CUB结构域包含蛋白1对鼻咽癌细胞增殖及上皮-间质转化的影响

摘要

本方案旨在通过临床组织分析和 体外通过ERK1/2信号通路评估其在调控上皮-间质转化中作用的检测方法。

摘要

本方案描述了一种方法学途径，用于研究含CUB结构域蛋白1在鼻咽癌中的表达及其功能作用，以及其在上皮-间质转化过程中的潜在参与。收集鼻咽癌患者和鼻炎患者的临床组织样本，采用实时定量PCR和免疫组织化学方法分析CDCP1的表达。 体外 实验使用CNE2和HK1鼻咽癌细胞系进行。 CDCP1 通过转染CDCP1质粒或特异性siRNA实现基因过表达和敲低。采用MTT法检测细胞增殖，通过Caspase-3活性测定评估细胞凋亡，利用Western blot和定量PCR检测EMT相关标志物的表达及ERK1/2的磷酸化水平。为验证信号通路的参与作用，使用ERK1/2特异性抑制剂U0126进行挽救实验。该方案提供了一套系统的 体外 和 离体 阐明CDCP1调控鼻咽癌肿瘤进展分子机制的框架。

引言

鼻咽癌是最常见的原发性鼻咽恶性肿瘤，起源于鼻咽上皮组织，是一种具有独特地理分布特征的头颈部恶性肿瘤^1,2。约98%的鼻咽癌病例与潜伏性EB病毒（EBV）感染相关。该疾病在亚洲发病率较高，而在欧洲较为罕见，其发生可能与饮食习惯及其他因素有关^3,4,5。根据组织学分类，鼻咽癌可分为世界卫生组织（WHO）I型、II型和III型^6,7,8。与I型相比，II型和III型鼻咽癌对电离辐射更为敏感⁹；因此，放射治疗在临床上被广泛用于鼻咽癌的治疗^10,11。然而，鼻咽癌患者仍面临肿瘤细胞转移的风险，这是导致患者死亡的主要原因之一^12,13。较高的复发率凸显了阐明影响鼻咽癌转移的关键分子机制以及探索可预测转移风险的新型生物标志物的迫切需求。

含CUB结构域的蛋白1（CDCP1）是一种膜蛋白，在多种癌细胞中发挥驱动作用^14,15,16。研究已证实，CDCP1参与调控多种肿瘤的转移过程^17,18。在肺癌中，CDCP1表达上调，且与肿瘤细胞过度增殖、病理类型、TNM分期及淋巴结转移密切相关^19,20。然而，CDCP1在鼻咽癌中的表达特征及功能尚未见报道。因此，阐明CDCP1在鼻咽癌中的作用机制，对于揭示其转移机制并开发新的干预靶点具有重要的临床意义。

为研究CDCP1在鼻咽癌中的表达及其对肿瘤细胞生物学行为的影响，本研究采用结合临床组织样本与 体外 细胞实验。通过检测鼻咽癌组织中CDCP1的表达水平并建立 CDCP1 在鼻咽癌细胞系CNE2中构建过表达和沉默模型，采用MTT法检测细胞增殖，通过检测Caspase-3活性评估细胞凋亡，利用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测上皮-间质转化（EMT）相关标志物的表达及ERK1/2信号通路的活化状态。这些方法在肿瘤研究中广泛应用，具有良好的可重复性和操作简便性。

与依赖单一检测方法的策略相比，本研究结合多维功能实验与信号通路分析，更系统地评估了CDCP1在鼻咽癌中的作用机制。MTT法适用于高通量细胞增殖检测，操作简便且成本较低；Caspase-3活性检测可定量反映细胞凋亡水平；Western blot和qRT-PCR可分别在蛋白和mRNA水平验证EMT相关因子的表达变化。尽管这些方法在机制深度方面存在一定局限性，例如无法实时监测信号通路的动态变化，但仍为初步探索CDCP1功能提供了可靠的技术支持。

本研究旨在明确CDCP1在鼻咽癌中的表达模式，探讨其通过ERK1/2信号通路调控上皮-间质转化、肿瘤细胞增殖和凋亡的机制，从而为阐明鼻咽癌转移的机制并确定潜在干预靶点提供实验依据。

