一种基于大小富集牛乳腺上皮细胞及乳腺组织中脂滴的实验方案

摘要

本方案旨在通过连续离心实现脂滴的按大小分离与富集，从而准确、可重复地研究脂质代谢机制及与脂滴相关的生物学过程。

摘要

本方案描述了一种连续差速离心法，用于从牛乳腺上皮细胞（BMECs）和乳腺组织中富集不同大小的脂滴（LDs），从而实现超越传统整体脂滴分离方法的按尺寸分辨的分析。作为细胞内脂质代谢的动态调控中心，脂滴通过储存中性脂质（如甘油三酯和胆固醇酯）并协调其合成、水解和转运过程，发挥关键功能。它们在维持能量稳态、支持膜生物合成以及促进细胞信号转导中起核心作用。脂滴提取对于研究脂质代谢的调控机制至关重要。乳腺组织脂质代谢的研究对婴儿发育、人类健康、农业经济以及基础细胞生物学具有重要意义。因此，本文介绍了一种从BMECs和乳腺组织中提取脂滴的差速离心方法。与传统的整体脂滴分离方法不同，本方案通过依次调整离心力，实现基于尺寸的脂滴亚群富集。采用BODIPY493/503染色对脂滴组分的完整性及相对富集程度进行初步评估，为脂质代谢及相关脂滴过程的下游分析提供了一种实用且可重复的技术路径。

引言

脂滴（LDs）​是细胞内动态的细胞器，主要作为中性脂质的储存场所¹。脂滴的异常积聚与多种疾病相关，其影响范围不仅限于肥胖，还包括脂肪肝病²、心血管疾病³、糖尿病⁴和癌症⁵等。相反，脂滴数量不足也会产生严重后果，导致细胞能量储备丧失，并引发相应的功能障碍⁶。在农业经济学背景下，反刍动物体内脂滴不足可导致乳脂分泌减少，从而引发乳脂下降症，进而降低乳制品的营养价值和市场竞争力⁷。目前，脂滴代谢的调控已成为一个重要的研究领域。

自20世纪以来，脂滴（LDs）提取技术的发展始终致力于实现更高产量、更高纯度以及更好保持生物学活性的提取目标，这涉及方法学的持续建立与优化。目前，已有若干公司设计出用于脂滴分离的商业化试剂盒⁸。尽管这些试剂盒显著缩短了分离时间，且仅需使用常规离心机即可操作，但对于难以解离的样本，其试剂成分无法调整，实验步骤也难以进一步优化。此外，脂滴的提取在阐明疾病机制中发挥着不可或缺的作用，包括脂肪肝⁹、癌症¹⁰和神经退行性疾病¹¹等代谢性疾病的机制研究，可作为解析病理通路的多维探针。通过提取脂滴，还可解析其蛋白质和脂质组成，从而揭示脂滴生物学功能的多样性¹²。

乳脂的形成不仅仅是底物降解的过程，而是由乳腺上皮细胞执行的一种高度协调的脂质合成与包装过程¹³。奶牛乳脂的生成依赖于这些细胞的顶膜分泌机制：在内质网中合成的甘油三酯形成细胞质脂滴（LDs），随后被运输至顶膜，并通过出芽方式分泌。在此过程中，脂滴被来源于顶膜的乳脂球膜包裹，从而形成结构稳定的乳脂球¹⁴。牛乳腺是研究哺乳动物泌乳的经典模型，调控脂滴合成与分泌的核心机制在人类中高度保守¹⁵。建立从牛乳腺上皮细胞（BMECs）和乳腺组织中提取脂滴的方法，有助于连接畜牧业生产与人类健康研究。对提取的脂滴进行蛋白质组学和脂质组学分析，可进一步用于提高牛奶产量和质量，保障乳品的安全与品质。

本方法主要基于脂滴（LDs）的低密度特性，该特性使其在离心过程中漂浮至梯度液的顶部¹⁶。提取过程包括三个主要步骤：样品采集、超速离心以实现脂滴漂浮以及脂滴洗涤。在缓冲液中添加蔗糖（2.5 M）以保护脂滴，随后根据实验需求调整离心速度；通常情况下，较大的脂滴可在低于10,000 ×g的离心力下富集，而较小的脂滴则需采用更高的离心速度（高于10,000 ×g），因为在较高离心力下较大的脂滴可能发生破裂。最后，对提取的脂滴进行多次洗涤以防止污染，并使用BODIPY493/503染色初步评估提取纯度。

