方法文章

体外评估植物源性分子对传统生物杀灭剂的增效作用

DOI：

10.3791/70172

⸱

2026年5月8日

 ,  ,  , 
1LEPABE, ALiCE, Faculty of Engineering, University of Porto, 2DEQB-Department of Chemical and Biological Engineering, Faculty of Engineering, University of Porto, 3LAQV/REQUIMTE, BioSIM, Department of Biomedicine, Faculty of Medicine, University of Porto, 4Department of Chemical Engineering, Faculty of Science and Technology, University of Coimbra

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案提供了一个系统性框架，通过杀菌活性建模和组合相互作用测定，评估植物化学物质如何增强传统杀菌剂的杀菌效果，旨在鉴定可提高微生物控制效果并减少杀菌剂总体使用量的协同作用混合物。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

开发创新且高效的策略以增强传统生物杀灭剂的抗菌活性，是改进医疗消毒领域微生物控制的有前景的方法。在此背景下，我们描述了一种详细的实验方案，用于评估植物来源的植物化学物质对合成生物杀灭剂的增效作用。由于这些植物源产品具有结构多样性、生物活性以及通常较低的毒性，因而成为理想的生物杀灭剂佐剂候选物。本文所述的工作流程可用于测定单一组分（生物杀灭剂和植物化学物质）及其双联或三联组合的最小杀菌浓度（MBCs），并系统生成剂量-反应曲线和时间-反应曲线。所得数据可进行高级数学建模分析，包括计算部分杀菌浓度指数（FBCI），并利用软件Combenefit评估各测试组分之间的相互作用，判断其为协同、相加或拮抗效应。由此，可识别出具有潜力的天然产物作为生物杀灭剂增强剂，优化抗菌效果，并设计更可持续且更安全的消毒策略，从而降低对合成生物杀灭剂所需浓度的依赖。这不仅提升了微生物控制效果，也最大限度地减少了因过度使用生物杀灭剂所带来的环境与公共健康风险。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

医疗相关感染（HAIs）是全球最严重且令人担忧的公共卫生挑战之一1令人担忧的是，它们与多重耐药微生物（MDR）的传播以及细菌生物负荷在医院环境表面的持续存在密切相关，这通常是由于消毒措施不当或无效所致。2,3此外，患者、医护人员与医疗设备之间的交叉污染进一步加剧了这一问题。4,5例如，在欧洲，据估计每天约有80,000名住院患者至少感染一种医院获得性感染（HAI），每年因此导致额外约1,600万住院日2新冠疫情使这一问题更加复杂，由于抗菌剂/消毒剂的大量使用以及住院人数增加，导致耐多药细菌感染病例激增6,7耐药菌的出现，包括产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的细菌 大肠杆菌 和耐甲氧西林的 金黄色葡萄球菌 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）已在全球范围内造成日益加重的健康和经济负担。事实上，这些菌株凸显了开发创新性感染预防与控制解决方案的紧迫性。1,8,9.

基于这一背景，杀菌剂已成为控制耐药细菌及其感染传播的关键工具，被广泛用于医院环境表面的消毒、医疗器械的灭菌、水系统的处理以及预防医疗设备的污染10,11。与抗生素作用于特定的微生物靶点不同12，杀菌剂可同时破坏多种细胞结构，包括细胞膜、酶、核糖体RNA以及代谢通路13,14,15。这种广谱作用机制最初被认为可降低耐药性的发生风险。然而，现有证据表明，微生物能够适应杀菌剂的暴露，从而产生耐受性、持续存活，甚至对抗生素产生交叉耐药性10,16。例如，Pseudomonas aeruginosa 暴露于苯扎氯铵后，通过外排泵的过表达，筛选出对环丙沙星和新生霉素耐药的变异株17。类似地，三氯生已被证实可激活Stenotrophomonas maltophilia中的外排泵，而氯己定的暴露则与S. aureus中抗生素耐药性的增加相关18。

