通过遗传密码子扩展实现位点特异性赖氨酸乳酸化 E. coli 和哺乳动物细胞

摘要

本研究建立了一种利用遗传密码子扩展的方法，成功在大肠杆菌（Escherichia coli）和哺乳动物细胞中将乳酸化赖氨酸（Klac）定点引入人源烯醇化酶-1（hENO1）和超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）的特定位点。

摘要

乳酸化是一种新近发现的具有多种生物学功能的翻译后修饰（PTM）。自2019年首次被鉴定为巨噬细胞极化的调控因子以来，组蛋白乳酸化已成为连接细胞代谢与功能调控的关键桥梁。从生物化学角度看，该过程涉及乳酰基共价转移至赖氨酸残基，这一反应可通过使用乳酰辅酶A作为酰基供体的乳酰转移酶催化，或通过氨酰-tRNA合成酶（AARSs）经由乳酰-AMP中间体完成。通过这些机制，细胞内乳酸水平与蛋白质修饰及功能直接关联。乳酸化介导多种关键的细胞过程，从基因调控、DNA修复、代谢重编程和免疫调节等生理功能，到肿瘤进展和转移等病理过程。尽管蛋白质组学已鉴定出大量乳酸化位点，但通过突变技术实现特定位点的赖氨酸乳酸化仍具挑战性。为解决这一问题，我们采用遗传密码子扩展技术，利用特异识别乳酰赖氨酸的氨酰-tRNA合成酶（KlacRS）及其配对tRNA，精确地在指定残基位置插入乳酰赖氨酸（Klac）。该策略可生成均一乳酸化修饰的蛋白质变体，用于直接的功能研究。本文中，我们描述了一种简化的位点特异性蛋白质乳酸化实验方案，已在大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）和哺乳动物细胞中得到验证，并以人烯醇化酶-1（hENO1）和超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）作为模型系统。

引言

赖氨酸乳酸化（Klac）最初在组蛋白上被发现，现已成为连接异常肿瘤代谢与表观遗传调控的关键节点¹。肿瘤细胞中增强的有氧糖酵解导致乳酸积累，为乳酸化修饰提供了代谢基础，使乳酸不仅作为代谢副产物，更可作为信号分子直接调控蛋白质功能。越来越多的证据表明，乳酸化通过协调癌细胞增殖^2,3,4,5、转移⁶、代谢重编程⁷以及治疗耐药性^8,9，广泛参与肿瘤的发生与发展过程。

在表型水平上，升高的乳酸化修饰与肿瘤侵袭性的增强密切相关。例如，在透明细胞肾细胞癌（ccRCC）中，H3K18乳酸化通过上调血小板源性生长因子受体β（PDGFRβ）的表达，促进肿瘤细胞增殖和转移，从而在乳酸积累与致癌信号通路之间建立正反馈循环¹⁰。类似地，在结直肠癌（CRC）中，H3K18乳酸化水平升高可通过增强Rubicon样自噬增强因子（RUBCNL）的转录，促进自噬体成熟，支持癌细胞存活，进而驱动肿瘤进展¹¹。

除了对肿瘤侵袭性的直接作用外，乳酸化还通过调控代谢相关基因的表达和活性，介导肿瘤的代谢重编程⁷。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，组蛋白乳酸化下调糖酵解相关酶的表达，同时上调三羧酸（TCA）循环相关酶的表达，从而增强肿瘤细胞的葡萄糖摄取，并加剧代谢紊乱¹²。与此一致的是，全乳酸化组谱分析显示，乳酸化优先靶向参与中心代谢通路的酶，包括葡萄糖代谢、TCA循环、氨基酸/脂肪酸代谢等，且这些修饰与侵袭性肿瘤表型密切相关⁷。