传统的脂滴分离方法主要实现对异质性脂滴群体的整体回收，限制了对依赖于大小的结构和功能差异的分析。本方案通过连续差速离心实现基于大小的脂滴亚群富集，扩展了常规方法，有助于研究脂滴的生长、 turnover、细胞内运输以及脂解或自噬途径对不同脂滴的差异性利用。该方法实现的是富集而非绝对纯化，由于脂滴大小呈连续分布且具有相似的物理性质，不同大小组分之间可能存在部分重叠。

方案

确定用于富集的目标脂滴大小（图1）。

1. 试剂准备

1. PBS：称取 8 g NaCl、0.2 g KCl、3.58 g Na₂HPO₄·12H₂O 和 0.24 g KH₂PO₄，溶于 800 mL ddH₂O 中。用 HCl 调节 pH 至 7.4，充分混匀，定容至 1 L。高压灭菌后，4 °C 保存，可保存长达 1 年。
2. 蔗糖溶液（2.5 M）：称取 856 g 蔗糖，溶于 400 mL ddH₂O 中。充分搅拌至蔗糖完全溶解，然后定容至 1 L。溶液经高压灭菌后，4 °C 保存，可保存长达 3 个月。
3. 缓冲液 A：称取 1.79 g Tricine，溶于 400 mL ddH₂O 中。用 KOH 调节 pH 至 7.8。pH 调节完成后，加入 50 mL 预先配制的 2.5 M 蔗糖溶液。充分混匀后定容至 500 mL。高压灭菌后，4 °C 保存，可保存长达 3 个月。
4. 缓冲液 B：分别称取 0.95 g HEPES、1.49 g KCl 和 0.038 g MgCl₂·6H₂O，加入 180 mL ddH₂O 中。用 KOH 调节 pH 至 7.4，充分混匀，定容至 200 mL。高压灭菌后，4 °C 保存，可保存长达 3 个月。
5. PMSF（1,000 倍，0.2 M）：称取 0.175 g PMSF，溶于 5 mL DMSO 中。避光保存于 -20 °C，可保存长达 1 年。
   注意：PMSF 具有高毒性，必须采取适当的防护措施。配制过程中需完全避光；PMSF 溶解较困难，可分装至 1.5 mL 微量离心管中。