此外，季铵盐类化合物（QACs）、氯己定、二脒类、吖啶类以及三氯生已被认为可能是导致多种抗生素耐药性产生和持续存在的原因19,20。已知如qacA/B和smr等耐药基因可赋予细菌对QACs的耐受性，且已有临床失败案例报道，包括因导管储存于受污染的QAC溶液中而引发的菌血症，以及碘伏制剂本身存在的微生物污染问题16,17,21。这些发现凸显了优化生物杀菌剂使用的紧迫性，需通过机制研究和合理的消毒策略加以支持。

生物膜是由多糖、蛋白质和核酸组成的胞外基质中嵌入的高细胞密度且结构有序的细菌群落，对感染控制构成了额外且重大的障碍22,23。它们对抗生素和杀菌剂表现出显著的耐受性，导致患者体内感染持续存在。此外，生物膜还常与医疗器械、手术器械及医院环境表面的持续污染相关24。尽管其具有重要的临床意义，但直到近几十年，生物膜才被确认为慢性感染和抗菌药物耐药性的主要因素。其顽强的生存能力使得即使使用强效消毒剂也往往无法彻底清除，残留的持留细胞仍可重新引发感染20,25,26。因此，寻找有效的抗生物膜策略对于控制医院获得性感染（HAIs）以及减轻多重耐药病原体带来的公共卫生和经济负担至关重要27,28。

作为一种有前景的解决方案，植物化学物（phytochemicals）——即由植物产生并从中提取的次生代谢产物——代表了一类尚未被充分开发的新型抗菌和抗生物膜剂资源29。然而，目前尚无植物化学物被用作抗生素，因其抗菌活性与传统抗生素相比相对较弱。通常根据敏感性试验将植物化学物归类为抗菌剂，其最低抑菌浓度（MIC）范围为100至1000 µg/mL，该数值远高于传统抗生素30,31。重要的是，植物化学物单独使用或作为传统杀菌剂的增效剂时，已显示出抗生物膜活性。例如，槲皮素（quercetin）可抑制藻酸盐的生成，从而在生物膜形成过程中减少黏附32,33,34。大黄素（emodin）通过降低生物膜形成相关关键基因的表达，抑制了铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）的生物膜发育35。将植物化学物与传统上常用但日益失效的杀菌剂联用，作为耐药性调节剂，是一种有望提高抗菌效果的策略36。此类协同作用可干扰微生物的耐药机制，降低实现有效消毒所需的杀菌剂最低有效浓度37。该方法可优化杀菌性能，减轻耐药性发展的选择压力，并减少因过度使用杀菌剂所带来的生态与毒理学影响15,20。植物化学物具有结构多样性38,39,40、来源广泛38,39,41、成本低廉38,39,42，且通常对人类和环境的毒性低于合成杀菌剂38,39。它们是天然产物，通常来源于可再生的植物资源，在某些情况下，据报道其环境持久性较低，毒性特征也优于某些合成杀菌剂43,44,45。尽管其成本、可获得性和毒性特征因化合物及提取工艺而异，但多种植物化学物与某些传统杀菌剂相比，已表现出更有利的安全性和环境特性46,47。

本方案旨在评估植物化学物质单独使用或与传统生物杀菌剂联用时在医疗消毒中的潜在应用价值。简而言之，该方案在广泛的浓度范围内评估生物杀菌剂与植物化学物质之间的相互作用。首先在0.1–500 mg/L浓度范围内测试生物杀菌剂，在50–10,000 mg/L浓度范围内测试植物化学物质，以确定最小杀菌浓度（MBC）（表1）。对于双组分联合使用，选择亚杀菌浓度如下：苯扎氯铵（BAC）为0.1、0.5和0.75 mg/L；过氧乙酸（PAA）为0.1、0.3和0.5 mg/L；水杨酸（SAL）为50、100和250 mg/L；丁香酚（EUG）为100、250和750 mg/L（表1）。三组分联合使用则采用BAC（0.75 mg/L）或PAA（0.5 mg/L），分别与SAL（100或250 mg/L）和EUG（250或750 mg/L）组合（表1）。进行1–90分钟的时间-反应实验，随后评估24小时细菌再生长情况。抗菌相互作用通过分数杀菌浓度指数（FBCI）进行量化，并使用Combenefit软件进行分析；同时，采用Chick-Watson模型和Weibull模型拟合消毒动力学，以表征浓度依赖性及灭活动力学特征。