重要的是，乳酸化修饰的生物学效应具有高度位点依赖性，这种修饰已成为肿瘤治疗耐药性的关键决定因素。在结直肠癌（CRC）中，减数分裂重组11蛋白（MRE11）的K673位点乳酸化可增强同源重组（HR）修复能力，从而导致对化疗药物和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抑制剂的耐药性¹³。在胶质母细胞瘤（GBM）中，醛脱氢酶1家族成员A3（ALDH1A3）与丙酮酸激酶M2型（PKM2）相互作用，促进乳酸生成，进而诱导X射线修复交叉互补蛋白1（XRCC1）的K247位点乳酸化，增强DNA损伤修复能力，从而驱动放疗抵抗和替莫唑胺（TMZ）化疗耐药¹⁴。这些研究共同表明，对特定赖氨酸残基上乳酸化修饰的精确调控，对于其机制解析和治疗靶向至关重要。

高分辨率质谱技术的进步揭示了乳酸化修饰广泛存在于代谢酶、转录因子和信号转导分子中，凸显其在调控代谢、信号转导和细胞生理功能中的广泛作用^15,16,17,18。迄今为止，已有数种催化乳酸化的“书写”酶被报道——例如，AARS1介导p53的乳酸化以促进肿瘤发生¹⁹，AARS1/2调控cGAS的乳酸化以抑制先天免疫——然而这些酶具有底物选择性，目前尚无法在任意蛋白质上实现完全位点特异性的乳酸化修饰²⁰。因此，该领域仍面临如何以定向方式操控Klac，以用于科研或治疗目的的挑战。

功能研究目前仍主要依赖定点突变技术——通常将赖氨酸（K）替换为谷氨酰胺（Q），以模拟酰基化赖氨酸修饰（如乙酰化或乳酸化）的非电荷状态^21,22,23,24。然而，这种方法在真实还原天然乳酸化状态方面存在显著局限性：谷氨酰胺的化学结构和侧链几何构型与乳酸化赖氨酸不同，更重要的是，当乙酰化和乳酸化可能发生在同一修饰位点时，K到Q的替换无法区分这两种修饰状态。

遗传密码扩展（GCE）通过在特定位置将非经典氨基酸直接引入蛋白质，为克服上述局限性提供了一种强有力的解决方案。通过对产甲烷八叠球菌（Methanosarcina mazei）吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（MmPylRS）突变体文库进行正向筛选，我们先前鉴定出一个依赖Klac生长的突变体。该突变体携带L301M、Y306L、L309A和C348F突变，被命名为KlacRS1^25,26。KlacRS1可将Klac特异性地连接至其对应的正交tRNA，识别并通读琥珀终止密码子，从而实现Klac在目标蛋白质中的高效、位点特异性插入。除KlacRS1外，已有多个能够介导Klac插入的aaRS变体被报道，包括来源于MbPylRS的LacKRS（L270I/Y271L/L274A/C313F）和LacKRS3（Y271M/C313S）^19,27，以及来源于MmPylRS的LacKRS（C348T/Y384F）²⁸。这些工具共同构建了一个多功能的遗传工具箱，可用于制备位点特异乳酸化修饰的蛋白质变体，以深入理解单个乳酸化事件所产生的生物学效应。

在我们之前的研究中，我们应用基于GCE的系统在大肠杆菌（E. coli）和哺乳动物细胞中表达了在Lys147位点特异性乳酸化修饰的ALDOA蛋白。功能分析表明，Lys147位点的乳酸化修饰对糖酵解具有负反馈调控作用，可增强ALDOA的热稳定性和化学稳定性，并促进其从细胞质向细胞核的转位。这些结果不仅揭示了ALDOA一种此前未被认知的调控机制，也验证了该位点特异性乳酸化平台的稳健性、通用性及实际应用价值^25,26。在此基础上，本文以人源烯醇化酶-1（hENO1）和超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）为典型示例，介绍一种利用正交KlacRS/tRNA系统实现精确Klac掺入的简化策略。

