本研究发现2型糖尿病（T2DM）患者肠道微生物群多样性降低且代谢通路发生改变，表现为变形菌门增加和有益菌群减少，提示微生物群失衡与T2DM相关，并可能参与其病理生理过程。
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本研究发现2型糖尿病（T2DM）患者肠道微生物群多样性降低且代谢通路发生改变，表现为变形菌门增加和有益菌群减少，提示微生物群失衡与T2DM相关，并可能参与其病理生理过程。
2型糖尿病（T2DM）在全球范围内的发病率不断上升，凸显了深入理解其潜在生物学机制的必要性，特别是涉及宿主与微生物组相互作用的机制。本研究旨在表征新诊断T2DM患者与非糖尿病匹配对照组（NM组）之间肠道微生物的多样性、分类组成及预测的代谢通路差异。采用16S rDNA测序分析新鲜粪便样本。通过计算α多样性（Chao、ACE、Shannon和Simpson指数）和β多样性来评估微生物群落结构。使用Wilcoxon秩和检验及线性判别分析效应大小（LEfSe）评估分类学差异。基于KEGG和MetaCyc注释，利用未观测状态的系统发育重建法（PICRUSt2）进行功能通路预测。采用孟德尔随机化（MR）分析（包括逆方差加权法、MR-Egger法和加权中位数法），评估微生物分类群与T2DM之间基于遗传预测的关联性。结果显示，T2DM患者的微生物丰富度降低，表现为Chao指数和ACE指数下降，多样性结构发生改变，表现为Shannon指数降低而Simpson指数升高，并伴随显著的群落组成变化。在T2DM患者中观察到变形菌门（Proteobacteria）相对丰度增加，而毛螺菌科（Lachnospiraceae）和布劳特氏菌属（Blautia）等有益菌群丰度减少。功能预测表明，非氧化性戊糖磷酸途径、异丁醇生物合成以及L-异亮氨酸生物合成相关通路的丰度降低。MR分析提供了补充证据，支持特定微生物分类群与T2DM易感性之间的关联。综上所述，T2DM与微生物丰富度降低、多样性结构改变以及独特的分类和功能变化相关。这些发现强调了肠道微生物群在T2DM中的重要性，并支持基于微生物组的生物标志物及治疗策略的潜在应用价值。未来仍需进一步研究以验证这些结果并阐明其潜在机制。
2型糖尿病（T2DM）已成为全球增长最快的慢性疾病之一，其主要驱动因素包括快速的城市化进程、西方化的饮食模式以及日益久坐的生活方式1,2。该疾病是全球发病率和死亡率的重要原因，并对公共卫生体系造成重大负担3。尽管遗传易感性在其中发挥一定作用，但T2DM发病率的迅速上升突显了环境和代谢因素的关键影响4。因此，识别可干预的生物学机制对于改进早期检测和预防策略至关重要。近年来的研究进展已确认肠道微生物群是调节代谢稳态的关键因素5。肠道微生物生态系统影响葡萄糖代谢、免疫功能、肠道屏障完整性以及慢性低度炎症，这些过程均在T2DM的发病机制中起核心作用6。菌群失调与肥胖、胰岛素抵抗、内毒素血症及能量平衡紊乱相关，提示微生物改变与疾病进展之间存在机制性关联7。此外，微生物代谢产物，包括短链脂肪酸、胆汁酸和支链氨基酸，已被证实参与调控胰岛素敏感性和宿主代谢8。
尽管越来越多的证据支持肠道微生物组在2型糖尿病（T2DM）中的作用，但现有大多数研究依赖于观察性设计，限制了因果推断。其他方法如宏基因组测序和靶向代谢组学可提供更高分辨率的功能洞察，但在探索性或小规模预试验中常受限于成本、计算复杂性以及可行性。相比之下，16S rDNA测序是一种经济高效且广泛应用的微生物群落组成分析方法，尽管其分类学分辨率仅限于物种水平，且无法直接定量功能代谢物。因此，本研究选择16S rDNA测序作为适用于探索性临床队列的经济、可扩展的方法，同时支持与下游功能预测及互补分析框架的整合。因此，将基于16S的微生物谱分析与生物信息学功能预测以及孟德尔随机化（MR）等互补方法相结合，可能为探索菌群组成及潜在因果关系提供一个平衡的研究框架。
