本实验方案展示了一种深部颈淋巴管插管大鼠模型，可实现对头部区域淋巴引流的直接且定量的评估。该模型有助于深入分析中枢神经系统（CNS）来源的溶质、免疫细胞群体，以及靶向中枢神经系统的治疗药物的分布与清除情况。
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本文内容
摘要
摘要
淋巴液从中枢神经系统（CNS）通过一系列淋巴管（LVs）和淋巴结汇流至颈淋巴管。除了维持体液平衡外，这些淋巴管在运输多种物质中发挥关键作用，包括内源性代谢物、信号分子、免疫细胞以及小分子和大分子药物。这对于颅内（如脑）和颅外区域（如鼻腔和口腔）的生理稳态及免疫功能至关重要。脑部淋巴引流功能受损已 increasingly 被证实与多种神经及神经退行性疾病相关。颈淋巴管插管技术可实现头颈部及脑部引流淋巴液的采集，从而测定各类物质经淋巴系统运输的浓度与速率。此外，还可评估不同刺激因素（如药物、应激、创伤）和疾病状态（如脑卒中、感染、阿尔茨海默病）下这些参数的变化。本文介绍一种麻醉状态下建立的深部颈淋巴管插管大鼠模型，可在术后持续数小时收集淋巴液。该方法可与成像技术和多组学技术联合应用，用于检测淋巴液中多种目标参数，有助于开展头颈部区域的基础生理与病理生理研究，以及药物的药代动力学/药效动力学研究，尤其适用于中枢神经系统疾病治疗药物的评估。
引言
遍布全身的淋巴系统对于维持体液稳态、调节免疫反应以及促进营养物质和信号分子的运输至关重要1。外周淋巴系统起始于淋巴毛细管，这些毛细管收集组织间液及其溶质，并汇入具有周围平滑肌层的较大集合淋巴管（LVs），后者将淋巴液输送至局部淋巴结进行免疫处理2,3。引流头部区域的淋巴网络对颅内（如脑组织）和颅外（如鼻腔和口腔）器官的稳态均具有重要意义。颅外淋巴网络的结构与组织被认为与全身其他部位的外周淋巴系统相似，而颅内淋巴系统则表现出独特的解剖和功能特征（参见图1中大鼠模型的详细示意图）4,5。尽管典型的淋巴管（LVs）并不存在于脑实质内，但一种特殊的胶质依赖性淋巴样转运系统（即类淋巴系统，glymphatic system）介导了类似淋巴功能，促进脑脊液（CSF）与组织间液（ISF）之间的交换6。类淋巴系统实现了脑实质内ISF与CSF的混合，而脑膜、血管周围以及鼻咽部的淋巴管则负责将溶质从CSF中转运出颅腔。具体而言，脑膜淋巴通路将蛛网膜下腔的CSF导入脑膜淋巴管，从而将颅内液体动力学与外周淋巴清除机制相连接7
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方案
本实验方案所描述的操作程序已获得大学动物伦理委员会批准，并依照中国药科大学的实验伦理准则进行。在开展任何涉及动物的操作之前，须从相关机构或组织的伦理委员会获得必要的批准。实验动物选用体重为 220 至 250 g 的雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠。动物来源于经认证的实验动物供应商（参见材料表），饲养于专用笼具中，自由摄食饮水，直至实验开始。本方案以左侧深颈淋巴管插管作为代表性示例进行描述。目前，关于左侧与右侧深颈淋巴管解剖学差异的文献证据有限。根据既往已完成实验的观察结果，两侧在淋巴流速等方面均未发现显著差异。
1. 安全预防措施和操作规程
- 所有操作均须按照机构生物安全指南进行，所有人员在开展本方案前，应接受显微外科技术、实验动物操作及化学品安全方面的充分培训。
- 整个操作过程中须穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、外科手套和防护护目镜。由于使用了挥发性麻醉剂（异氟烷），长时间暴露可能对人体造成中枢神经系统抑制及心血管毒性，因此操作必须在通风良好的环境中进行。禁止将食物和饮料带入实验室，并确保随时可获取流动水源。
- 应小心处理所有锐器，包括注射器针头、刀片和显微剪刀，使用后须立即丢弃至指定的锐器容器中；一次性锐器严禁重复使用。
- 所有生物样本（如收集的淋巴液）和动物体液（如血液）均应视为潜在危险物质，收集设备须谨慎操作，并将样本远离手术区域....
