好的单元格的视场，并使用根据第3.5节优化的参数获取单一高质量快照。
4. 启动主动对焦稳定系统（例如确定 对焦 或类似系统）。对于长期实验以补偿热漂移，这一点是不可谈判的。
5. 在“获取”标签中，选择“时间序列”模式。
6. 根据速度、分辨率和光毒性之间的平衡选择合适的成像模式：
   1. 为了在较不动态的过程中获得最大空间分辨率，请选择“SR”（超分辨率）模式。
   2. 为了适应多种细胞器动力学，选择“SR 2 Y ”或“SR 4 Y ”（加速超分辨率模式）。
   3. 如需超高速成像且无超分辨率，请选择“共焦点”或“Co 2 Y”模式。
7. 定义实验时间线：设定实验的总时长和连续帧之间的时间间隔（Δt）。（例如，线粒体运动需要5-30秒）
8. 优化成像参数以最大限度减少光损伤：
   1. 从能检测到信号的最低激光功率开始。
   2. 在探测器的线性范围（600-850 V）内调整增益，以获得可作的信号电平，优先选择增益而非激光功率的增加。
   3. 使用与图像质量要求兼容的最快扫描速度（最短像素停留时间）。
9. 开始采集延时摄影。监控前几帧的对焦稳定性和细胞健康状况。

7. 大面积磁砖扫描成像

1. 在“获取”标签中，选择“瓦片扫描”模式。
2. 定义铺垫区域时，使用以下两种方法之一：
   1. 基于布局：指定X和Y方向的瓦片数量（例如3×3）。
   2. 基于投资回报率：手动在“实时”图像上绘制一个矩形以定义感兴趣区域。软件会自动计算所需的瓷砖数量。
3. 将相邻瓦片之间的重叠设置为10-15%。
   注意：这种重叠为软件的拼接算法提供了足够的信息，从而创建无缝的复合图像。
4. 像配置静态图像一样，为单个瓷砖配置成像参数（激光功率、增益、分辨率）。
   注意：对于非常大的瓷砖区域，建议使用更快的扫描模式（例如“Co 2 Y”），以保持总采集时间的实用性并减少光漂白。
5. 开始安装瓷砖。软件会自动获取并缝合这些瓷砖。
6. 购入后，仔细检查缝合图像，尤其是瓷砖边界处，寻找任何伪物。如有需要，使用软件的手动缝制工具。

8. 利用多路复用阵列探测器的超分辨率成像

1. 在“获取”标签页中，进入模式选择器，点击“智能设置” ，然后选择“Airyscan”模式。然后选择“超分辨率”作为多路复用阵列检测器的工作模式。
2. 根据实验优先事项选择具体的获取模式：
   1. “SR”模式：实现最高空间分辨率（~120 nm横向）。用于固定样本。
   2. “SR 2 Y”模式：在分辨率和速度之间取得平衡。
   3. “SR 4 Y”模式：最快超分辨率模式（理论上线路速率最高可达~25 fps），针对活细胞成像优化，以降低光剂量。
   4. “Co 2 Y”模式：在不需要超分辨率时，提供类似共焦的成像速度和更高的信噪比。
      注意：分辨率值（例如120纳米）为理想条件¹²下的系统规格。实际分辨率取决于样品准备、信噪比和正确的处理情况。
3. 配置成像参数（激光功率、探测器增益）。
   1. 对于活细胞成像，起始激光功率低于共聚焦模式，以减少光损伤。
   2. 对于暗淡、固定的采样，可能需要更高的激光功率和/或增益以达到足够的信噪比。
   3. 找到能在“实时”模式下获得干净、高对比度图像的最小激光功率。
4. 设置像素大小和停留时间。
   1. 要捕捉增强分辨率，将像素大小设置为满足奈奎斯特准则：像素大小≤（期望分辨率 / 2.3）。对于SR模式（目标120纳米），像素尺寸设为≤~52纳米。
   2. 如果有，使用软件中的“最优”或“Nyquist”按钮自动计算。
5. 获取图像。原始数据包含多路复用信号，尚未进行超解析。
6. 处理采集数据以实现超分辨：
   1. 进入软件的处理模块。
   2. 选择数据集并选择“超分辨率处理”功能。
   3. 从“自动”设置开始。对于低信噪比数据，手动调整“强度”和“噪声滤波器”以增强锐度而不产生伪影。
   4. （可选）为了达到最高保真度，尤其是在三维堆栈中，可以应用额外的联合反卷积（jDCV）步骤。
   5. 执行处理。比较处理后与未处理的视图，以验证真实细节的增强。
7. （可选）对于不同模态的信噪比（SNR）定量比较：
   1. 在不同模式下拍摄同一样品的图像。
   2. 在分析软件中，定义一个均匀结构上的关注区域（ROI），并测量平均信号强度。
   3. 定义背景投资回报率，并测量背景强度的标准差。
   4. 计算信噪比 = （平均信号） / （背景标准差）。
8. （可选）用于使用荧光珠进行经验系统分辨率测量：
   1. 准备100纳米荧光珠样品。
   2. 通过奈奎斯特采样获取SR模式下孤立珠的Zstack。
   3. 用超解析处理栈，并（可选）jDCV。
   4. 使用软件中的“PSF测量” 工具拟合3D高斯图，并记录半高宽（FWHM）值。