方案

1. 将乳酸化赖氨酸遗传编码至目标基因的琥珀终止密码子突变

1. 根据制造商的说明书，通过定点突变在 hENO1 基因的第89位和 sfGFP 基因的第149位引入TAG琥珀终止密码子，纯化PCR产物，并进行同源重组。使用以下引物：
   ENO1-K89TAG-F CACAGAACAAGAGtagATTGACAAACTGATGATCGAG
   ENO1-K89TAG-R TctaCTCTTGTTCTGTGACGTTCAGTTTCTTG
   sfGFP-N149TAG-F CAACAGCCATtagGTGTATATCACCGCCGACAAGC
   sfGFP-N149TAG-R CACctaATGGCTGTTGAAGTTATACTCCAGC
   注意：为了实现乳酸化赖氨酸的位点特异性插入，目标位点应突变为琥珀终止密码子（TAG），或其他无义密码子，而TAA或TGA应作为真正的终止密码子使用。
2. 将DH5α感受态细胞在冰上解冻，取5 µL重组产物与50 µL细胞混合，冰上孵育30分钟。在42 °C进行45秒热激处理，然后放回冰上孵育2-3分钟。加入350 µL LB培养基，在37 °C以220 rpm振荡培养1小时。
3. 将细胞涂布于预先温育的含氨苄青霉素的LB平板上，37 °C培养12-16小时。挑取两个单菌落进行Sanger测序，以确认突变。

2. 在 E. coli 细胞中表达乳酸化蛋白

1. 共转化50 µL的 E. coli DH10B 感受态细胞，分别加入约 100 ng 的 pBad-ENO1-K89TAG（编码目标基因）和 pEvol-MmKlacRS1（Addgene 质粒 # 232157，编码 KlacRS 和 tRNA 配对）。
2. 将混合物置于冰上孵育25分钟，42 °C热激45秒，再放回冰上3分钟。加入350 µL室温LB培养基，于37 °C以220 rpm剧烈振荡培养1小时。
3. 将细胞培养物接种到添加了100 µg/mL氨苄青霉素（Amp）的LB平板上₁₀₀）以及 50 µg/mL 氯霉素（Cm₅₀)。将培养板在37 °C孵育12–16小时。
4. 挑取单菌落接种于4 mL预培养液中，过夜培养。次日，将过夜培养物转接至400 mL LB/Amp培养基中扩大培养₁₀₀Cm₅₀ 然后在37 °C、220 rpm条件下剧烈振荡，直至OD600达到0.6–0.8。
5. 加入0.2% L-阿拉伯糖和1 mM Klac诱导，在30 °C、220 rpm条件下继续培养16 h。

3. 在 HEK 293T 细胞中对乳酸化赖氨酸进行遗传编码

1. 以每孔1 mL的DMEM培养基，将细胞以1 × 10⁵个细胞/孔的密度接种于12孔板中。孵育24小时后，当细胞融合度达到70%–80%时，进行转染。
   注意：转染推荐使用70%–80%的细胞融合度，而克隆形成实验则需要较低的接种密度，具体应通过实验经验确定。
2. 配制稀释的DNA溶液时，将0.75 µg的pcDNA-sfGFP-N149TAG和pNeu-KlacRS（Addgene质粒 # 232155）按1:1的比例加入38 µL无血清高糖DMEM培养基中。轻轻吹打3–4次或短暂涡旋以混匀。
3. 配制稀释的转染试剂时，将2.25 µL转染试剂加入38 µL无血清高糖DMEM培养基中。轻轻吹打3–4次以混匀。
   注意：是否可使用Opti-MEM取决于试剂生产商的说明，因其血清成分可能影响转染效率。
4. 立即将稀释后的转染试剂一次性全部加入稀释的DNA溶液中。
   注意：切勿以相反顺序混合溶液。
5. 立即轻轻吹打3–4次或短暂涡旋以混匀。室温孵育10–15分钟，使转染/DNA复合物形成。
   注意：转染/DNA复合物应在配制后20分钟内使用。
6. 将50 µL转染/DNA混合液逐滴加入各孔培养基中，并通过轻轻摇动培养板使混合均匀。
7. 转染6小时后，更换为含1 mM Klac的新鲜DMEM培养基，继续培养24–48小时。
   注意：根据我们先前的研究数据，1–5 mM浓度的Klac对细胞无明显细胞毒性²⁶。Klac的工作浓度应根据目标蛋白的表达水平进行优化。若目标蛋白易丢失乳酸化修饰，建议同时使用HDAC抑制剂（如曲古抑菌素A）或去乙酰化酶抑制剂NAM（烟酰胺）。