2. 从细胞中提取脂滴

1. BMEC 细胞培养
   1. 从 -80 °C 冰箱中取出五管冻存的 BMEC 细胞，在 37 °C 水浴中快速解冻。完全解冻后，在 250 xg 条件下离心 4 分 30 秒。
   2. 用移液器弃去冻存液，加入 1 mL 含 10% FBS 的培养基重悬细胞，混匀后轻轻将细胞加入含有 6 mL 含 10% FBS 培养基的 100 mm 细胞培养皿中。轻轻晃动培养皿以确保细胞均匀分布，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。
   3. 在显微镜下观察细胞形态，当细胞融合度达到 80%–90% 时进行传代。
      NOTE： 在脂滴（LD）提取前，应确保细胞状态良好且数量充足，以提高提取得率和实验可重复性。
   4. 用移液器弃去培养皿中的原培养基，沿皿壁加入 1 mL PBS。洗涤两次后，每皿加入 1 mL 胰蛋白酶，在 37 °C 下孵育 3 分 30 秒。
   5. 在显微镜下观察细胞是否完全消化，消化完成后加入 1 mL 含 10% FBS 的培养基终止消化。用移液器轻轻吹打重悬细胞，转移至 2 mL 微量离心管中，在 250 xg 条件下离心 4 分 30 秒。
   6. 弃去上清液，重复步骤 1.2 的操作。
   7. 使用约 30 个培养皿或更大的培养容器扩增细胞，或使用更大规格的培养皿进行细胞培养。在提取前一晚加入 150 µmol/L t10,c12-CLA（用 DMEM 稀释）处理细胞。每 100 mm 培养皿使用 7 mL 培养基。培养时间取决于需要分离的脂滴大小。
      NOTE：根据前期优化结果，用 t10,c12-CLA 处理 BMEC 细胞 6 小时以富集大脂滴，或处理 12–24 小时以富集小脂滴。由于细胞内天然脂滴较少，通常需添加外源性脂肪酸以诱导脂滴积累。本研究中通过向培养细胞添加 t10,c12-CLA 来诱导脂滴积聚。
2. 样品收集
   1. 弃去原培养基，加入 1 mL 冰冷 PBS 洗涤 3 次。最后一次洗涤时不要弃去 PBS。以 30 个 100 mm 培养皿的细胞为例，将每 10 个培养皿的细胞收集至一个 15 mL 离心管中，每管约含 1×10⁸ 个细胞，共得到 3 个离心管。
      NOTE：在整个提取过程中保持所有样品温度 ≤4 °C，以防止脂滴中的蛋白质降解。
   2. 平衡后，在 1,000 xg、4 °C 条件下离心 10 分钟。
   3. 弃去 PBS，向离心管中加入 10 mL 预先配制的缓冲液 A 和 10 µL PMSF（1,000 倍稀释，0.2 M）。充分混匀后冰上孵育 20 分钟。
3. 细胞裂解与初步分级分离
   1. 使用探头式超声波匀浆器进行细胞破碎，采用脉冲模式（开启 5 秒，关闭 10 秒），在 30 分钟内累计有效超声时间为 10 分钟。使用直径为 3 mm 的探头，仪器功率设置为 40%（对应探头振幅约 76 µm）。
      NOTE：整个操作过程中需将样品置于冰上，防止过热。
   2. 将匀浆液在 3,000 xg、4 °C 条件下离心 10 分钟，以去除细胞核和细胞碎片。收集上清液作为核后上清液（PNS）。
4. 漂浮脂滴的超速离心
   1. 将上清液通过 100 µm 细胞筛过滤。
   2. 用移液器将 10 mL PNS 加入 15 mL 离心管中，依次在 PNS 上层加入 2 mL 蔗糖溶液（2.5 M）和 2 mL 缓冲液 B（可根据需要适当减少蔗糖体积并增加缓冲液 B 体积，以提高脂滴纯度），然后进行第一次离心（5,000 xg，4 °C，20 分钟）。
   3. 离心后，收集管顶乳白色奶油状的脂滴层。为收集脂滴，先在 1.5 mL 微量离心管中加入 100 µL 缓冲液 B，然后使用 20 µL 移液器多次轻柔吸取漂浮的脂滴层，尽可能多地收集脂滴。
      NOTE：脂滴在管顶形成漂浮的奶油层；应尽量避免吸入下层液体，以防污染。
   4. 进行第二次离心（10,000 xg，4 °C，30 分钟），并收集脂滴。
   5. 将溶液转移至适配摆桶转子的超速离心管中，盖紧管盖并平衡离心管。在超速离心机中进行第三次离心（50,000 xg，4 °C，40 分钟），并收集脂滴。
      NOTE：必须精确平衡离心管（至 0.0001 g），以确保超速离心机安全运行。
   6. 平衡后进行第四次离心（150,000 xg，4 °C，50 分钟），继续收集脂滴。可根据目标脂滴大小优化离心速度和时间。
      NOTE：长时间或重复的高速离心可能破坏脂滴结构。相比之下，在洗涤过程中采用短时间 10,000 xg 离心主要去除杂质，对脂滴完整性影响较小。该方法具有可调节性，针对不同细胞类型或组织可能需要进行优化。
5. 脂滴洗涤
   1. 将收集的脂滴用冰冷的缓冲液 B 重悬，在 10,000 xg、4 °C 条件下离心 5 分钟。
   2. 小心弃去上清液，使用相同体积的缓冲液、离心力和离心时间重复洗涤至少四次。对于小脂滴，可根据需要提高离心力以确保有效分离。
   3. 最后一次洗涤后，合并脂滴组分，轻轻混匀，并于 −80 °C 保存。
      ​NOTE：即使不可避免会损失部分脂滴，也不应省略洗涤步骤。应持续洗涤直至无可见的膜碎片残留。