值得注意的是，目前仍相对缺乏针对新确诊且未经治疗的2型糖尿病（T2DM）患者的研究数据。在这类人群中，微生物的变化较少受到药物干预（尤其是二甲双胍）的混杂影响，而二甲双胍已知会显著改变肠道菌群的组成和功能9。这构成了当前文献中的一个重要空白，因为许多现有研究纳入了接受不同治疗方案的异质性患者群体，且很少将微生物组分析与基于遗传信息的分析方法相结合。
本研究旨在通过16S rDNA测序和生物信息学分析，表征新诊断的2型糖尿病（T2DM）患者与非糖尿病（NM）组在肠道微生物群多样性、分类组成及预测功能通路方面的差异。此外，利用公开的全基因组关联数据，采用孟德尔随机化方法探索特定微生物分类群与T2DM风险之间潜在的遗传预测关联。这种综合分析策略可从微生物群落谱型和人群水平遗传数据中获得互补性见解。具体而言，16S rDNA测序可直接表征研究人群中微生物组成的实际情况，而孟德尔随机化则利用独立队列中的遗传工具变量，评估观察到的关联是否与遗传预测的关系一致。该整合方法旨在解决观察性微生物组研究的一个关键局限性，即通过提供支持微生物群–T2DM关联稳健性的互补证据。因此，整合这两种方法旨在实现交叉验证而非重复，从而增强对微生物群–T2DM关联的可解释性。
本研究聚焦于三个方面。首先，通过评估新确诊且未经治疗的2型糖尿病（T2DM）患者的肠道微生物群变化，减少药物干预带来的混杂影响。其次，将分类学谱型与预测的功能通路相结合，以提供微生物群相关代谢改变的系统层面视图。第三，引入孟德尔随机化分析，评估所观察到的关联是否与基因预测的关系一致，从而实现方法学上的三角验证。总体而言，这些方面共同构建了一个互补且可重复的微生物组分析框架，而非单纯的描述性研究，使本研究区别于以往通常依赖单一方法观察设计、且未在统一分析框架内整合微生物谱型、功能预测和基于遗传信息推断的研究。
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所有涉及人类参与者的实验程序均经重庆陈家桥医院伦理委员会审查并批准（批准号：20240131）。在采集样本前，已从所有参与者处获得书面知情同意。所有粪便样本及参与者信息均采用去标识化的研究编码进行处理，详见材料表。
受试者筛选与入组
2023年6月至2023年12月期间，在重庆陈家桥医院就诊的初诊2型糖尿病（T2DM）患者被筛选纳入资格。若参与者年龄在20至65岁之间，新近确诊为T2DM，同意提供新鲜粪便样本，并完成必要的病史评估和临床检查，则被纳入糖尿病（DM）组。同期招募的健康志愿者被纳入非糖尿病匹配（NM）组，并在年龄、性别和一般人口学特征方面尽可能与DM组相匹配。若参与者存在血液系统疾病、中枢神经系统疾病、活动性风湿性疾病、自身免疫性疾病、急慢性胃肠道感染、慢性腹泻、便秘、活动性或愈合期胃肠道溃疡、炎症性肠病、肠易激综合征、肠结核、胃肠道肿瘤、其他恶性肿瘤、严重心功能不全、严重肝功能不全、严重肾功能不全、其他严重代谢性疾病、营养不良、免疫缺陷、先天性代谢障碍、精神疾病、使用镇静催眠药物或药物滥用等情况，则予以排除。若参与者在粪便样本采集前1个月内使用过抗生素、抑酸剂、胃肠道动力药物、益生菌、糖皮质激素或免疫抑制剂，亦予以排除。此外，在粪便样本采集前1个月内出现过腹泻、接受过胃肠道手术或胃肠道内镜检查，或报告生活环境或饮食习惯发生突然改变的个体也被排除。在样本采集前，为每位符合条件的参与者分配唯一的研究编号。根据样本可获得性和测序质量要求，从符合条件的队列中选取12名新诊断T2DM患者和12名NM参与者，用于后续的16S rDNA测序和微生物组分析。