其创新之处在于对植物化学物与杀菌剂之间稳定的双重及三重相互作用进行合理设计，在减少传统杀菌剂使用量的同时，优化了消毒活性，并最大限度地降低了毒性和环境影响。此外，还采用了数学方法，如计算FBCI 和协同效应评估，以量化植物化学物与杀菌剂在微生物控制中的相互作用。FBCI可在特定浓度组合下对相互作用（协同、拮抗或无关）提供分类解释，而Combenefit则能够基于响应面法，在更广泛的浓度范围内对相互作用模式进行更全面的评估。这使得浓度依赖性的相互作用效应得以可视化和量化，而这些效应可能无法通过单点指数捕捉到48,49。此外，消毒动力学采用Chick-Watson模型（用于剂量-响应）和Weibull模型（用于时间-响应）进行建模50。这些模型提供了微生物灭活的动力学描述，给出表征消毒速率和存活曲线行为的定量参数50。它们有助于判断杀灭过程是否符合对数线性或非线性动力学，并对处理效应提供更具机制性的解释，从而超越了FBCI的描述性局限51,52。

本方案可系统性地鉴定具有前景的植物化学物-杀菌剂组合，并开发出一种高效且可持续的医疗保健消毒策略。与仅提供静态终点测量结果的传统最小抑菌浓度（MIC）或棋盘法实验不同，本方案整合了动态杀菌建模和相互作用分析，以全面捕捉增效作用的强度和动力学特征。传统棋盘法实验虽能基于MIC终点提供有关抑制性相互作用的重要信息，但其局限在于仅依赖生长测量且仅得出单一的相互作用指数。本文所述方案在此基础上实现了进一步发展：不仅量化杀菌活性而非抑菌效果，还通过评估处理后的再生长情况以判断抗菌作用的持续性，同时涵盖双组分及三组分杀菌剂-植物化学物（或多种植物化学物）组合的评价，采用Chick-Watson和Weibull模型对消毒动力学进行建模，并利用Combenefit软件进行浓度-反应曲面分析。这一多维度策略使得对杀菌剂-植物化学物增效作用的评估更加稳健且具备预测能力。

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方案

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注意：所提出的方法学改编自欧洲标准 EN 127653。

1. 培养物制备

  1. 将测试的细菌菌株，即大肠杆菌（Escherichia coli）CECT 434 和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CECT 976，用含30%（v/v）甘油的冻存管在-80 °C条件下进行冷冻保藏。
  2. 复苏时，将细菌接种于平板计数琼脂（PCA）平板上，在25 °C培养24小时，通过恒温培养使细菌生长。
  3. 通过从划线平板上挑取单个菌落接种至胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，培养过夜，使目标菌株进入对数生长期（依据后续步骤获得的校准曲线），并在25 °C、100 rpm振荡培养箱中培养，制备过夜培养物。
  4. 使用分光光度计，在前述培养条件下，测定各细菌菌株的菌落形成单位（CFU）/mL 与600 nm处光密度（OD600）之间的校准曲线。
    1. 在25 °C、100 rpm振荡条件下，于TSB中培养过夜细菌培养物。
    2. 用无菌生理盐水（0.85% w/v NaCl）对培养物进行10倍系列稀释。
    3. 使用分光光度计测定各稀释液的OD600值。
    4. 将适当稀释度的菌液涂布于PCA平板上，在25 °C培养24小时。
    5. 选择菌落数在10至100之间的平板，确定对应的CFU/mL数值。
    6. 在校准线性范围（0.04–0.8）内，将CFU/mL值与相应的OD600读数进行作图。
    7. 至少进行两次独立实验，每次至少设两个重复。进行线性回归分析，获得校准方程。
    8. 利用所得方程估算后续实验中的细菌浓度。
  5. 将接种物在3772 ×g条件下离心10分钟，并用磷酸盐缓冲液（PBS）（NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4 1.44 g/L，KH2PO4 0.24 g/L）洗涤一次。
  6. 使用分光光度计，将接种物在PBS中的OD600调整至相当于1 × 108菌落形成单位（CFU）/mL的浓度。