3. 从组织中提取脂滴

1. 样品采集
   1. 从液氮中取出牛乳腺组织样品。称取5 g组织，置于冰上解冻，直至无冰晶残留。
   2. 用PBS或生理盐水冲洗组织。
   3. 使用手术剪将组织剪切成1-2 mm大小的碎片。
   4. 将剪碎的组织转移至预冷的研钵中，加入12 mL缓冲液A和10 µL PMSF（1,000倍稀释，0.2 M），在冰上研磨约10分钟。
   5. 将匀浆液在冰上孵育20分钟。
   6. 充分研磨后，将匀浆液收集至15 mL离心管中。
   7. 在2,500 xg、4 °C条件下离心10分钟。所得上清液为PNS。
2. 漂浮脂滴的超速离心
   1. 用100 µm细胞筛过滤上清液。
   2. 用移液器将10 mL PNS加入15 mL离心管中，依次加入2 mL蔗糖和2 mL缓冲液B。进行第一次离心（4,000 xg，4 °C，20分钟），收集呈乳白色、奶油状的物质。
   3. 进行第二次离心（7,000 xg，4 °C，30分钟），收集脂滴。
   4. 进行第三次离心（10,000 xg，4 °C，40分钟），收集脂滴。
   5. 将上清液转移至SW40离心管中，进行超速离心（50,000 xg，4 °C，50分钟），收集脂滴。
   6. 进行第五次离心（100,000 xg，4 °C，60分钟），收集脂滴。
3. 脂滴的洗涤
   参照细胞提取脂滴的洗涤方法。

4. 通过染色对脂滴纯度进行初步验证

1. 在避光条件下预先配制10 µg/mL的中性脂质荧光染料溶液（BODIPY: Buffer B = 1:100, V/V）。
2. 取适量混合脂滴（LDs）与Buffer B加入微量离心管中，在避光条件下加入适量中性脂质荧光染料溶液，充分混匀后孵育10分钟。
3. 准备干净的显微镜载玻片，将2.5 µL上述混合液滴加至盖玻片上，轻轻将载玻片覆于其上，避免产生气泡，随后在倒置荧光显微镜下观察。

5. 通过蛋白质印迹法验证脂滴纯度

1. 使用BCA蛋白检测试剂盒测定LD组分的蛋白浓度。
2. 进行Western blot分析时，将每个样品中的20 µg蛋白与5x SDS上样缓冲液混合，并在99 °C加热10分钟，以确保完全变性。
3. 随后，通过10%梯度聚丙烯酰胺凝胶进行SDS–PAGE，根据分子量分离蛋白质。
4. 电泳结束后，将蛋白质转移至预先活化的PVDF膜上，然后在室温下用5% BSA封闭1.5小时。接着，在4 °C下与一抗（包括兔抗Perilipin 2抗体（1:500）和兔抗β-actin抗体（1:5000））孵育过夜。
5. 用1x TBST洗涤膜三次，每次10分钟，然后在室温下与HRP标记的山羊抗兔二抗（1:5000）孵育1.5小时。
6. 再用TBST洗涤三次后，使用增强型化学发光（ECL）试剂盒检测蛋白条带，并通过凝胶成像系统进行可视化。

6. 暂停点与储存指南

1. 在超速离心前，将PNS置于冰上保存，时间不超过1–2小时。
2. 收集的脂滴（LDs）在洗涤前可置于冰上保存最多1–2小时。短期保存时，可在4 °C下储存脂滴，时间不超过24小时；长期保存时，应将脂滴储存在−80 °C，且冻融循环次数不得超过一次，以维持脂滴完整性。
3. 实验过程中所有暂停阶段，均需将样品置于冰上，并保持管盖封闭，以尽量减少污染。

7. 故障排除

1. 薄层漂浮物：调整缓冲液体积或离心力。
2. 漂浮效果差：提高离心速度或延长离心时间。
3. 污染：确保无菌操作并使用过滤后的缓冲液。
4. 脂滴破裂：将样品保持在冰上，降低离心力，或轻柔重悬。