粪便样本的采集与保存
每位参与者均获得一个无菌粪便采集容器，容器上仅标注指定的研究代码，以确保去标识化。要求参与者在排便前排空膀胱，以尽量减少尿液污染，并将新鲜粪便直接排入无菌容器中，避免接触马桶水、尿液、消毒剂或其他潜在污染物。采集后立即使用无菌一次性采样勺将约1–2 g粪便转移至无菌冻存管中。将冻存管 tightly 密封后立即置于干冰上或预冷的转运容器中。所有样本均在采集后2小时内运送至实验室。样本到达实验室后，核对研究代码，并检查每根冻存管是否有泄漏或可见污染。记录所有样本的采集和储存时间。粪便样本随后在−80 °C条件下保存，直至进行基因组DNA提取。只有在储存和运输过程中始终保持完全冷冻状态，且无管体泄漏或外部污染迹象的样本，才被视为可用于后续分析。
基因组DNA提取
粪便样本从 −80 °C 保存条件下取出后置于冰上，待处理。每个样本仅解冻至可均质化为止，以尽量减少因反复冻融循环引起的降解。取约 200 mg 粪便转移至无菌微量离心管中，根据粪便DNA提取试剂盒说明书中的制造商指示加入配套的裂解缓冲液 材料表样品在涡旋振荡器上剧烈振荡30秒以实现充分均质化，随后在室温下孵育5–10分钟以促进细胞裂解。裂解完成后，样品在12,000 × g. 4 °C下离心10分钟。小心地将上清液转移至新的无菌微量离心管中，避免扰动沉淀。随后根据试剂盒说明书，使用试剂盒提供的洗脱缓冲液或无核酸酶水洗脱基因组DNA。提取的DNA短期保存于−20 °C，长期保存则置于−80 °C。适用于后续分析的DNA样品应呈透明且无可见颗粒物。
DNA 质量评估
采用琼脂糖凝胶电泳和基于荧光的定量方法评估DNA质量。使用电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶，将提取的DNA样品与上样缓冲液混合后加入凝胶孔中。进行电泳直至DNA条带充分分离，随后在紫外光或蓝光照射下观察凝胶。当观察到完整基因组DNA条带且无明显降解或严重拖尾时，认为DNA完整性符合要求。随后使用基于荧光的DNA定量系统测定DNA浓度。然后将样品稀释至下游PCR扩增所需浓度。高质量的DNA样品在琼脂糖凝胶电泳中通常呈现清晰条带，并具有足够浓度以满足后续扩增实验的要求。
16S rDNA V3–V4 区域的 PCR 扩增
使用带条形码的引物扩增细菌16S rDNA的V3–V4高变区。引物序列如下：正向引物5′-ACTCCTACGGGAGGCAG-3′，反向引物5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR反应在冰上配制，总体积为20 µL，包含4 µL PCR缓冲液、2 µL核苷酸混合物（2.5 mmol/L）、正向和反向引物各0.8 µL（5 µmol/L）、0.4 µL高保真DNA聚合酶、10 ng模板DNA，并用无核酸酶水补足体积。通过移液轻轻混匀反应体系，并短暂离心以收集管底液体。PCR扩增程序如下：95 °C预变性5 min，随后进行25个循环，每循环包括95 °C变性30 s、55 °C退火30 s、72 °C延伸30 s，最后在72 °C延伸10 min。为尽量减少扩增偏差，每个样本进行三份平行PCR反应，同一样本的PCR产物随后合并至同一管中。通过琼脂糖凝胶电泳检测，若出现预期大小的清晰扩增条带，则确认扩增成功。
PCR 产物验证与纯化