Results

多色荧光成像
对固定COS7细胞进行了多色荧光成像，如第3节所述。针对α微管（微管）和TOMM20（线粒体）抗体与DAPI核灭染剂一起使用。如 图1所示，细胞核（蓝色）、线粒体（绿色，Alexa Fluor 488）和微管（红色，Alexa Fluor 568）被清晰划分，具有高特异性和最小的光谱串扰，验证了顺序扫描的有效性和优化检测设置。

荧光与差分干涉对比（DIC）的整合
荧光通道与DIC成像的叠加（第4节）提供了情境形态信息。 图2展示了高对比度DIC图像，具有细胞特征的阴影浮雕，这些特征与荧光信号精确叠加，突出了无标记对比与荧光结合的实用性。

三维建筑分析...

Discussion

本文所展示的集成协议为在可持续共享资源框架内实现配备多路复用阵列超分辨率探测器的现代共聚焦显微镜系统先进成像能力提供了全面的路线图。本节综合了该方法的关键方面、实际应用及其在生物影像领域的定位。该协议的成功执行取决于几个关键步骤。首先，细致的样品准备是基础;使用高分辨率兼容的基底（例如#1.5盖玻璃）和优化的免疫染色方案对于实现超^{分辨率处理所需的}信号完整性和低背景至关重要。采集过程中，在实时反馈和奈奎斯特采样准则指导下，仔细平衡激光功率、探测器增益和像素停留时间，对于最大化信噪比同时最小化光损伤至关重要，这对活细胞应用尤为重要¹⁴。最后，必须强调的是，对于基于多路复用阵列检测器的模式，采集后必须进行计算处理，以从原始阵列数据重建超分辨率图像;忽略这一步会导致次优结果，正如我们的数据所示。