方案

本研究经华中科技大学同济医学院梨园医院伦理委员会批准［批准文号：2026IEC(RYJ016)］。所有患者均签署知情同意书，临床样本的采集与使用均符合《赫尔辛基宣言》的相关伦理准则。本研究使用的主要实验材料和仪器见材料表。

临床组织样本的收集及CDCP1表达的检测

2019年1月至2019年12月期间，我们医院收集了七名鼻咽癌患者的手术组织标本。同时，收集了六名鼻炎患者的鼻腔组织样本作为对照。所有组织样本在采集后立即用液氮速冻，用于后续RNA提取。

RNA 提取与实时定量 PCR 检测

根据制造商说明书从组织样本中提取总RNA。每个样本取50–100 mg组织，在冰上加入1 mL裂解试剂，使用组织匀浆器进行处理。匀浆过程持续30秒，重复3次，以确保组织完全破碎。组织破碎后，每份裂解液中加入200 µL氯仿。试管剧烈涡旋振荡15秒，室温静置3分钟，然后在4 °C下以12,000 × g. 离心15分钟以分离各相。小心移取上层澄清水相，避免扰动中间相，并转移至新试管中。

通过向该水相中加入等体积的异丙醇来回收RNA。室温孵育10分钟后，将样品在4 °C下以12,000 × g 离心10分钟，使RNA沉淀。弃去上清液，沉淀用1 mL 75%乙醇洗涤一次。在4 °C下以7,500 × g 再次离心5分钟后，去除乙醇洗涤液。RNA沉淀在室温下空气干燥5–10分钟，然后重悬于20 µL无RNase的水中。采用分光光度法测定RNA的浓度和纯度。

cDNA 合成时，使用 1 µg 总 RNA 进行逆转录反应。反应在 37 °C 下进行 15 分钟，随后在 85 °C 加热 5 秒。接着在实时荧光定量 PCR 系统上使用 TB Green Premix Ex Taq II 进行定量实时 PCR（qPCR）。每个 20 µL 反应体系包含 2 µL cDNA 模板、正向和反向引物（各 0.4 µmol/L）、10 µL SYBR Green 预混液以及无核酸酶水。扩增程序首先在 95 °C 变性 30 秒，随后进行 40 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 5 秒和 60 °C 退火/延伸 30 秒。引物序列见表 1。

CDCP1蛋白表达的免疫组织化学检测

组织样本首先用4%多聚甲醛固定24小时，随后进行常规脱水、石蜡包埋，并制备成4 µm厚的切片。石蜡切片经二甲苯处理以去除石蜡，并通过梯度乙醇溶液依次再水化。为暴露抗原，将切片置于柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中，在压力锅内加热，待溶液煮沸后继续加热3分钟。内源性过氧化物酶活性通过加入3%过氧化氢孵育10分钟进行阻断。

在阻断内源性酶活性后，将切片与1:200稀释的抗CDCP1一抗在4 °C孵育过夜。次日，切片在室温下用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育30分钟。使用DAB底物试剂盒进行信号显色，随后用苏木精对切片进行复染。最后，切片经脱水、封片，并在光学显微镜下观察。

细胞培养与分组

CNE2 和 HK1 人鼻咽癌细胞在含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的高糖 DMEM 培养基中培养。细胞置于含 5% CO₂ 的 37 °C 培养箱中培养。当细胞融合度达到 70%–80% 时，按以下分组进行转染：对照组（Control）：转染空载体或阴性对照 siRNA；CDCP1 过表达组（CDCP1-OE）：转染 CDCP1 过表达质粒；CDCP1 沉默组（si-CDCP1）：转染 CDCP1 siRNA；挽救实验组（CDCP1-OE + U0126）：在 CDCP1 过表达基础上，使用 ERK1/2 特异性抑制剂 U0126（10 µmol/L）处理 48 小时。