使用2%琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物。将每个样本的混合PCR产物上样至凝胶，并进行电泳，直至目标扩增片段条带清晰分离。用洁净无菌的刀片切下与预期扩增片段大小相符的条带，并根据材料表中所列制造商说明书，使用凝胶回收试剂盒进行纯化。纯化后的PCR产物随后洗脱至洗脱缓冲液或无核酸酶水中。使用基于荧光的DNA定量系统测定各纯化PCR产物的浓度，并记录浓度值，用于后续文库构建。通过琼脂糖凝胶电泳检测，在预期扩增片段大小处出现单一、清晰的条带，表明扩增和纯化成功。
文库构建与混合
根据材料表中列出的制造商说明，使用DNA文库构建试剂盒制备测序文库。按照标准文库构建流程，将测序接头序列连接至纯化的扩增产物。接头连接产物随后采用凝胶回收或基于磁珠的纯化方法进行纯化，具体方法取决于所选的文库构建方案。使用2%琼脂糖凝胶电泳对纯化后的文库产物进行检测，以确认片段分布合适。采用基于荧光的DNA定量系统对文库浓度进行定量。根据DNA浓度和片段大小，将每个文库归一化至相同的摩尔浓度，以确保各样本间的测序深度均衡。随后按1:1的摩尔比例混合等量的各个文库，构建最终的测序文库混合物。测序前，根据测序平台的操作流程对混合文库进行变性处理，然后上样。适用于测序的文库应显示在预期大小范围内清晰的片段分布，并具有足够浓度以满足后续测序分析的要求。
双端测序
根据制造商的标准操作程序，将最终合并的文库加载到双端测序平台上。采用2 × 250 bp或2 × 300 bp的运行模式进行双端测序，以确保每个样本微生物多样性的全面表征具有足够的测序深度。在测序过程中，使用测序平台生成的质量指标持续监控测序质量。测序完成后，导出每个样本的原始双端FASTQ文件，用于后续的生物信息学分析。当测序数据集显示出每个样本足够的读段深度、适当的Q30质量分数以及成功的条形码分配时，即视为合格。
原始序列处理
将原始的双端FASTQ文件导入微生物组生物信息学分析流程以进行下游处理。根据分配给每个样本的条形码对序列进行解复用。随后进行质量过滤，以去除含有低质量分数、模糊碱基或测序伪影的读段。根据质量分数分布，对位于读段末端的低质量碱基进行剪裁，以提高整体序列的可靠性。经过质量控制后，通过重叠区域将双端读段合并，以重建全长序列。仅保留高质量的合并序列用于后续的微生物组分析。
扩增子序列变体（ASV）生成与分类学注释
使用经过验证的去噪算法（如 DADA2 或 Deblur）进行序列去噪，以校正测序错误并提高序列准确性。在去噪过程中识别并去除嵌合序列。随后为每个样本生成代表性的 ASV 序列及相应的 ASV 丰度表。采用朴素贝叶斯分类器对 ASV 序列进行分类学注释，并基于 SILVA 138 参考数据库进行分类学比对。分类学丰度表在门、科和属水平上导出，用于后续分析。最终的 ASV 数据集包含每个样本的代表性序列、丰度信息及相应的分类学注释。
α 和 β 多样性分析
采用Chao、ACE、Shannon、Simpson和Coverage指数等α多样性指数评估样本内的微生物多样性和丰富度。α多样性指数以均值±标准差表示。使用Shapiro–Wilk检验评估数据的正态性。符合正态分布的变量采用Student t检验比较糖尿病组（DM）与非糖尿病组（NM）之间的差异，非正态分布的变量则采用Wilcoxon秩和检验进行分析。随后，利用合适的距离矩阵计算β多样性距离，以评估样本间微生物群落组成的差异。通过主坐标分析（PCoA）可视化各组间微生物群落结构的差异。此外，采用相似性分析（ANOSIM）判断组间差异是否大于组内变异，并报告相应的ANOSIM R值和p值。α多样性分析反映样本内的微生物多样性，而β多样性分析用于评估组间微生物群落组成差异。
差异分类学分析