2. 分子溶液的配制与对照

  1. 按如下方式考虑受试分子的选择、研究和制备：使用两种生物杀灭剂——BAC 和 PAA（15% (w/v)），以及两种植物化学物质——SAL 和 EUG（99%）。
    注：本研究选择 BAC，因为它是广泛使用的季铵盐类化合物（QAC），可通过破坏细胞膜有效杀灭细菌54,55。过氧乙酸（PAA）是一种广谱氧化性消毒剂，正越来越多地用于医疗器械的灭菌56,57。水杨酸（SAL）是一种具有研究价值的酚类化合物，因其具有抗菌和抗生物膜活性，并可影响细菌的毒力及抗生素耐药机制，提示其在消毒和微生物控制方面具有潜在应用价值58,59。丁香酚（EUG）是一种天然萜烯类/酚类芳香化合物，具有公认的抗菌特性，可作为比合成消毒剂更安全、更环保的替代品60,61。
  2. 用超纯水新鲜配制 BAC 和 PAA 溶液。
  3. 将 EUG 和 SAL 溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，确保细胞所接触的 DMSO 浓度始终不超过 5%。
  4. 根据表1配制所测试浓度的 BAC、PAA、EUG 和 SAL 溶液。
  5. 在 15 mL 离心管中通过调节储备液和细胞悬液的体积，配制所需测试浓度，以获得目标终浓度的分子和细胞密度。
  6. 在所有后续实验中，设置两个阴性对照：(i) 未经处理的细菌；(ii) 暴露于 5% DMSO 的细菌（因该浓度为实验过程中细胞所接触 DMSO 的最高浓度）。

3. 细菌接触杀菌剂或植物化学物质

  1. 将1 mL细胞悬液加入1 mL超纯水中，静置2分钟。
  2. 然后加入8 mL杀菌剂或植物化学物质溶液（溶于超纯水或5% DMSO中），在摇床培养箱中于100 rpm、25 °C条件下孵育30分钟。
  3. 通过涡旋振荡使化合物与细胞充分混匀。

4. 中和、连续稀释与涂布

  1. 采用稀释-中和法及通用中和剂，对每种测试浓度下的每种杀菌剂或植物化学物质进行中和处理，通用中和剂成分为：30 g/L 吐温80、30 g/L 洁尔灭、1 g/L L-组氨酸、3 g/L 卵磷脂和 5 g/L 硫代硫酸钠，溶于 0.0025 M 磷酸盐缓冲液中。
  2. 将 1 mL 待中和的样品加入 8 mL 通用中和剂和 1 mL 超纯水中53。
  3. 通过将 100 μL 特定稀释液加入 900 μL 无菌生理盐水中进行十倍系列稀释（从 10-1 到 10-7 依次重复），然后根据滴板法62，将每种稀释液各取 10 μL 点样于 PCA 培养基上，测定中和后样品中的存活细胞数。
  4. 将平板在 25 °C 下静置培养 24 小时，用于细胞计数。
  5. 对含有超过 10 个且少于 100 个菌落的平板进行目视计数，将导致可培养性完全丧失的最低浓度记录为最小杀菌浓度（MBC）。根据公式 (1) 计算CFU/mL，其中n为计数的菌落形成单位数，SV为点样体积（0.01 mL），Dil为计数时对应的稀释倍数。
    CFU/mL = n/(SV × Dil) (1)
  6. 根据公式 (2) 计算对数值减少量（log reduction），其中X0 和 X 分别为未经处理（对照组）和经处理后细菌的 CFU/mL。
    log reduction = log (X0) - log (X) = log (X0/X) (2)