该协议既稳健又具适应性。例如，信道串扰可以通过顺序扫描和频谱去混来缓解。在活细胞实验中，光毒性迹象促使激光功率立即降低并切换到更快的模...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
COS7电池	ATCC（或类似机构）	CRL-1651	非洲绿猴肾纤维母细胞系。用于制备固定细胞样品以进行多色超分辨率成像。
驴类抗鼠IgG，Alexa Fluor 568共轭物	Invitrogen（或类似产品）	A10037	用于微管染色的二级抗体。1：500稀释时使用。
杜尔贝科S改良鹰培养基（DMEM），高葡萄糖	Gibco（或类似）	11965092	COS7细胞使用标准培养基，辅以10% FBS。
胎儿牛血清（FBS），热灭活	Gibco（或类似）	10082147	血清补充剂在所有细胞培养基中以10%（v/v）浓度使用。
玻璃底成像碟（35毫米，微型碟，#1.5聚合物盖滑，0.17毫米厚）	Ibidi（或类似）	81156	用于细胞板和成像的底片。对于与高NA油浸物镜的兼容性至关重要。
图像处理与分析软件（ZEN 模块）	卡尔蔡司股份公司	ZEN 3.5（蓝色）	用于三维重建、超分辨率处理（如Airyscan处理）、PSF测量和信噪比分析。
图片J / 斐济	开源	无	用于额外的三维重建、生成正交视图以及一般图像分析。
浸油（折射率=1.518）	卡尔·蔡司（或类似者）	444960-0000-000	用于油浸物镜（例如，63倍/1.4 NA）。
带多路复用阵列探测器的激光扫描共焦显微镜系统（例如，ZEISS LSM 900配备Airyscan 2）	卡尔蔡司股份公司	LSM 900（艾瑞斯坎2）	该平台是协议中描述的所有共焦和超分辨率模式的主要成像平台。
与厄尔合作的最低必需培养基（MEM）盐	Gibco（或类似）	11095080	标准培养基用于肝炎B细胞，辅以10% FBS。
小鼠抗α-微管蛋白单克隆抗体（克隆DM1A）	Sigma-Aldrich（或类似）	T6199	用于微管标记的一级抗体。1：500稀释时使用。
对甲醛（PFA），PBS中的4%	Jinpan （或类似）	TBS5083	细胞固定液。室温使用15分钟。请采取适当的预防措施。
无酚红成像介质	Gibco（或类似）	21063029	用于活细胞成像的低自发荧光培养基。预平衡为5% CO2，37°使用前的C。
磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），1X，pH 7.4	CellWorld（或类似产品）	C0162-311	在整个方案期间用作洗涤和稀释缓冲剂。
ProLong 金色防褪色装蚓	Invitrogen（或类似产品）	P36930	用于在固定样品中保持荧光的硬化装载介质。
特里顿 X-100	Sigma-Aldrich（或类似）	T8787	以0.1%（v/v）用于细胞渗透
Tween-20	Sigma-Aldrich（或类似）	P9416	在抗体培养后，PBS（PBST）中以0.05%（v/v）浓度用于洗涤步骤。
牛血清白蛋白（BSA），第五组分	Sigma-Aldrich（或类似）	A7906	在PBS中以1%（w/v）浓度用于阻断，并作为抗体稀释缓冲液的成分。
DAPI（4英尺6-二酰胺-2-苯哐多）	Sigma-Aldrich（或类似）	D9542	核锈剂。以最终浓度1 & micro使用;克/毫升。
驴抗兔IgG，Alexa Fluor 488共轭	Invitrogen（或类似产品）	A21206	线粒体染色的二级抗体。1：500稀释时使用。
荧光微球（珠子），直径100纳米	Invitrogen（例如，TetraSpeck&trade）或类似产品	T7279	用于系统的经验测量”点扩散函数（PSF）和分辨率。
稳定表达EGFP-线粒体的3B肝细胞	IMMOCELL的灵魂	IM-H367	人类肝癌细胞系经过工程工程，稳定表达针对线粒体基质的EGFP。用于活细胞延时成像。
HEPES缓冲液，1 M	Gibco（或类似）	15630080	在最终浓度25毫米的成像培养基中用于在CO/sub>培养箱外的活成像中稳定pH。
高精度罩玻璃（#1.5,0.17毫米厚）	Marienfeld（或类似结构）	107052	用于固定样品的安装。
显微镜操作系统软件（例如 ZEN 蓝版）	卡尔蔡司股份公司	ZEN 3.5（蓝色）	用于系统控制、图像采集和基础处理。
物镜：Plan-apochromat 63x/1.40 NA 油性 DIC	卡尔蔡司股份公司	421462-9900-000	用于高分辨率成像的主要目标。
兔子抗TOMM20多克隆抗体	Abcam（或类似品牌）	AB186735	用于线粒体标记的一级抗体。使用时稀释比例为1：1000