在门、科和属水平上总结了微生物群落组成。通过生成堆叠柱状图，以可视化各单一样本及研究组间优势分类单元的相对丰度。进一步构建泛基因组/核心基因组曲线（Pan/Core curves）和维恩图，用于比较糖尿病（DM）组与非糖尿病（NM）组之间的共有及组特异性ASV。采用Wilcoxon秩和检验评估组间分类单元丰度的差异。随后进行LEfSe分析，以鉴定对组间区分贡献最大的微生物分类单元。差异分类分析有助于识别在DM组或NM组中富集的微生物类群。
功能预测
采用 PICRUSt2 或其他经过验证的等效功能预测流程，从 16S rDNA 测序谱中推断微生物功能通路。ASV 丰度数据根据所选分析流程的要求进行标准化处理，预测的功能被映射到 KEGG 或 MetaCyc 通路注释。随后比较糖尿病（DM）组与非糖尿病（NM）组之间的预测通路丰度。对差异显著的通路采用热图或其他适当的图形方法进行可视化展示。预测的功能应解释为推断的微生物代谢潜能，而非直接测量的代谢物丰度。功能预测分析有助于识别组间存在差异的候选微生物通路，包括与碳水化合物和氨基酸代谢相关的通路。
孟德尔随机化分析
肠道微生物组的全基因组关联研究（GWAS）汇总统计学数据来自公开可用的数据集10。通过NHGRI-EBI GWAS目录（https://www.ebi.ac.uk/gwas/）获取与微生物分类群在全基因组水平显著相关的数据，登录号范围为GCST90032172至GCST90032644。额外的宏基因组数据通过欧洲基因组-表型组数据库（研究编号：EGAS00001005020）获取自FINRISK 2002队列。2型糖尿病的GWAS汇总统计数据也来自NHGRI-EBI GWAS目录（登录号：ebi-a-GCST006867）。根据预定义的统计学阈值筛选与微生物分类群相关的遗传变异作为工具变量，并排除处于连锁不平衡的变异。对暴露和结局数据集进行数据协调，以确保等位基因方向一致。随后采用逆方差加权法（IVW）作为主要分析方法进行孟德尔随机化分析。使用MR-Egger和加权中位数方法进行敏感性分析。采用F统计量评估工具变量强度，使用Cochran’s Q检验评估工具变量间的异质性。通过MR-Egger截距检验检测水平多效性。采用Bonferroni校正法校正多重比较。孟德尔随机化结果应解释为基因预测的关联性，而非因果关系的确凿证据。
数据输出与终点指标
最终的分析输出包括ASV丰度表、分类组成图、α多样性指标、β多样性分析、差异分类学结果、预测的功能通路谱以及孟德尔随机化估计结果。对测序数据集中的所有样本标识符进行了验证，以确保其与相应的去标识研究代码保持一致。原始测序文件、处理后的ASV表格、统计分析结果及图表源文件均已归档，用于后续分析和数据管理。当成功生成并验证了高质量的测序数据、分类谱、多样性指标、预测功能通路分析结果以及孟德尔随机化结果后，该实验流程即被视为完成。
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初始筛选的临床队列的基线人口统计学和临床特征见表1。随后从中选取一个代表性亚组，包括12名新诊断的2型糖尿病（T2DM）患者和12名非糖尿病（NM）参与者，进行16S rDNA测序及后续的微生物组分析。
测序深度评估
计算了香农指数，并绘制了稀疏曲线以评估测序深度。在所有样本中总共检测到 1,064,930 条序列，涵盖 4,770 个 ASV，表明群落丰富度较高。所有曲线均已趋于平缓，说明测序数据量充足，能够反映样本中存在的主要细菌群落（图 1）。
微生物（α）多样性分析
采用Chao、Ace、Shannon、Simpson和Coverage指数评估肠道微生物群的α多样性。这些指数以均值±标准差表示。使用Shapiro-Wilk检验评估数据的正态性。符合正...
