小鼠海马体中厚组织的冷冻电子断层扫描工作流程演示

摘要

该方案通过将高压冷冻（HPF）与华夫法、低温聚焦离子束（cryo-FIB）提取以及剂量对称的平行采集相结合，标准化了厚组织的冷冻电子断层扫描（cryo-ET），从而在小鼠海马体中实现均匀薄片和玻璃化样本，可重复原 位 分析。

摘要

低温电子断层扫描（cryo-ET）实现了原生细胞超微结构的三维可视化，但其在厚组织中的应用受限于缺乏可靠的玻璃化和低通量层片制备。这里呈现了一个端到端流程，利用带有铜箔的“华夫”组件实现高压冷冻（高压高压（约2100巴;解剖到冷冻时间≤90秒）预薄组织，进行冷冻FIB提取，并控制稀释至120–200纳米层状片，并进行过度倾斜补偿。导电涂层是标准化的（溅射-Pt 30 mA/15秒;GIS上限0.5–1.0微米）以减少幕布。自动化、剂量对称数据采集（0°、±3°、±6°......±60–66°;步长为2–3°;总剂量为100–150 e⁻/Ų） 通过 PACEtomo脚本实现，起始倾角由铣削角度和样品方向确定。使用 AreTomo 3 处理可近实时地进行运动修正、CTF 估计、对准和 WBP 重建;IsoNet可以选择性地减少缺失楔形各向异性。断层扫描平均法（RELION 4.0）采用伪断层扫描策略，分辨率报告基于FSC阈值0.143。该流程在小鼠海马体上演示，常规产生高玻璃化样品和均匀层状（靶厚150±40纳米），并实现高通量的倾斜系列采集（通常为每倾斜5–8分钟）。该方案为直接从复杂组织环境中原 位 结构生物学的研究提供了可重复的途径。

引言

冷冻电子断层扫描（cryo-ET）已成为可视化大分子复合物和细胞结构在其原生、水合态^{1、2、3、4、5}中的关键技术。通过从倾斜投影图像重构三维体积，冷冻外胚器弥合了细胞上下文与近原子分辨率之间的鸿沟，为原位结构生物学提供了前所未有的洞^见。虽然细胞标本⁷（包括悬浮液中的冷冻FIB稀释细胞和粘附细胞）的冷冻电子断层扫描工作流程已经成熟，但其直接延伸到厚实、结构完整的组织仍极具挑战性 ^8,9,10。这对含水量较高的组织如大脑¹¹尤为明显，因为可靠的玻璃化和电子透明层状片（通常<200纳米）的制备仍是持续的瓶颈¹²。

由于组织含水量高且传热有限，实现组织中的玻璃化具有挑战性。虽然沉浸冷冻对薄样品（≤20微米）¹³有效，但对大多数组织失败。高压冷冻（HPF）通过施加高压抑制成核，理论上可使样品玻璃化至约200微米。然而，传统高功率高功率（HPF）的效率通常不适合玻璃化组织。为改善结果，近期尝试采用了添加冷冻保护剂¹⁴和在^15,16进行预切片（例如使用振动器）等策略，在冷冻^11,17之前机械地减少样品厚度。虽然这些方法可以提升玻璃化质量，但通常需要长时间的体外处理和使用化学添加剂，这有可能改变天然结构。为解决这些限制，本研究修改了Kelley等人最初提出的“华夫”载体策略，加入了关键优化：在冷冻前用两块抛光铜载体物理压缩脑组织，预先稀释样品，同时将其固定在薄膜网格和铜箔之间。该设计不仅促进快速且均匀的玻璃化，还显著提升机械稳定性，从而有效防止网格断裂和后续处理过程中样品丢失，为获得完整且高质量的冷冻组织样本奠定了坚实基础。

玻璃化之后，稀释仍然是影响通量和质量的主要障碍。作为一种早期且广泛采用的技术，冷冻超微切开术促成了众多基础的原位结构研究。然而，它经常引入压缩和切割^{伪影，影响结构}完整性。相比之下，低温聚焦离子束（cryo-FIB）铣削²¹具有更优越的精度和最小的畸变^7,22。最初，冷冻FIB研磨直接应用于网格上的玻璃化样品以制备片状²³;然而，这种原位方法主要适用于薄样本^24,25（如培养细胞或外周组织区域），无法进入厚且厚重组织内的深层结构。为克服深度限制，开发了^{提取策略26}，实现样本内部特定地点提取兴趣区域（ROI）。后续方法学上的进步，包括序列提取²⁷和网格序列切片（SOLIST）²⁸，进一步提升了复杂组织中三维相关靶向的通量、层状稳定性和精度。近年来，该领域的创新不断推进，包括Tang等人提出的六面附着^法，该法在提升和减薄过程中增强机械稳定，以及Benjamin C. Creekmore等人提出的新型网格铣削^{方法，能够}在保留原生组织环境的同时实现深层结构的访问。尽管取得了这些进步，不同组织类型的方案在效率、重复性和适应性方面仍然存在差异。在建立一个标准化、易于复制且广泛适用的工作流程方面，存在一个关键的空白，该流程将这些优化整合成适用于不同厚组织的连贯流程。