5. 双联和三联组合评估

  1. 采用上述方法评估一种杀菌剂与一种植物化学物质（双联组合）或两种植物化学物质（三联组合）所有可能的双联和三联组合的活性，以寻找可能的增效或协同作用。
  2. 浓度选择如下：双联组合中，苯扎氯铵（BAC）测试浓度为 0.1、0.5 和 0.75 mg/L；过氧乙酸（PAA）为 0.1、0.3 和 0.5 mg/L；水杨酸（SAL）为 50、100 和 250 mg/L；丁子香酚（EUG）为 100、250 和 750 mg/L（表1）。三联组合中，BAC 测试浓度为 0.75 mg/L；PAA 为 0.5 mg/L；SAL 为 100 和 250 mg/L；EUG 为 250 和 750 mg/L（表1）。
  3. 选择浓度时，应选用在单个分子剂量-反应实验中评估后未产生杀菌效果的浓度。

6. 细菌再生长评估

  1. 为评估细菌的再生长能力，在处理并中和后，将微生物细胞置于液体培养基中，在 25 °C、100 rpm 条件下培养超过 24 小时。
  2. 进行十倍系列稀释，采用相同的技术和条件进行涂布、PCA 平板的培养，并定量测定 CFU/mL。

7. 联合用药结果的解读——部分杀菌浓度指数（FBCI）

  1. 按如下方式解释组合分析的结果：
    1. 对于双重组合，FBCI = FBC(A) + FBC(B)，其中A的分数杀菌浓度FBC(A)为A在双重组合中的MBC与A单独使用时的MBC之比（MBCA combination/MBCA alone），FBC(B)为B在双重组合中的MBC与B单独使用时的MBC之比（MBCB combination/MBCB alone）（公式3）。
    2. 对于三重组合，FBCI = FBC(A) + FBC(B) + FBC(C)，其中FBC(A)为A在三重组合中的MBC与A单独使用时的MBC之比（MBCA combination/MBCA alone），FBC(B)为B在三重组合中的MBC与B单独使用时的MBC之比（MBCB combination/MBCB alone），FBC(C)为C在三重组合中的MBC与C单独使用时的MBC之比（MBCC combination/MBCC alone）（公式4）。
    3. 根据Fernandes等人提出的分类方法50，FBCI ≤ 0.5 对应协同作用，0.5 < FBCI ≤ 1 表示相加作用，1 < FBCI ≤ 4 归类为无关作用，FBCI > 4.00 被视为拮抗作用。
      FBC(A) + FBC(B) = (MBC dual combination/MBCA alone) + (MBCB dual combination/MBCB alone) (3)
      FBC(A) + FBC(B) + FBC(C) = (MBCA triple combination/MBCA alone) + (MBCB triple combination/MBCB alone) + (MBCC triple combination/MBCC alone) (4)

8. 时间响应实验的操作步骤

  1. 制备过夜培养物 E. coli CECT 434 和 S. aureus 根据先前所述的生长条件（第1节）培养CECT 976。
  2. 将1 mL细胞悬液加入1 mL超纯水中，静置2分钟。随后加入8 mL杀菌剂/植物化学物质溶液（溶于超纯水或5% DMSO中），使每种分子达到目标浓度：1/4 × MBC 和 MBC，并根据细菌悬液的OD值进行调整，在25 °C、100 rpm条件下孵育。通过涡旋振荡使分子与细胞充分混匀。
  3. 评估以下曝光时间：1、3、5、15、30、45、60 和 90 分钟。
  4. 如第4节所述，通过计算log (CFU/mL)减少值来评估抗菌活性，即log (X/X0).
  5. 采用稀释-中和法及通用中和剂，按照第4节所述的连续稀释与涂布平板方法，对每一对测试的浓度/时间组合进行杀菌剂或植物化学物质的中和处理。

