CUB结构域包含蛋白1对鼻咽癌细胞增殖及上皮-间质转化的影响

摘要

本方案旨在通过临床组织分析和 体外通过ERK1/2信号通路评估其在调控上皮-间质转化中作用的检测方法。

摘要

本方案描述了一种方法学途径，用于研究含CUB结构域蛋白1在鼻咽癌中的表达及其功能作用，以及其在上皮-间质转化过程中的潜在参与。收集鼻咽癌患者和鼻炎患者的临床组织样本，采用实时定量PCR和免疫组织化学方法分析CDCP1的表达。 体外 实验使用CNE2和HK1鼻咽癌细胞系进行。 CDCP1 通过转染CDCP1质粒或特异性siRNA实现基因过表达和敲低。采用MTT法检测细胞增殖，通过Caspase-3活性测定评估细胞凋亡，利用Western blot和定量PCR检测EMT相关标志物的表达及ERK1/2的磷酸化水平。为验证信号通路的参与作用，使用ERK1/2特异性抑制剂U0126进行挽救实验。该方案提供了一套系统的 体外 和 离体 阐明CDCP1调控鼻咽癌肿瘤进展分子机制的框架。

引言

鼻咽癌是最常见的原发性鼻咽恶性肿瘤，起源于鼻咽上皮组织，是一种具有独特地理分布特征的头颈部恶性肿瘤^1,2。约98%的鼻咽癌病例与潜伏性EB病毒（EBV）感染相关。该疾病在亚洲发病率较高，而在欧洲较为罕见，其发生可能与饮食习惯及其他因素有关^3,4,5。根据组织学分类，鼻咽癌可分为世界卫生组织（WHO）I型、II型和III型^6,7,8。与I型相比，II型和III型鼻咽癌对电离辐射更为敏感⁹；因此，放射治疗在临床上被广泛用于鼻咽癌的治疗^10,11。然而，鼻咽癌患者仍面临肿瘤细胞转移的风险，这是导致患者死亡的主要原因之一^12,13。较高的复发率凸显了阐明影响鼻咽癌转移的关键分....

方案

本研究经华中科技大学同济医学院梨园医院伦理委员会批准［批准文号：2026IEC(RYJ016)］。所有患者均签署知情同意书，临床样本的采集与使用均符合《赫尔辛基宣言》的相关伦理准则。本研究使用的主要实验材料和仪器见材料表。

临床组织样本的收集及CDCP1表达的检测

2019年1月至2019年12月期间，我们医院收集了七名鼻咽癌患者的手术组织标本。同时，收集了六名鼻炎患者的鼻腔组织样本作为对照。所有组织样本在采集后立即用液氮速冻，用于后续RNA提取。

RNA 提取与实时定量 PCR 检测

根据制造商说明书从组织样本中提取总RNA。每个样本取50–100 mg组织，在冰上加入1 mL裂解试剂，使用组织匀浆器进行处理。匀浆过程持续30秒，重复3次，以确保组织完全破碎。组织破碎后，每份裂解液中加入200 µL氯仿。试管剧烈涡旋振荡15秒，室温静置3分钟，然后在4 °C下以12,000 × g. 离心15分钟以分离各相。小心移取上层澄清水相，避免扰动中间相，并转移至新试管中。

通过向该水相中加入等体积的异丙醇来回收RNA。室温孵育10分钟后，将样品....

结果

CDCP1在鼻咽癌组织中的上调

采用实时定量PCR检测了7例鼻咽癌组织和6例鼻炎组织中CDCP1 mRNA的表达水平。结果显示，鼻咽癌组织中CDCP1 mRNA的表达水平显著高于鼻炎组织（P < 0.05，图1A）。此外，通过免疫组织化学染色检测CDCP1蛋白在组织中的定位及表达水平。结果表明，CDCP1蛋白在鼻咽癌组织中表达，主要定位于细胞膜和细胞质；而在鼻炎组织中表达水平较低或缺失（图1B）。这些结果提示，CDCP1在鼻咽癌组织中表达上调。

鼻咽癌细胞中 CDCP1 表达的调控

为研究 CDCP1 在鼻咽癌细胞中的功能，通过转染 CDCP1 过表达质粒和 CDCP.......