这里通过综合既有方法的关键技术细节，并将其精炼成一个通用的端到端流程，来弥补这一空白。该方案不仅采用增强型高功率华夫法实现稳健玻璃化，还结合了一系列优化的低温FIB提取和稀薄步骤，如系统性过度倾斜补偿、标准化导电涂层和校准铣削序列，共同提升层片均匀性，减少伪影（如幕布），并提高通量。与针对特定细胞类型或模式生物定制的方案不同，该工作流程以普遍性为核心设计，提供了一个多功能框架，适用于各种厚重复杂组织，包括那些相对柔软且易受压的组织，超出了已演示的小鼠海马体。

在小鼠海马模型中得以验证，该模型易受冰损害和结构复杂性影响，这一集成且通用的工作流程可靠地产生高质量的层状（120–200 nm），并支持高效的倾斜系列采集（5–8分钟/串）。将最佳实践整合成一个连贯、易获取且广泛适用的方案，提供了一个可重复的框架，降低了在不同生物和生物医学背景下，在厚组织研究中实施冷冻外胚技术的技术障碍。

方案

所有涉及动物组织的操作均遵循SUSTech IACUC（SUSTech-JY202501019协议）。摄政员和所用设备列于 材料表中。

1. 样品支撑制备

1. 高功率功率载流子制备（见 图1A）
   1. 获取一对6毫米铜制高功率高功率载体（B型）。确保其中一个背带是平坦的。
   2. 先润湿载体平面，然后进行研磨。首先，使用8000号砂纸，直到原始的加工痕迹完全去除。然后切换到12000号砂纸，继续研磨，直到前一步的划痕基本消除，最终获得均匀光滑的表面。 图2 展示了研磨和抛光过程中承载体表面的典型图像。
   3. 用软金属织布和W0.5金刚石膏抛光地面：首先将糊涂在布上，然后以圆周运动抛光1–2分钟，直到获得光滑且高度抛光的表面。用乙醇彻底冲洗载体，然后用蒸馏水去除所有磨料残留物。
   4. 抛光载体在使用前至少浸泡在1-六晶中4小时（或过夜）。
      注意：抛光处理后的载体可浸没于1-六新世中储存。
      注意：1-六株十烯易燃且吸入有害;在排风柜里工作，配备个人防护装备。
2. TEM支持网格准备（见 图1B）
   1. 使用100网铜网格，并贴上连续的Formvar/碳支撑膜。
   2. 利用溅射涂层机对栅极两侧进行溅射涂层：将电流设为50毫安，并每侧涂覆120秒，以获得每边约6纳米的涂层。
3. 铜箔制备（见 图1C）
   1. 获得厚度为1微米的高纯铜箔。
      注意：铜的热导率随纯度变化，纯度越低，热导率越低。因此，需要高纯度铜箔（铜≥99.9%）。
   2. 用圆形打孔器将铜箔打成直径3毫米的圆盘。

2. 高压冻结

1. 在干净的玻璃表面放置一滴10微升的10%蔗糖溶液。
2. 快速解剖刚被安乐死的小鼠的海马体。使用锋利的剃须刀片切除约0.5–1 mm³ 的小组织碎片（见 图1D）。
3. 用牙签或细刷将组织转移到高压滤波载体内的铜支撑TEM网格（100格）。使用2-甲基丁烷（异戊烷）轻柔地将组织移位，同时尽量减少对网格的机械应力。
   注意：2-甲基丁烷（异戊烷）极易燃。在没有点火源的排气柜里处理。
4. 用直径3毫米的铜箔片覆盖纸质和网格。组装时，将第二个高压滤网（面朝下）放在顶部，形成密封的“华夫饼”三明治（见 图1E）。
   注意：铜箔在华夫饼组件中起着关键的机械作用。它将组织夹在TEM网格和箔片之间。组装过程中，这种结构施加温和压力，有助于形成更薄、更均匀的组织切片，非常适合玻璃化。此外，铝箔防止搬运时组织流失，并在高压冻结时帮助分散压力，降低电极断裂的风险。冷冻后，箔片还便于载流子与玻璃化样品网格的分离。然而，这种制备方法可能会引入机械压缩损伤，且可能不适合对压力诱导伪影敏感的样品。对于此类样品，应考虑采用在无压缩的情况下实现适当厚度的替代切割技术，如振动切片或样品冲孔。
5. 立即按照制造商的操作规范启动高压冷冻程序。将目标压力设定为~2100巴，并确保从组织剥离到冷冻的总时间不超过90秒。
   注意：从解剖到冷冻的整个过程应在90秒内完成，以减少因体 外 时间延长而产生的结构改变。大脑的组织厚度范围约为20–40微米。