9. 使用 Combenefit 软件分析组合数据

  1. 打开提供的文件“REPLICATE_TEMPLATE.xls”，网址为：https://sourceforge.net/projects/combenefit/files/ ，以确保正确的结构和格式。
  2. 根据 补充表1， 其中：
    1. 增加 从上到下（从编号最低的行到编号最高的行）为产品A设置浓度。产品A至少应包含三种不同浓度。
    2. 从左到右（从编号最低到编号最高的列）逐步增加产品B的浓度：产品B至少应包含三个不同的浓度。
    3. 代表第一行（0 mg/L 产品A）的单一试剂产品B。
    4. 代表第一列（0 mg/L 产品B）的单一试剂产品A。
    5. 将 (0,0) 孔设为未经处理的对照。
    6. 对每种情况所使用的数值进行归一化处理，使用 方程 (5)，其中的 处理_0小时 是特定处理后立即（0小时）的 log (CFU/mL)； 处理24小时 是特定处理后24小时（再生长）的对数值（CFU/mL）； 对照_0小时 是相应对照组（仅细胞或细胞暴露于5% DMSO）在暴露后立即（0 h）的log (CFU/mL)； 对照_24小时 相应对照组（仅细胞或细胞暴露于5% DMSO）在暴露后24小时（再生长）的CFU/mL对数值
    7. 在所有情况下，将样品接种于PCA培养基后，经24小时培养，进行菌落形成单位（CFU）计数。
      (treat_0h - treat_24h)/(control_0h - control_24h) × 100 (5)
      注意：应包含定义100%存活率的对照/未处理条件，以及定义最大抑制率的阳性对照（可选）；仅使用数字，不使用公式；在重复实验中保持行数和列数一致；小数点使用英文句点“.”。
  3. 将文件另存为 .xls 或 .xlsx 格式。
  4. 为每个重复组创建一个 Excel 文件，具体方法如前所述。 补充表1，并将所有文件添加到同一文件夹中。
  5. 打开软件 Combenefit（Cancer Research UK Cambridge Institute，剑桥，版本 2.021，可从 https://sourceforge.net/projects/combenefit/ 获取）。
  6. 将该文件夹上传至 Combenefit。
    1. 打开 Combenefit 软件
    2. 选择项目文件夹 并选择正确的文件夹。
    3. 选择参考模型：Loewe加和性模型（假设两种产品作用机制完全相同）、Bliss独立性模型（假设两者作用相互独立），或HAS模型（一种保守模型，将联合效应与最佳单药效应进行比较）。最佳实践是至少运行两种模型，并从中选择最优模型。
    4. 在此情况下，鉴于所测试分子的作用机制，选择了Bliss模型。
    5. 选择所需的图形输出，注意必须至少再选择一项以生成协同分布图。
    6. 按压 运行分析 (补充图1提示：在“选择分析期间保存内容”窗口中，选择“全部”以将所有生成的图形结果保存到原始文件夹中。