转染操作按照制造商的说明书进行。转染前24小时，将细胞以每孔2 × 10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL不含抗生素的培养基。当细胞培养至约70%融合度时，开始进行转染。吸除原有培养基，更换为新鲜的无血清培养基。对于每个孔，分别将2 µg质粒DNA或100 pmol siRNA与5 µL转染试剂在250 µL含低血清的培养基中稀释。两种组分在室温下静置5分钟。随后将稀释后的核酸与转染试剂混合，室温下静置20分钟，以形成转染复合物。将形成的转染复合物逐滴加入孔中，轻轻晃动使均匀分布，并与细胞共孵育6小时。孵育结束后，移除转染混合物，更换为含10% FBS的完全培养基。

细胞增殖实验

转染后48小时，收集各组的CNE2和HK1细胞，以每孔3 × 10³个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100 µL培养基，每组设5个复孔。细胞分别培养24、48或72小时后，每孔加入10 µL浓度为5 mg/mL的MTT溶液。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下继续孵育4小时。孵育结束后，小心弃去上清液，每孔加入100 µL二甲基亚砜（DMSO）以溶解甲臜结晶。将培养板振荡10分钟，确保结晶完全溶解。随后使用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度，以630 nm作为参考波长。

细胞凋亡活性检测

转染后48小时，收集各组CNE2细胞，根据试剂盒说明书，使用Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3活性。向1 × 10⁶个细胞中加入100 µL裂解缓冲液，冰上裂解15分钟，然后在4 °C下以12,000 × g离心10分钟。将所得上清液转移至后续分析步骤。在Caspase-3活性检测中，每孔加入50 µL反应缓冲液和5 µL Caspase-3底物（DEVD-pNA）。将酶标板置于37 °C孵育2小时，随后使用酶标仪在405 nm波长处测定吸光度。

Western印迹分析

转染后48 h，收集各实验组的CNE2和HK1细胞用于蛋白质提取。细胞在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中冰上裂解30 min。将裂解液在4 °C、12,000 × g条件下离心15 min，收集上清液。使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

进行蛋白质印迹分析时，将每个样品中的30 µg总蛋白与5x上样缓冲液混合，在100 °C加热10分钟以使蛋白质变性。样品在120 V电压下于10% SDS-PAGE凝胶中电泳分离90分钟，随后在300 mA恒定电流下转至PVDF膜上，持续90分钟。转膜完成后，用5%脱脂牛奶在室温下封闭膜1小时。

将膜在4 °C下与一抗孵育过夜，一抗包括抗CDCP1（1:1,000）、E-钙黏蛋白（1:1,000）、波形蛋白（1:1,000）、p-ERK1/2（1:2,000）、ERK1/2（1:1,000）和GAPDH（1:5,000）。

次日，将膜用TBST缓冲液冲洗3次，每次洗涤持续10分钟。随后在室温下与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1小时。再经过三次TBST缓冲液洗涤后，使用ECL化学发光底物显影蛋白信号。采用ImageJ软件测定条带强度，并以GAPDH作为归一化对照。

统计学分析
所有实验均独立重复 3 次。结果以均值 ± 标准差（SD）表示。多组间的差异通过单因素方差分析（ANOVA）进行评估，组间两两比较采用 Tukey 法进行事后检验。*P* 值 < 0.05 被认为具有统计学显著性。

结果

CDCP1在鼻咽癌组织中的上调

采用实时定量PCR检测了7例鼻咽癌组织和6例鼻炎组织中CDCP1 mRNA的表达水平。结果显示，鼻咽癌组织中CDCP1 mRNA的表达水平显著高于鼻炎组织（P < 0.05，图1A）。此外，通过免疫组织化学染色检测CDCP1蛋白在组织中的定位及表达水平。结果表明，CDCP1蛋白在鼻咽癌组织中表达，主要定位于细胞膜和细胞质；而在鼻炎组织中表达水平较低或缺失（图1B）。这些结果提示，CDCP1在鼻咽癌组织中表达上调。

鼻咽癌细胞中 CDCP1 表达的调控

为研究 CDCP1 在鼻咽癌细胞中的功能，通过转染 CDCP1 过表达质粒和 CDCP...

