厚组织冷冻电子断层成像工作流程在小鼠海马体中的应用

摘要

本方案通过整合高压冷冻（HPF）与华夫格法、低温聚焦离子束（cryo-FIB）拾取技术以及剂量对称平行采集，实现了厚组织样品冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的标准化，可获得均一厚度的薄片和玻璃化样品，从而实现可重复的 原位 小鼠海马体中的分析。

摘要

冷冻电子断层扫描（cryo-ET）可实现对天然细胞超微结构的三维可视化，但其在厚组织中的应用受限于缺乏可靠的玻璃化冷冻技术以及低通量的薄片制备方法。本文介绍了一种端到端的工作流程，该流程结合了高压冷冻（HPF；~2100 bar；从组织分离到冷冻时间≤90 s），采用带有铜箔的“华夫格”组装方式对组织进行预减薄，随后进行冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）取出及具有倾角补偿的可控减薄，获得厚度为120–200 nm的薄片。导电镀膜过程实现标准化（溅射铂，30 mA/15 s；气体注入系统帽层0.5–1.0 µm），以最小化帘幕效应。采用自动化、剂量对称的数据采集方式（0°, ±3°, ±6°…至±60–66°；步长2–3°；总剂量100–150 e⁻/Ų），结合基于深度学习的运动校正与对齐、相位板成像、300 keV冷冻透射电镜以及相位翻转加权，显著提升了信噪比。在人类胰岛中，该方法揭示了完整β细胞内微管的极性、突触样囊泡对接以及线粒体嵴的异质性。在小鼠大脑皮层中，观察到轴突中微管数量的梯度变化、突触前末端中与突触囊泡聚集相关的致密突起，以及少突胶质细胞突起内髓鞘的周期性结构。该工作流程支持在接近生理状态下对厚组织中细胞器与大分子复合物进行高分辨率三维分析。 关键词：冷冻电子断层扫描，高压冷冻，冷冻聚焦离子束，薄片制备，导电镀膜，剂量对称采集，深度学习，相位板，300 keV冷冻透射电镜，相位翻转加权，微管极性，突触样囊泡对接，线粒体嵴，髓鞘周期性结构，人类胰岛，小鼠大脑皮层²) 被实施 通过 PACEtomo 脚本，起始倾转角度由铣削角度和样品取向确定。使用 AreTomo 3 进行处理，可实现近实时的运动校正、CTF 估计、对齐和加权反投影（WBP）重构；IsoNet 可选择性地用于减少缺失楔形各向异性。子层析平均（RELION 4.0）采用伪子层析图策略，分辨率报告基于 0.143 的 FSC 截断值。该流程已在小鼠海马组织上得到验证，常规可获得良好玻璃化的样品和均一的薄片（目标厚度 150 ± 40 nm），并实现高通量倾转系列采集（通常每倾转系列 5–8 分钟）。本方案为研究提供了可重复的途径 原位 直接从复杂的组织环境中研究结构生物学。

引言

冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）已成为在天然水合状态下观察大分子复合物和细胞结构的关键技术^1,2,3,4,5通过从投影图像的倾斜序列中重建三维体积，冷冻电子断层扫描技术在细胞环境背景与近原子分辨率之间架起了桥梁，为结构生物学提供了前所未有的洞察。 原位⁶. 尽管冷冻电子断层扫描技术在细胞样本中的工作流程⁷ （包括悬浮细胞和贴壁细胞的冷冻聚焦离子束减薄样品）现已得到广泛应用，但将其直接拓展至厚实且结构完整的组织仍极具挑战性^8,9,10这一点对于脑等高含水量组织尤为明显¹¹，其中可靠的玻璃化冷冻及制备电子透明薄片（通常 <200 nm）仍然是持续存在的瓶颈¹².

方案

所有涉及动物组织的实验程序均符合南方科技大学动物护理与使用委员会（IACUC）的规定（方案编号 SUSTech‑JY202501019）。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 样品支撑物的制备

1. 高压冷冻载样器的制备（见图1A）
   1. 取一对6 mm铜制高压冷冻载样器（B型），确保其中一个载样器表面平整。
   2. 将载样器的平整表面润湿后开始研磨。首先使用8000目砂纸，直至完全去除原始加工痕迹；然后换用12000目砂纸继续研磨，直至上一步骤产生的划痕基本消除，获得均匀光滑的表面。图2展示了研磨和抛光过程中载样器表面的典型图像。
   3. 使用柔软的金相抛光布和W0.5金刚石抛光膏对研磨后的表面进行抛光：先将抛光膏涂于抛光布上，然后以圆周运动方式抛光表面1–2分钟，直至获得光滑且高度抛光的表面。随后用乙醇彻底冲洗载样器，再用蒸馏水冲洗，以去除所有磨料残留物。
   4. 将抛光处理后的载样器在1-十六碳烯中浸泡至少4小时（或过夜），方可使用。
      注意：抛光并处理后的载样器可长期保存在1-十六碳烯中。
      警告：1-十六碳烯易燃，吸入有害；操作时应在通风橱内进行，并佩戴个人防护装备（PPE）。<....