10. 将 Chick-Watson 模型和 Weibull 模型应用于剂量-反应和时间-反应数据

  1. 在导入前通过 Excel 或 CSV 格式化数据集以准备数据：对于剂量-反应数据，A 列对应剂量（浓度，mg/L），B 列对应 log (X/X₀)；对于时间-反应数据，A 列对应时间（分钟），B 列对应 log (X/X₀)。
  2. 将文件保存为 `.csv` 格式，或直接复制粘贴到 Prism 中。
  3. 打开 GraphPad Prism（所用版本：Windows 11 系统下的 9.0 版；La Jolla, California, USA）。
  4. 在新建表格和图表中，选择 XY；在数据表中，选择将数据输入或导入新表格 (补充图2).
  5. 在选项中，X 轴选择“数字”，Y 轴选择“将重复值输入并列的子列”，然后点击创建 (补充图2).
  6. 在X轴输入剂量/时间数据，在Y轴输入对数生存数据。
  7. 前往“分析”，选择“非线性回归（曲线拟合）”，选中要分析的数据集，然后点击“确定”补充图2).
  8. 选择“新建”，然后创建新方程式。
  9. 在方程中，对于方程类型，选择显式方程：Y 为 X 和参数的函数；名称填写 Chick-Watson 模型/Weibull 模型；在定义中填写 Y = -a*x^(n)*30 Chick-Watson 模型 (补充图3）以及威布尔模型（Weibull Model）中的 Y = -1/(2.303)*(x/a)^(b)补充图4).
    注意：Chick-Watson 模型的表达式为 公式 6, 其中 X0 和 X 分别为未经处理的细菌（对照）和经处理的细菌的CFU/mL， C 是浓度（剂量）， k分离 是失活速率系数， C 是浓度（剂量），n 是浓度指数，且 t 是曝光时间（在此情况下为 30 min）50采用 Chick-Watson 模型观察剂量-反应关系，并表征消毒剂浓度与微生物灭活之间的关系。
    log (X/X₀) = -k分离 · Cⁿ · t (6)
    注意：Weibull 模型的表达式为 方程 7，其中 X0 和 X 分别为未经处理的细菌（对照）和经处理的细菌的CFU/mL， t 是时间， α 是尺度参数（特征时间），以及 β 是形状参数50应用威布尔模型观察时间-反应关系，并表征存活曲线的形状。尺度参数表示失活的特征时间，而形状参数描述对数线性行为的偏离程度。β = 1 对数线性； β < 1 末端加尾； β > 1 个肩部。
    log (X/X0) = -1/2.303 (t/α)^β (7)
  10. 在 初始值的作用，为每个参数选择 0 作为初始值，并将（初始值，待拟合）设为规则 (补充图5).
  11. 保持其余设置为默认值，然后点击“确定”。
  12. 运行拟合并检查估计的参数。

11. 生物学重复

  1. 对于所有检测，至少进行两次独立实验，每次实验至少设置两个重复样本。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究评估了所测试的四种化合物——BAC、PAA、SAL 和 EUG——的杀菌活性 E. coli CECT 434 和 S. aureus CECT 976。如图所示 图1 和 图2BAC、PAA、SAL 和 EUG 对可培养性表现出明显的浓度依赖性效应。 表2 展示了受试分子在暴露后以及暴露后24小时（再生长能力评估）的最小杀菌浓度（MBC）值。对于BAC，在3 mg/L浓度下未观察到菌落形成单位（CFU）（约减少6 log CFU/mL），两种情况下均如此 E. coli 和 S. aureusPAA 在 1 mg/L 时对两种细菌均实现了完全灭活。在植物化学物质中，SAL 在 500 mg/L 时对细菌表现出完全的杀菌活性 E. coli 和 S. aureus，而EUG分别需要1000 mg/L和1700 mg/L才能达到类似效果（