4. 乳酸化蛋白的His标签纯化 E. coli 细胞

1. 在 4 °C 条件下，以 6,900 × g 离心 10 分钟收集细胞。用 50 mL 裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，200 mM NaCl）重悬细胞。在冰上进行超声破碎，参数为脉冲 3 秒，间隔 8 秒，功率 200 W，总时长 30 分钟。在 4 °C 条件下以 13,800 × g 离心 30 分钟，收集上清液。
   注意：如果目标蛋白易受机械剪切力影响，可用适用于 E. coli 的商品化蛋白提取试剂温和裂解细胞，替代超声破碎步骤。
2. 将上清液通过 0.45 µm 滤膜过滤，收集可溶性组分。将澄清后的裂解液上样至 1 mL Ni-NTA 重力柱。用约 5 mL 缓冲液 A（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，200 mM NaCl， 
   5 mM 咪唑）洗涤，直至洗脱液中检测不到蛋白为止。用 1 mL 缓冲液 B（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，200 mM NaCl，200 mM 咪唑）洗脱 5 次，每次收集洗脱组分。保存所有组分，并通过快速 Bradford 法检测洗脱蛋白。
3. 合并纯化的蛋白组分，将其置换至储存缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl）中。将浓缩后的蛋白分装至各管，每管 50 µL，快速冷冻后于 -80 °C 保存，用于后续分析。

5. 乳酸化蛋白的生化表征

1. SDS-PAGE 和蛋白质印迹
   1. 通过 SDS-PAGE 分离蛋白质（90 V 电泳 20 分钟，然后 150 V 电泳 50 分钟）。用考马斯亮蓝染色凝胶，在微波炉中加热 15 秒，并在摇床（50 rpm，15 分钟）上用脱色液（40% 无水乙醇、10% 冰醋酸和 50% 去离子水）脱色。重复脱色步骤，直至蛋白质条带清晰可见。
   2. 将 PVDF 膜在甲醇中活化 1 分钟。按以下顺序组装转膜夹心结构：海绵、滤纸、凝胶、膜、滤纸、海绵。在预冷的缓冲液中以 250 mA 恒流转膜 1 小时。用 5% 脱脂奶粉封闭膜 1.5 小时，然后用 TBST 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
   3. 在 4 °C 下与一抗（Anti-His 1:10,000；Anti-L-Lactyl Lysine 1:1,000）孵育过夜。用 TBST 洗涤 3 次。
      ​注意：不同商业来源的抗体应通过实验确定最佳稀释比例。
   4. 室温下与兔二抗（1:10,000）孵育 1.5 小时。用 TBST 洗涤 3 次。使用化学发光法成像，并将数据保存至 Image Lab 软件中。
2. 质谱分析
   1. 进行完整分子量分析时，将蛋白质用含 0.1% 甲酸（FA）的水稀释至终浓度为 0.1 µg/µL，随后上样至超高效液相色谱（UPLC）系统。流动相由溶剂 A（含 0.1% FA 的水）和溶剂 B（乙腈，ACN）组成，流速为 0.3 mL/min。
   2. 使用高分辨四极杆-飞行时间（Q-TOF）质谱仪测定 hENO1-89Klac 的分子量，设定 m/z 范围为 300–2000。所有数据均使用 MassLynx 软件采集和处理。
   3. 进行蛋白质组学分析时，按照先前描述的方法，使用纳米流液相色谱系统连接配备分析器的高分辨三合一质谱仪分析消化后的细胞裂解液。流动相由溶剂 A（含 0.1% FA 的水）和溶剂 B（ACN/水，8:2，v/v）组成，流速为 300 nL/min。
   4. 在反相 C18 毛细管柱（75 µm × 250 mm）上以 90 分钟梯度分离肽段：3%–8% B（0–5 分钟）、8%–28% B（5–60 分钟）、28%–38% B（60–75 分钟）、38%–100% B（75–80 分钟）、100% B（80–90 分钟）。在 m/z 350–1800 范围内采集 MS1 谱图，分辨率设为 120,000，AGC 目标值为 4e5。通过高能碰撞解离（HCD）碎裂（碰撞能量 = 32%）生成 MS2 谱图，一级质荷比为 m/z 110，分辨率为 30,000，AGC 目标值为 5e4。
3. 流式细胞术分析
   1. 用预冷的 PBS 缓冲液洗涤细胞 2 次，每次洗涤后在 1,380 × g 离心 3 分钟。将离心后获得的细胞沉淀重悬于 500 µL PBS 缓冲液中，轻轻吹打混匀。将细胞悬液通过 300 目无菌纱布过滤，收集滤液至流式管中，以最大限度减少细胞聚集体在检测过程中的干扰。使用配备双激光器的流式细胞仪分析制备好的样品，相应荧光信号的激发波长为 405 nm，检测波长为 488 nm。