结果

成功应用本方案可制备高质量的玻璃化组织薄片，并进一步重建出揭示天然细胞超微结构的断层图像。以下结果均使用小鼠海马组织展示，代表了一次成功的实验。

采用高压冷冻“华夫饼”法处理的组织块呈现出均匀且电子透明的外观（图4B、C）。完全玻璃化的样品未显示出与结晶冰相关的衍射衬度。从倾斜系列图像获得的功率谱呈现出弥散的分布特征，未见尖锐的六边形衍射环，表明无冰晶形成，证实细胞内的水成功保存为玻璃态，这对于高分辨率成像分析至关重要。尽管实验方案已优化，厚组织样本的完全玻璃化仍是技术上的挑战。在评估的四个组织块中，有一个样本内部出现局部冰晶形成；相比之下，接触表面的玻璃化效果始终更为理想。因此，组织操作和冷冻保护剂的应用仍需进一步实践，并需要开展更多的筛选工作。

后续的冷冻聚焦离子束铣削可从玻璃化组织块中稳定地制备薄片。该工作流程表现出一致的通量，每次标准的12小时制备周期平均可获得8 ± 2个可用薄片。薄片质量通过以下方面进行评估 通过<.......

讨论

本文所述的工作流程建立了一种通用、优化且可重复的管道 原位 冷冻电子断层扫描技术用于原位厚组织的研究。其主要贡献并不在于发明单一的新技术，而在于对整个流程进行系统性的整合、优化和详细标准化，从采用改良的华夫饼式高压冷冻法实现稳定玻璃化，到精确校准的冷冻聚焦离子束提取与减薄方案。这一整合策略解决了在复杂组织中应用冷冻电子断层扫描时常遇到的关键性可重复性与可及性难题。

关键步骤与方案优化
多项集成优化对于工作流程的成功与可靠性至关重要。首先，改进的高压冷冻“华夫格”法是基础，其关键改进在于：在冷冻前使用两个抛光的铜载片对组织进行物理压缩，从而预先减薄样品。组织被支撑在带膜载网上，并在其上方覆盖一层铜箔以固定样品并防止丢失。该设计不仅促进了快速且均匀的玻璃化冷冻，还显著增强了机械稳定性，有效防止在后续操作中载网破裂和样品丢失，为获得完整、高质量的冷冻组织样本奠定了坚实基础。其次，冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）样品提取策略需通过一系列校准步骤执行。标准导电涂层方案（溅射铂/气体注入系统铂/溅射铂三层结构）对于电荷耗散至关重.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-十六碳烯	Sigma-Aldrich	H2131	化学试剂 &试剂与耗材
2-甲基戊烷	Sigma-Aldrich	M65807	化学试剂 &和试剂
夹环	Thermo Fisher Scientific	1131750;1188953	耗材
铜箔	冯成金属材料	1 µm 厚度	耗材
铜支撑透射电镜载网（100目）	北京中精科仪技术有限公司	BZ10021b	耗材
冷冻电镜	赛默飞世尔科技	Krios G4	设备
冷冻聚焦离子束	赛默飞世尔科技	Aquilos 2	设备
冷冻聚焦离子束自动网格	赛默飞世尔科技	1205101	耗材
载网（UltrAufoil R 1.2/1.3 300 目）	Quantifoil	AltrAufoil	耗材
高压冷冻仪	Leica Microsystems	EM ICE	设备
高压冷冻载网，铜	Leica Microsystems	B型（6 mm）	耗材
离子溅射镀膜仪	Quorum	Q150RS plus	设备
金相抛光膏	Lab-testec	W0.5	耗材
抛光布	GORAL	B00809	耗材
砂纸	Eagle Brand 砂纸	8000目，12000目	耗材
体视显微镜	Leica Microsystems	S9i	设备
蔗糖	Sigma-Aldrich	200-334-9	化学品 &试剂与耗材
倾转系列采集软件	https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/	SerialEM 4.0.9	软件
倾转系列图像对齐 &与重建软件	https://github.com/czimaginginstitute/AreTomo3	AreTomo 3	软件
倾转系列采集软件	https://github.com/eisfabian/PACEtomo	PaceTomo	软件
倾转系列图像对齐 &和重建软件	https://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet	IsoNet	软件
倾转系列图像对齐 &与重建软件	https://github.com/cryoem/eman2	EMAN2	软件
倾转系列图像对齐 &和重建软件	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/index.html	Relion 4	软件