3. FIB铣削与提拔

注意：使用配备冷冻阶段的双束显微镜执行以下步骤。始终保持样品温度低于-170°C。

1. 接收器栅的准备
   1. 获取一个新的300网格金网格，作为提拔过程的最终接收网格。
   2. 在室温下用立体显微镜轻轻夹入兼容的冷冻FIB自动网格环。
   3. 组装好的AutoGrid直接存放在保持约40°C的干式烤箱中，以减少霜冻积累。
      注意：在削减时，确保网格平整且居中，以防止弯曲或错位。
2. 玻璃化组织网格的取出与安装
   1. 在持续将组件浸入液氮（LN₂）时，小心地将玻璃化的TEM网格（包含组织和铜箔）与周围的“华夫”组件分离。
      注意：铜箔垫片通常使栅格与载体易于分离。
   2. 在预冷的低温加载工作站上，将分离的组织网格安装到第二个低温FIB AutoGrid环中，并采用LN₂保护。
3. 将网格共载到低温转运穿梭机上
   1. 将两个自动网格装入冷冻转移穿梭机的指定槽位。
   2. 将每个AutoGrid调整为铣削缺口朝外且垂直。
   3. 将装载的穿梭机保持LN₂浸没或预冷，直到转移到FIB/SEM显微镜中。
4. FIB/SEM中的定位与导电涂层
   1. 冷冻转移到显微镜后，以低放大的扫描电子显微镜（SEM）导航到组织网格。
   2. 在整个网格表面上涂覆导电和保护涂层。
      1. 在30毫安电下用铂（Pt）溅射涂层网格表面，持续15秒。
      2. 利用气体注入系统（GIS）沉积0.5–1.0微米厚的有机金属Pt帽。
      3. 在栅极表面以30毫安电流施加最后一层溅射涂层的Pt层，持续15秒。
         注意：GIS上限对于减少窗帘伪影至关重要。
5. 组织阻滞分离与脱离（参见 图3)
   1. 选址与定向
      1. 利用SEM电子束图像导航到组织网格中选定的兴趣区域（ROI）。
      2. 调整样品的方向以便前侧铣削。典型的级段位置设置为110°旋转、7°倾斜，此位置使样品表面呈现出适合离子束进入的角度。
         注意：在缺乏荧光标志物的情况下，可以采用预筛查策略。该策略旨在定位目标组织区域，排除含有低温保护剂或其他非组织成分的区域。在选择表面无冰的区域后，使用较高的光束电流（例如，30 kV时15 nA）在标准前侧朝向下铣削一个小型测试沟槽，并用较低的光束电流（例如，1 nA在30 kV）进行抛光。切换到电子束观察截面：组织在电子束下表现出极佳的对比度，这一特征在膜结构和富含重元素的区域中尤为明显;相比之下，低温保护剂在电子束下通常呈现均匀对比。这允许在进行完整拆除程序前快速验证。
   2. 隔槽铣削以隔离块体（图3A）
      1. 利用30 kV运行的离子束定义一个包围目标组织块的矩形沟槽。
      2. 在距离块体一定距离处开始铣削，使用相对较高的15 nA电流以实现快速去除材料。
      3. 当沟壁接近块体时，将离子束电流降低至7 nA。减少电流可以实现更精确的控制，并最大限度地减少离子束对目标区域生物材料的损伤和加热。
      4. 块的一侧可以作为“卡片”固定在大块材料上，暂时固定。
   3. 厚块可选的下切铣削（图3B）
      1. 对于估计厚度超过20微米的组织块，从背面进行下切铣削步骤，以便最终提取。
      2. 旋转级（例如至-70°），并调整级倾斜角度（例如23°）以接触发动机块底部。
      3. 用30 kV电流和3 nA电流的FIB铣削底部连接。
   4. 微操作手针的连接（图3C）
      1. 将样品连接到针上时，需进行顺序的截面铣削图案。
         注意：金块可以从300网格的金格条中提取。
   5. 组织块的抬升（图3D）
      1. 用FIB（30 kV，1 nA）切断连接块体和散装样品的剩余“卡片”。
      2. 小心地操作微型机械臂，抬起已分离的组织块，使其完全脱离沟槽和周围原始网格。然后，收回针头，将块体运送到接收器网格。
   6. 块体转移、焊接与重新涂层
      1. 引导指针到预冷的300网金接收器网格。
      2. 将方块放到选定的网格上。将组织块与网格上的薄膜接触，然后垂直抬起组织块以切断接触。利用离子束（30 kV，1 nA）从块体上铣削出约3–4微米厚的切片到网格薄膜上（见图3E）。
         注意：如果存在冰屑，请用矩形图案（30 kV，50 pA）预先清洁附着点。确保块体与网格薄膜接触，以减少静电荷，否则可能会随机移位切片。
      3. 通过铣刨在结点两侧（30 kV，30 pA）（见图3F）进行切割，确保切片牢固。
      4. 按照步骤3.4.2（图3G）中描述重新涂抹导电/保护涂层。
         注意：对于此GIS电镀步骤，时间可根据区块大小缩短。
   7. 层状变薄
      1. 旋转级（例如至-70°），设定初始级倾斜（例如15°）（见图3H）。
         注意：样品架预倾斜为45°。
      2. 确定组织块光滑区域内的最终层状结构位置。
         注意：确认所选区域无冰污染。
      3. 使用表1中指定的离子束电流进行系统性铣削。随着接近目标平面，水流从高向低推进（图3I，J）。可选地，当距离片片1–2微米时，可切割约1.5微米处的应力缓解沟槽，以防止片片^30,31的弯曲或弯曲。
         注意：当剩余材料距离目标平面不超过~1微米时，限制每次去除的厚度。