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结果
采用颈淋巴管插管模型获得了一组具有代表性的每小时淋巴流量（mL/h）数据集（相应图表见图7）。本实验共使用三只（n = 3）研究大鼠，淋巴液被持续收集至微量离心管中，并在6小时期间内每小时更换一次收集管。
图 7：颈部淋巴流随时间的变化。该图表展示了随时间变化的颈部淋巴流速（mL/h）的代表性数据。图中数据为 6 小时内三次（n = 3）成功实验的平均测量值（实心圆点，●）。
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讨论
本方案建立了一种可重复的大鼠颈淋巴管插管方法，能够实现长时间连续淋巴液采集。在具备充分显微外科训练的基础上，该操作可高效完成，并在持续麻醉维持的稳定生理条件下获得一致的淋巴样本，适用于常规实验应用。熟练掌握后，手术过程通常需时约40至50分钟，可在单次实验中处理多只动物。此外，相较于单时间点取样，连续采集可在较长时间内更详细地定量分析源自中枢神经系统的物质（如蛋白质、药物、免疫标志物和脂质）经淋巴系统的转运情况。深颈淋巴管通常被认为是中枢神经系统来源淋巴液的主要运输通路，尽管表层与深层引流路径的相对贡献可能随不同病理生理状态而变化。27,28,29迄今为止，尚难以确定其他可替代的插管部位以获得同样适用于收集中枢神经系统来源淋巴液的实验可行性，而 基于成像和共振的方法可用于 作为互补方法。尽管可根据特定实验需求采用非侵入性和非动物性方法，颈淋巴管仍是目前最实用且可靠的插管部位，是研究中枢神经系统来源淋巴过程的主要通道。
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披露
作者声明，他们不存在任何已知的相互竞争的经济利益或可能被认为影响本文所报告工作的个人关系。
致谢
作者衷心感谢中国药科大学动物实验中心的郝正林先生和赵洁女士在开展动物实验过程中提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 30 号针头 | Yushou Health | 用于连接套管近端（0503）与肝素注射器 | |
| 带挥发器的麻醉机 | YYUN Instrument Company | ||
| 钝头镊子 | RWD Life Science | F22002-10 | |
| 棉签 | 青岛舒茨生物技术有限公司 | MQ-02 | 用于暂时固定肌肉组织 |
| 加热手术垫 | 上海屹虹仪器有限公司 | 尺寸为 15 × 20 cm | |
| 肝素钠 | 上海阿拉丁生化科技股份有限公司 | H123383 | 使用前需稀释 |
| 胰岛素注射器（1 mL） | Yushou Health | U100-1ML | 仅用于肝素预包被 |
| 吸入用异氟烷溶液 | RWD Life Science | R510-22-10 | 通过挥发器用于麻醉 |
| 记号笔 | 任意品牌 | N/A | |
| 微量离心管（1.5 mL） | 南通海瑞实验设备有限公司 | HR10003 | 用于收集淋巴液 |
| 显微剪刀 | RWD Life Science | GD234BA0007925 | |
| 尼龙外科缝线 | 上海屹虹仪器有限公司 | 4-0 35 cm | |
| 移液器（可调体积，量程 5 至 50 μL） | Dragon Laboratory Instruments Limited | 7030301006 | 仅用于测量组织粘合剂 |
| 移液器吸头 | Biosharp Life Sciences | BS-10-T | 仅用于转移组织粘合剂，无特定体积要求 |
| 聚乙烯（PE）套管 0.5 mm 外径，0.3 mm 内径（0503） | 安莱立生科学仪器（宁波）有限公司 | PE-0503 | |
| 聚乙烯（PE）套管 0.6 mm 外径，0.5 mm 内径（0605） | 安莱立生科学仪器（宁波）有限公司 | PE-0605 | |
| 剃须刀片 | 吉列上海 | Q31/0115000301C004 | 仅用于剃除毛发 |
| 橡胶带 | 任意品牌 | N/A | 用于固定大鼠前肢 |
| 直尺 | 任意品牌 | N/A | |
| 手术刀片（#23） | RWD Life Science | S31010-01 | |
| 氯化钠（0.9%）输注液 | 石家庄第四制药厂 | H20066533（批准文号） | 仅用于冲洗毛发 |
| Sprague-Dawley 大鼠 | 北京维通利华实验动物技术有限公司 | 101 | 体重 220 至 250 克，无年龄要求 |
| 手术灯 | 北京赫欧生物科技有限公司 | XHA011-1 | |
| 手术显微镜 | 上海测维光电技术有限公司 | SMZ755T | 无机械载物台的解剖显微镜，可配备可伸缩支架 |
| 组织粘合剂 | 3M Vetbond | 1469SB | 主要成分为氰基丙烯酸酯 |
| 组织扩张器（Colibri） | RWD Life Science | R22029-04 | 扩张范围 20 mm/4 cm |
参考文献
- Hu, D., et al. Lymphatic system identification, pathophysiology and therapy in the cardiovascular diseases. J Mol Cell Cardiol. 133 (1), 99-111 (2019).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Compr Physiol
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