讨论

本研究首次系统地探讨了CDCP1在鼻咽癌组织中的表达特征及其对肿瘤细胞生物学行为的影响，并初步阐明了CDCP1通过激活ERK1/2信号通路促进上皮-间质转化的分子机制。研究结果表明，CDCP1在鼻咽癌中发挥促肿瘤作用，为深入理解该疾病转移机制提供了新的实验依据。

本研究发现，CDCP1 在鼻咽癌组织中的表达显著上调，这与既往在肺癌和三阴性乳腺癌等肿瘤中的报道一致^21,22。免疫组织化学染色进一步证实，CDCP1 蛋白主要定位于鼻咽癌细胞的细胞膜和细胞质中，这种定位与其作为参与信号转导的膜受体功能相符。值得注意的是，本研究的样本量较小（7 例鼻咽癌组织和 6 例鼻炎组织）。尽管 CDCP1 的表达差异已得到初步验证，但其表达水平与 TNM 分期、淋巴结转移及无病生存期等临床预后指标之间的相关性尚无法分析。未来的研究应在更大样本队列中系统评估 CDCP1 表达与患者预后的关系，以明确其作为鼻咽癌预后标志物的潜在价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Fisher, USA	23225	用于蛋白质浓度测定
Caspase-3 活性检测试剂盒	Beyotime, China	C1403	比色法检测 Caspase-3 活性
CDCP1 过表达质粒	未指明	未指明	用于 CDCP1 过表达转染
CDCP1 一抗	Abcam, USA	ab137706	用于免疫组化和 Western 印迹；稀释比例为 1:200（免疫组化）或 1:1000（Western 印迹）
CDCP1 siRNA	未指明	未指明	用于 CDCP1 基因沉默
CNE2 细胞系	中国典型培养物保藏中心（CCTCC），中国	未指明	人鼻咽癌细胞系
DMEM 高糖培养基	HyClone, USA	SH30243.01	细胞培养
DMSO	Sigma, USA	D2650	用于 MTT 实验中溶解结晶
E-cadherin 一抗	Cell Signaling Technology, USA	3195S	Western 印迹；稀释比例为 1:1000
ERK1/2 一抗	Cell Signaling Technology, USA	4695S	Western 印迹；稀释比例为 1:1000
GAPDH 一抗	Abcam, USA	ab8245	Western 印迹上样对照；稀释比例为 1:5000
HK1 细胞系	中国典型培养物保藏中心（CCTCC），中国	未指明	人鼻咽癌细胞系
Lipofectamine 2000	Invitrogen, USA	11668019	转染试剂
酶标仪	BioTek, USA	未指明	吸光度检测（MTT、Caspase-3）
MTT	Sigma, USA	M2128	细胞增殖实验；以 PBS 配制成 5 mg/mL
Opti-MEM	Gibco, USA	31985070	用于转染的低血清培养基
p-ERK1/2 一抗	Cell Signaling Technology, USA	4370S	Western 印迹；稀释比例为 1:2000
PrimeScript RT Master Mix	Takara, Japan	RR036B	实时 PCR 反转录试剂
PVDF 膜	Millipore, USA	IPVH00010	蛋白质转膜；孔径 0.45 μm
QuantStudio 5 实时荧光定量 PCR 系统	Applied Biosystems, USA	A34322	qPCR 检测
RIPA 裂解缓冲液	Beyotime, China	P0039	蛋白提取；完全 RIPA 裂解缓冲液
二抗（HRP 标记）	Dako, Denmark	未指明	用于免疫组化和 Western 印迹
柠檬酸钠缓冲液	未指明	未指明	用于免疫组化抗原修复，pH 6.0
TB Green Premix Ex Taq II	Takara, Japan	RR820A	qPCR 反应试剂；200 次反应
组织匀浆器	IKA T10, Germany	未指明	用于组织 RNA 提取时的匀浆
TRIzol 试剂	Invitrogen, USA	15596026	RNA 提取
U0126	Selleck, USA	S1102	ERK1/2 特异性抑制剂；使用浓度为 10 μmol/L
Vimentin 一抗	Cell Signaling Technology, USA	5741S	Western 印迹；稀释比例为 1:1000