4. 冷冻外星外质电能数据收集

1. 在成功制备片片后，将栅极小心地装入配备冷冻支架、能量滤光器和断层扫描软件（如SerialEM）的透射电子显微镜（TEM）。
2. 获取整个网格的图谱图（例如图 4A;典型放大倍率为155×）。
3. 导航到片状角位置并获取拼贴图（例如图 4B;典型放大倍率为3600×焦距为-100微米）。
4. 设置标称的录制放大倍率，并验证像素大小是否适合预期分辨率;本研究中使用了2.109 Å的像素尺寸。调整相应的照明参数，包括斑点大小、C2孔径和照明面积，以实现直接电子探测器的优化剂量率。
5. 配置聚焦和试验照明条件，使其与记录参数设定的条件相匹配。
6. 使用PaceTomo scripts³²进行数据收集，步骤如下：
   1. 使用导航器的“添加点”功能预选蒙太奇地图上的目标，确保第一个特征展现足够的对比度。
   2. 使用PACEtomo_selectTargets.py脚本³²选择目标，必要时调整预览放大倍率的重点区域。典型的关注区域如图4C所示。
   3. 使用剂量对称方案获取倾斜序列（例如，0°、+3°、-3°、+6°、-6°......最大可达±60°–66°），增量为2°或3°。在 PACEtomo.py 脚本中设定采集参数：起始倾角由步骤 3.7.1 中指定的铣刨角度确定（即 8°），其符号依赖于冷冻电显机中的样品装载方向;最小和最大倾角指的是绝对值;步长对应倾斜增量（例如3°）。
      注意：此起始倾斜角旨在将层块水平且垂直于电子束定位。如果铣刨角度未知，倾斜图像以显示片片的最大视高;这样可以提供足够准确的对齐。
   4. 保持所有倾斜点的累计电子剂量为100–150 e⁻/Ų。如果有，使用狭缝宽度为10 eV的能量滤波器。
   5. 启动数据采集。每个倾斜角度都实现了自动对焦和跟踪功能。单次倾斜系列的典型获取时间为5–8分钟。
      注意： 表2提供了故障排除指南。

5. 数据处理

1. 使用AreTomo 3³³处理倾斜系列运动修正、CTF估计、对准和3D断层图重建图像，执行三个核心步骤：（1）原始图像帧的运动校正，（2）每个倾斜图像的对比度传递函数（CTF）估计，以及（3）完整倾斜序列的对齐。
   1. 比对后， 通过 加权回投影算法重建三维（3D）断层图。此步骤所需的输入包括：原始图像帧、mdoc元数据文件（记录倾斜系列采集参数）以及样本预定的旋转轴。
2. 缺失楔形修正
   1. 重建后，对生成的断层扫描进行IsoNet³⁴缺失楔形校正。
3. 粒子选择与策划
   1. 在EMAN 2.9³⁵ 中使用模板匹配方法进行粒子选拔。自动筛选后，人工排除了假阳性（即非目标区域或错误选择区域），以确保所选颗粒数据集的质量。
4. 断层扫描平均法
   1. 将倾斜系列及其对应的粒子坐标导入RELION 4.0。按照RELION 4.0文档（https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/STA_tutorial/Introduction.html）中描述的标准工作流程进行断层扫描平均，确保遵循既定的可重复性最佳实践。