结果

We first evaluated the incorporation specificity of Klac into proteins in E. coli. The gene for human enolase 1 (hENO1) was engineered to contain an amber stop codon at residue K89 (hENO1-89TAG), and this construct was co-expressed with the orthogonal KlacRS and its cognate tRNA pair in E. coli. In the absence of 1 mM Klac supplementation, no full-length hENO1 was detected; by contrast, when 1 mM Klac was added to the growth media, full-length hENO1 containing Klac at position 89 (hENO1-89Klac)...

讨论

本文描述了一种在原核和真核细胞中实现Klac位点特异性掺入蛋白质的策略。通过在目标基因的特定位置引入琥珀终止密码子，并在宿主细胞中共表达正交的KlacRS/tRNA配对系统，可在活细胞内精确地将真正的乳酸赖氨酸（lactyl lysine）掺入蛋白质中，从而为研究乳酸化特异性生物学功能提供一种强有力的工具。

我们利用代表性功能蛋白hENO1和sfGFP作为模型系统，验证了该工作流程的可行性。hENO1是一种多功能糖酵解酶，可催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，参与多种生物学过程，包括细胞生长、缺氧适应、过敏反应以及免疫调节。值得注意的是，在肿瘤细胞中已鉴定出ENO1上的多个乳酸化位点，其中包括本研究所表征的K89位点，突显其作为转录抑制因子和肿瘤抑制因子的潜在作用。sfGFP是一种稳定的荧光报告蛋白，广泛用于活细胞研究中的标记与追踪。其第149位残基是一个允许非天然氨基酸位点特异性插入的许可位点，使sfGFP成为在不同生物学背景下可视化和验证遗传密码扩展系统的理想模型。通过本工作流程，我们成功在大肠杆菌（E. coli）中将Klac位点特异性地插入hENO1...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6*his，His标签重组单克隆抗体	Proteintech	84814-1-RR	一类特异性免疫球蛋白，靶向重组蛋白中的6×His标签（由六个连续组氨酸残基HHHHHH组成的短肽）。
ACQUITY UPLC系统	Waters		超高效液相色谱
抗L-乳酰赖氨酸兔单克隆抗体	PTM Biolabs	PTM-1401RM	一类特异性免疫球蛋白，靶向L-乳酰赖氨酸（Klac），即蛋白质的一种翻译后修饰（PTM）。
ClonExpress II一步克隆试剂盒	Vazyme	C112	基于简单、快速、高效的DNA无缝克隆技术，可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。
CytoFlex流式细胞仪	Beckman Coulter		具有高灵敏度检测和多色分析能力的流式细胞仪
DH10B	Biorabbit	EC005H-S	一种用于质粒转化、基因克隆和蓝白斑筛选的感受态细胞。
DH5α	Vazyme	C502	一种用于质粒转化、基因克隆和蓝白斑筛选的感受态细胞。
EASY-nano LC 1200系统	Thermo Fisher Scientific		用于分离高灵敏度、高分辨率复杂样品的纳米液相色谱系统
Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪	Thermo Fisher Scientific		一款旗舰级高端三合一液相色谱-质谱联用（LC-MS）系统
Phanta Max高保真DNA聚合酶	Vazyme	P505	一种兼具快速扩增能力和高保真性的高保真单酶
PolyJet	SignaGen	SL100688	PolyJet体外DNA转染试剂是一种高效的转染试剂，可确保有效且可重复的转染效果，同时细胞毒性较低。