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近年来，人体微生物组，特别是肠道菌群，已成为影响宿主代谢、免疫调节和疾病发生发展的复杂且重要的因素。在健康宿主体内，肠道菌群有助于维持免疫稳态和肠道屏障的完整性11。菌群失调已与多种病理状态相关，包括代谢紊乱、自身免疫性疾病以及恶性肿瘤12,13,14,15,16。在2型糖尿病（T2DM）患者中也观察到肠道菌群组成的变化，提示微生物失衡与疾病的发生发展相关12,17。
本研究表明，与非糖尿病（NM）组相比，2型糖尿病（T2DM）患者的肠道微生物群多样性显著降低，这一结果与既往研究发现一致
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作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
作者贡献：
Linrui Xie 和 Kemiao Chen 进行了数据分析并起草了手稿。Xican Pan 参与了样本采集和实验操作。Xuemei Zhong 和 Xiaoyu Li 构思并设计了本研究，监督了项目进展，并对稿件进行了关键性修改。所有作者均审阅并批准了最终手稿。
作者感谢所有参与样本采集和数据处理的参与者及工作人员为本研究做出的贡献。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16S rRNA 引物（V3–V4） | Sangon Biotech | Custom | 用于细菌 16S 区域的通用引物 |
| 80 °C 超低温冰箱 | Haier Biomedical | DW-86L626 | 样本长期储存 |
| 琼脂糖凝胶电泳系统（Sub-Cell GT） | Bio-Rad | 170-4401 | PCR 产物验证 |
| AMPure XP 磁珠 | Beckman Coulter | A63880 | DNA 纯化与片段大小筛选 |
| 珠击打裂解管（Lysing Matrix E） | MP Biomedicals | 116913050 | 微生物细胞的机械裂解 |
| 生物信息学工作站 | Dell | Precision 7920 | 使用 QIIME2 和 R 进行数据分析 |
| DADA2 分析流程 | Bioconductor | Version 1.28 | 序列去噪与 ASV 生成；https://benjjneb.github.io/dada2 |
| Deblur | QIIME2 | Version 2023.5 | 序列去噪与错误校正；https://docs.qiime2.org |
| 欧洲基因组-表型组数据库 | EMBL-EBI | EGAS00001005020 | 公共宏基因组数据存储库；https://ega-archive.org |
| GWAS 目录 | NHGRI-EBI | 编号 GCST90032172–GCST90032644 | 公共全基因组关联分析汇总统计数据库；https://www.ebi.ac.uk/gwas |
| Illumina MiSeq 测序系统 | Illumina | SY-410-1003 | 高通量测序平台 |
| KEGG 数据库 | 京都基因与基因组百科全书 | Release 107 | 功能通路注释数据库；https://www.genome.jp/kegg |
| MetaCyc 数据库 | SRI International | Version 27.1 | 代谢通路数据库；https://metacyc.org |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5424R | 用于样本制备的制冷离心机 |
| Nextera XT 文库制备试剂盒 | Illumina | 20018705 | 测序文库制备 |
| PCR 主混合液（2x PrimeSTAR Max Premix） | Takara Bio | RR350A | 用于高保真 PCR 扩增 |
| PCR 扩增仪 | Bio-Rad | T100 | PCR 扩增仪器 |
| PICRUSt2 | PICRUSt2 开发团队 | Version 2.5.2 | 基于 16S rDNA 测序数据的功能通路预测；https://github.com/picrust/picrust2 |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | 粪便样本 DNA 提取 |
| QIAquick 凝胶回收试剂盒 | QIAGEN | 28704 | 从琼脂糖凝胶中纯化 DNA |
| Qubit 荧光计 | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | DNA 定量 |
| R 软件 | 统计计算 R 基金会 | Version 4.3.1 | 统计分析与孟德尔随机化分析；https://www.r-project.org |
| SILVA 138 数据库 | SILVA 核糖体 RNA 数据库项目 | Release 138 | 用于分类学注释的参考数据库；https://www.arb-silva.de |
| 粪便采集管 | Sarstedt | 76.9923.001 | 无菌粪便标本采集管 |
| 粪便 DNA 提取试剂盒 | Omega | D4015-02 | DNA 提取试剂盒 |
| TwoSampleMR 软件包 | MR-Base | Version 0.5.7 | 在 R 中进行双样本孟德尔随机化分析；https://mrcieu.github.io/TwoSampleMR |