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究中所述的实验方案提供了一个综合框架，用于评估两种常用生物杀灭剂——BAC 和 PAA——以及两种具有潜力的植物化学物质——EUG 和 SAL——单独使用及联合使用（双联和三联组合）对 E. coli 和 S. aureus 的杀菌活性。该方案中的多个步骤对于确保实验的可重复性以及对抗微生物相互作用的准确解读尤为关键，包括细菌接种物的标准化、生物杀灭剂和植物化学物质溶液的精确配制与操作、作用时间与温度的严格控制，以及准确的菌落形成单位（CFU）计数，以用于后续的动力学建模和协同作用分析。该框架结合了传统的杀菌实验、再生长评估、组合测试和动力学建模，能够对即时和长期的抗菌效应进行系统且定量的表征。然而，为确保本方案的正确和高效使用，需考虑若干方面。首先，细菌接种物的标准化以及受试分子溶液的仔细配制对可重复性至关重要。BAC 易于非特异性吸附到聚合物实验器具和微塑料表面，因此用于定量实验的溶液应使用玻璃或低吸附性容器操作，并验证避免在聚丙烯或聚乙烯塑料中发生损失73,74。PAA 是一种强氧...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明，他们在撰写本文时不存在任何竞争性经济利益或利益冲突，且无任何事项需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由以下项目资助：InnovAntiBiofilm 项目（编号 101157363），由欧洲委员会（Horizon-Widera 2023-Acess-02/Horizon-CSA）资助；MultAntiBiofilm 项目（编号 COMPETE2030-FEDER00852000；编号 17121）和 HCAI_Disinfect 项目（编号 COMPETE2030-FEDER-00752300；编号 16360），通过竞争力因素运营计划（COMPETE）以及科学技术基金会（FCT）的国家资金资助；LEPABE 项目（UID/00511/2025，https://doi.org/10.54499/UID/00511/2025）和 UID/PRR/00511/2025（https://doi.org/10.54499/UID/PRR/00511/2025），以及 ALiCE 项目（LA/P/0045/2020，https://doi.org/10.54499/LA/P/0045/2020），由 FCT/MCTES（PIDDAC；葡萄牙里斯本）通过国家资金资助。Mariana Sousa 的博士奖学金（2023.00337.BD；https://doi.org/10.54499/2023.00337.BD）由 FCT 提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
苯扎氯铵 Merck, Spain8.14363.0100杀菌剂
Centrifuged Mega Star 600RVWR, USAVWR Mega Star 600R-
Combenefit - 版本 2.021英国剑桥癌症研究所，剑桥，英国-用于协同作用评估的软件
比色皿VWR, GermanyVWRI634-0678用于光密度调节的 1.5 mL 比色皿
蒸馏水--用于培养基制备
二甲基亚砜 (DMSO)VWR, France23500.322有机溶剂
一次性接种环VWR, ItalyVWRI612-935710 μL 接种环
Eppendorf 管VWR, ChinaVWRI525-11641.5 mL Eppendorf 安全锁扣管 
Escherichia coli西班牙标准菌种保藏中心 (CECT)434本研究中使用的参考菌株
乙醇VWR, France83813.36用于工作台面、材料及手部的消毒
丁香酚 99%Sigma-Aldrich, USA163333植物化学成分
Falcon 管VWR, USAVWRI525-108515 mL Falcon 管
Falcon 管VWR, BelgiumVWRI525-110950 mL Falcon 管
GraphPad Prism 9.0 for Windows 11La Jolla, California, USA-用于数学与统计分析的软件
卵磷脂Alfa Aesar, GermanyQ04A010-
L-组氨酸Merck, USA1.04351.0025-
轨道摇床培养箱VWR, USAVWR 5000I Incubating shaker 230V-
过氧乙酸 15%AppliChem, Germany143495-1211杀菌剂
培养皿VWR, ItalyVWRI391-0582-
移液器 1 - 10 mLVWR, USA-
移液器 100 - 1000 μLVWR, USA-
移液器吸头 100 - 1000 μLFrilabo, Portugal1-202-50-0-
移液器 20 - 200 μLVWR, USA-
移液器吸头 1 - 10 mLVWR, Belgiumvwri613-7094-
移液器吸头 2 - 200 μLVWR, Mexicovwri613-6418-
平板计数琼脂VWR, Belgium84608-0500用于微生物的分离与培养
聚山梨酯 80VWR, USA20E2756726-
氯化钾 - KCl VWR, Belgium11D110008-
磷酸二氢钾 - KH2PO4VWR, Germany26931.263-
水杨酸Sigma-Aldrich, USA84210-500G植物化学成分
皂苷VWR, Germany21A124103-
氯化钠 - NaClVWR, Belgium27788.297-
磷酸氢二钠 - Na2HPO4VWR, Belgium28026.26-
硫代硫酸钠 - Na2S2O3VWR, USA18D2056589-
分光光度计VWR, USAUV-1600PC Spectrophotometer用于光密度调节
Staphylococcus aureus西班牙标准菌种保藏中心 (CECT)976本研究中使用的参考菌株
胰蛋白胨大豆肉汤 Merck, Germany1.05459.0500用于微生物的分离与培养
超纯水--用于样品制备

参考文献

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