讨论

本研究首次系统地探讨了CDCP1在鼻咽癌组织中的表达特征及其对肿瘤细胞生物学行为的影响，并初步阐明了CDCP1通过激活ERK1/2信号通路促进上皮-间质转化的分子机制。研究结果表明，CDCP1在鼻咽癌中发挥促肿瘤作用，为深入理解该疾病转移机制提供了新的实验依据。

本研究发现，CDCP1 在鼻咽癌组织中的表达显著上调，这与既往在肺癌和三阴性乳腺癌等肿瘤中的报道一致^21,22。免疫组织化学染色进一步证实，CDCP1 蛋白主要定位于鼻咽癌细胞的细胞膜和细胞质中，这种定位与其作为参与信号转导的膜受体功能相符。值得注意的是，本研究的样本量较小（7 例鼻咽癌组织和 6 例鼻炎组织）。尽管 CDCP1 的表达差异已得到初步验证，但其表达水平与 TNM 分期、淋巴结转移及无病生存期等临床预后指标之间的相关性尚无法分析。未来的研究应在更大样本队列中系统评估 CDCP1 表达与患者预后的关系，以明确其作为鼻咽癌预后标志物的潜在价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Fisher, USA	23225	用于蛋白质浓度测定
Caspase-3 活性检测试剂盒	Beyotime, China	C1403	比色法检测 Caspase-3 活性
CDCP1 过表达质粒	未指明	未指明	用于 CDCP1 过表达转染
CDCP1 一抗	Abcam, USA	ab137706	用于免疫组化和 Western 印迹；稀释比例为 1:200（免疫组化）或 1:1000（Western 印迹）
CDCP1 siRNA	未指明	未指明	用于 CDCP1 基因沉默
CNE2 细胞系	中国典型培养物保藏中心（CCTCC），中国	未指明	人鼻咽癌细胞系
DMEM 高糖培养基	HyClone, USA	SH30243.01	细胞培养
DMSO	Sigma, USA	D2650	用于 MTT 实验中溶解结晶
E-cadherin 一抗	Cell Signaling Technology, USA	3195S	Western 印迹；稀释比例为 1:1000
ERK1/2 一抗	Cell Signaling Technology, USA	4695S	Western 印迹；稀释比例为 1:1000
GAPDH 一抗	Abcam, USA	ab8245	Western 印迹上样对照；稀释比例为 1:5000
HK1 细胞系	中国典型培养物保藏中心（CCTCC），中国	未指明	人鼻咽癌细胞系
Lipofectamine 2000	Invitrogen, USA	11668019	转染试剂
酶标仪	BioTek, USA	未指明	吸光度检测（MTT、Caspase-3）
MTT	Sigma, USA	M2128	细胞增殖实验；以 PBS 配制成 5 mg/mL
Opti-MEM	Gibco, USA	31985070	用于转染的低血清培养基
p-ERK1/2 一抗	Cell Signaling Technology, USA	4370S	Western 印迹；稀释比例为 1:2000
PrimeScript RT Master Mix	Takara, Japan	RR036B	实时 PCR 反转录试剂
PVDF 膜	Millipore, USA	IPVH00010	蛋白质转膜；孔径 0.45 μm
QuantStudio 5 实时荧光定量 PCR 系统	Applied Biosystems, USA	A34322	qPCR 检测
RIPA 裂解缓冲液	Beyotime, China	P0039	蛋白提取；完全 RIPA 裂解缓冲液
二抗（HRP 标记）	Dako, Denmark	未指明	用于免疫组化和 Western 印迹
柠檬酸钠缓冲液	未指明	未指明	用于免疫组化抗原修复，pH 6.0
TB Green Premix Ex Taq II	Takara, Japan	RR820A	qPCR 反应试剂；200 次反应
组织匀浆器	IKA T10, Germany	未指明	用于组织 RNA 提取时的匀浆
TRIzol 试剂	Invitrogen, USA	15596026	RNA 提取
U0126	Selleck, USA	S1102	ERK1/2 特异性抑制剂；使用浓度为 10 μmol/L
Vimentin 一抗	Cell Signaling Technology, USA	5741S	Western 印迹；稀释比例为 1:1000