结果

工作流程与方法学框架
建立了一个决策树示意图（图1），用于根据实验目标指导离心条件的选择。具体而言，采用 ≤10,000 ×g 的离心力富集大脂滴（LDs，≥2 µm），而使用 >10,000 ×g 的离心力富集小脂滴（<1 µm）。该框架为基于大小的脂滴分离提供了实用基础。从牛乳腺上皮细胞（BMECs）和乳腺组织中分离脂滴的整体工作流程如图2所示。尽管样本来源不同，该操作流程遵循标准化步骤，包括样本制备、细胞破碎和梯度离心，从而实现不同类型样本之间的一致性处理与比较。

脂滴分离的验证
在无血清条件下，细胞内脂滴较少；因此，使用外源性脂肪酸诱导脂滴积累。本研究中，t10,c12-CLA处理促进了细胞内脂滴的形成，通过明场和荧光成像在BMECs中观察到呈球形结构的脂滴（图3）。...

讨论

脂滴（LDs）是一类独特的细胞器，其特征是由磷脂单层膜包裹中性脂质核心。它们从内质网出芽形成，并能动态改变自身的大小和数量，促进细胞内物质运输以及与其他亚细胞结构之间的广泛交流，从而协调细胞脂质稳态^17,18,19。这种动态行为还受到系统性代谢信号的调控，例如胰岛素已被证实可协调葡萄糖与脂质代谢之间的交互作用，进而影响脂滴的周转及细胞能量平衡²⁰。脂滴广泛存在于多种生物体中，在从简单细菌到高等植物和动物的各类生物中均发挥主要的能量储存功能^1,21。根据其在真核细胞中的定位，脂滴可分为细胞质脂滴、核内脂滴和腔内脂滴^22,23。鉴于其与多种人类疾病密切相关，脂滴已成为细胞生物学...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200072	试剂
10% PAGE凝胶快速制备试剂盒	北京 BIOMAN	PG112	试剂
100 μm细胞滤筛	Beyotime	FSTR100	试剂
100毫米细胞培养皿	康宁	490167	试剂
Amersham Imager 600	GE Healthcare Life Sciences	600	设备
高压灭菌	松下	MLS-3751L	设备
BCA蛋白检测试剂盒	北京鼎国	BCA01	试剂
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	试剂
离心	Eppendorf		设备
DMEM	HyClone	SH30022.01	试剂
DMSO	Solarbio	D8370	试剂
胎牛血清	Gibco	2492319	试剂
HEPES	MedChemExpress	HY-D0857	试剂
HRP标记的AffiniPure山羊抗兔二抗	Proteintech	SA00001-2	试剂
KCl	HUSHI	20030666	试剂
KH2PO4	HUSHI	10017608	试剂
MgCl₂2	HUSHI	20059028	试剂
Na2HPO4·12H2O	HUSHI	S112623	试剂
NaCl	HUSHI	10019328	试剂
Omni-Easy即用型蛋白上样缓冲液	上海宜捷生物科技有限公司	LT101S	试剂
Omni-ECL 超敏化学发光检测试剂盒	上海酶之源生物医药科技有限公司	SQ201	试剂
PBS	HyClone	SH30256.01	试剂
青霉素 & 链霉素 100×	NCM Biotech	CLOOC5	试剂
pH计	METTLER TOLEDO	S220K	设备
移液器	Eppendorf		设备
PMSF	Coolaber	CP8651	试剂
PVDF 膜转移试剂盒	GenScript	eBlot L1	试剂
兔抗 Perilipin 2 抗体	Abcam	15294-1-AP	试剂
兔抗-β-肌动蛋白	Proteintech	20536-1-AP	试剂
研究级倒置荧光显微镜	Olympus	IX73	设备
蔗糖	Solarbio	S8271	试剂
SW 40 Ti 转子	贝克曼库尔特	331301	设备
反式-10, 顺式-12 共轭亚油酸	CAYMAN	90145	试剂
Tricine	Coolaber	CT11331	试剂
超速离心机	贝克曼库尔特	Optima XE-100	设备
超声波细胞破碎仪	SCIENTZ	JY92-11N	设备