结果

成功应用该方案可制备高质量的玻璃化组织片状结构，并随后重建可揭示原生细胞超微结构的断层扫描。以下结果，利用小鼠海马体组织展示，代表了一项成功的实验。

通过高压冷冻处理的“华夫”法组织块呈现出均匀且电子透明的外观（图4B，C）。完全玻璃化样品未显示结晶冰相关的衍射对比。倾斜序列的功率谱显示出弥漫轮廓，没有冰结晶时明显的六角衍射环，验证了细胞水在玻璃态下的成功保存，这对高分辨率成像分析至关重要。尽管方案优化，厚组织标本的完全玻璃化仍是技术难题。在评估的四个区块中，有一个样本内部出现局部冰晶;相比之下，接触面持续显示出更有利的玻璃化结果。因此，组织操作和冷冻保护剂的应用需要进一步练习，同时还需要额外的筛查。

随后的冷冻FIB研磨可靠地从玻璃化组织块中获得层状。该工作流程展现了稳定的吞吐量，平均每12小时制备工作产生8片±2片可用片片。层状物的质量 通过 层...

讨论

本文所展示的工作流程建立了一个通用、优化且可重复的本地厚 组织冷冻 电子断层扫描流程。其主要贡献不在于发明单一技术，而在于系统集成、完善和详细标准化整个过程，从使用改良华夫高功率高功率法进行稳健玻璃化，到精确校准的低温FIB提取和稀释协议。该综合解决了在将冷冻ET应用于复杂组织时常遇到的关键重现性和可及性缺口。

关键步骤与协议优化
多项集成优化对工作流程的成功和可靠性至关重要。首先，增强型高压“华夫”法是基础，涉及一个关键修改：使用两个抛光铜载体在冷冻前物理压缩组织，从而预先稀释样品。组织被固定在带膜的网格上，上面覆盖一层铜箔以固定样本并防止丢失。该设计不仅促进快速且均匀的玻璃化，还显著提升了机械稳定性，有效防止网格断裂和后续处理过程中样品丢失，为获得完整且高质量的冷冻组织样本奠定了坚实基础。其次，低温FIB提取策略通过一系列经过校准的步骤执行。标准化导电涂层协议（三层溅射Pt/GIS-Pt/溅射-Pt）对于电荷耗散至关重要，关键是抑制非均质组织基质中的幕布...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-六十世	西格玛-奥尔德里奇	H2131	化学品与试剂
2-甲基戊烷	西格玛-奥尔德里奇	M65807	化学品与试剂
夹环	赛莫飞世尔科学	1131750;1188953	消耗品
铜箔	丰成金属材料	1 & micro;厚度为m。	消耗品
铜支持的TEM网格（100网格）	北京中晶闸科技有限公司	BZ10021b	消耗品
冷冻电磁	赛莫飞世尔科学	克里奥斯 G4	设备
冷冻纤维化	赛莫飞世尔科学	阿奎洛斯2号	设备
低温FIB自格网	赛莫飞世尔科学	1205101	消耗品
网格（UltrAufoil R 1.2/1.3 300 网格）	量子翼	阿尔特奥福伊尔	消耗品
高压冷冻柜	徕卡微系统	EM 冰	设备
高压载流子，铜	徕卡微系统	B型（6毫米）	消耗品
离子溅射涂层机	法定人数	Q150RS plus	设备
金相抛光膏	lab-testec	W0.5	消耗品
抛光布	戈拉尔	B00809	消耗品
砂纸	鹰牌砂纸	8000目，12000目	消耗品
立体显微镜	徕卡微系统	S9i	设备
蔗糖	西格玛-奥尔德里奇	200-334-9	化学品与试剂
倾斜系列采集软件	https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/	SerialEM 4.0.9	软件
倾斜串联对齐与重建软件	https://github.com/czimaginginstitute/AreTomo3	阿雷托莫3	软件
倾斜系列采集软件	https://github.com/eisfabian/PACEtomo	帕切托莫	软件
倾斜串联对齐与重建软件	https://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet	IsoNet	软件
倾斜串联对齐与重建软件	https://github.com/cryoem/eman2	EMAN2	软件
倾斜串联对齐与重建软件	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/index.html	雷利昂4	软件