本研究旨在探讨百里醌对暴露于双酚A的大鼠血浆、大脑皮层和海马组织中氧化应激、Keap-1/Nrf-2信号通路及行为的影响。
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本研究旨在探讨百里醌对暴露于双酚A的大鼠血浆、大脑皮层和海马组织中氧化应激、Keap-1/Nrf-2信号通路及行为的影响。
双酚A（BPA）是一种广泛使用的环境内分泌干扰物，长期低剂量暴露于BPA increasingly与氧化应激介导的神经毒性相关。百里醌（TQ）是Nigella sativa中的一种生物活性成分，具有显著的抗氧化特性；然而，其在对抗BPA诱导的神经毒性方面的神经保护潜力仍尚未完全阐明。鉴于BPA暴露的普遍性，寻找有效且易于获取的神经保护策略变得日益重要。本研究探讨了TQ对BPA暴露大鼠的氧化应激、Keap-1/Nrf-2信号通路、行为学表现以及组织病理学改变的影响。共将24只成年雄性Wistar Albino大鼠随机分为四组（n = 6/组）：对照组、BPA组、BPA + 10 mg/kg TQ（BPA+TQ I）组和BPA + 20 mg/kg TQ（BPA+TQ II）组。连续30天通过灌胃方式给予BPA（50 µg/kg）和TQ。BPA暴露导致大鼠出现显著的行为障碍、氧化应激、Keap-1/Nrf-2信号通路紊乱，并在海马和大脑皮层中引起明显的组织病理学损伤。TQ治疗显著改善了大鼠的运动活性和类抑郁行为，降低了脂质过氧化和一氧化氮水平，恢复了谷胱甘肽相关的抗氧化能力，并使Keap-1和Nrf-2的表达恢复正常（p < 0.001）。这些保护作用在较高剂量TQ下更为显著。综上所述，本研究结果表明，百里醌通过调节氧化应激及Keap-1/Nrf-2信号通路，减轻了BPA诱导的神经毒性，凸显其在应对环境中相关剂量BPA暴露时作为神经保护剂的潜在应用价值。
双酚A（BPA）是一种广泛用于塑料和环氧树脂中的合成化合物，常见于食品包装材料、水系统、医疗器械和家用产品中1。持续的环境暴露引发了对其潜在神经毒性的担忧，特别是在反映人类实际暴露情况的长期低剂量条件下。
尽管美国食品药品监督管理局和美国环境保护局等监管机构已将每日每公斤体重50 µg（50 µg/kg/天）确定为未观察到有害作用水平，但不断出现的实验和流行病学证据表明，行为和认知改变可能在更低剂量下发生。因此，欧洲已将每日可耐受摄入量降低至每日每公斤体重4 µg（4 µg/kg/天），这凸显了研究环境相关剂量双酚A暴露的机制效应的必要性1,2。
氧化应激被认为是双酚A（BPA）诱导神经毒性的核心机制。BPA通过降低谷胱甘肽（GSH）等抗氧化防御能力，并增加丙二醛（MDA）等脂质过氧化标志物，破坏细胞氧化还原平衡3,4。然而，BPA暴露下调控抗氧化反应的上游调控机制仍缺乏充分表征。
Kelch样ECH相关蛋白1（Keap-1）/核因子红系2相关因子2（Nrf-2）通路是主要的内源性抗氧化防御机制。在氧化应激条件下，Nrf-2从Keap-1解离，转位至细胞核，并激活抗氧化反应元件依赖性基因表达5。尽管该通路在细胞防御中作用明确，但在环境相关双酚A暴露条件下，脑内特定区域Keap-1/Nrf-2信号通路的调控及其与行为学结果的关联尚未得到系统研究。
百里醌（TQ）是黑种草籽油中的主要生物活性成分，是一种具有亲脂性的苯醌类化合物，能够穿过血脑屏障。TQ 具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的特性，部分机制涉及激活 Nrf-2 信号通路并增强内源性抗氧化能力5,6。尽管先前的研究已证明 TQ 在多种神经毒性模型中具有保护作用，但在同一双酚 A（BPA）暴露模型中，尚缺乏整合评估氧化应激标志物、Keap-1/Nrf-2 信号通路及行为学参数的系统性方法学研究5,6,7。
本文介绍了一种可重复的实验方案，用于评估环境相关浓度双酚A暴露大鼠模型中的氧化应激生物标志物、Keap-1/Nrf-2通路表达及行为学改变，并在多个脑区水平上评价百里醌的神经保护作用。
我们假设低剂量双酚A暴露通过氧化应激介导的Keap-1/Nrf-2信号通路失调引起行为损害，而百里醌可通过恢复氧化还原平衡并激活Nrf-2依赖性抗氧化反应来减轻这些效应。
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所有实验程序均经机构动物实验本地伦理委员会批准（批准号：68429034/07）。
动物与实验设计
24只成年雄性Wistar白化大鼠（200-250 g）取自实验动物研究中心，在标准条件下单独饲养（12小时光照/12小时黑暗循环，24 ± 2 °C），并提供 随意摄取 可自由获取标准饲料和自来水。实验前，动物在实验室条件下适应环境，适应期为32天。
采用计算机生成的简单随机化方法将大鼠随机分配至实验组，以尽量减少选择偏倚，每组分配相同数量的动物（n = 6/组）：对照组、双酚A组（BPA）、双酚A + 10 mg/kg 百里醌（BPA + TQ I）以及双酚A + 20 mg/kg 百里醌（BPA + TQ II）。样本量通过G*Power软件（版本3.1）进行先验功效分析确定。根据既往研究5,6,7中报道的效应量，这些研究评估了双酚A诱导的神经毒性及抗氧化干预措施，特别是针对生化和行为学结局指标，在单因素方差分析中设定统计功效为0.80。在此条件下，每组至少需要六只动物，以检测实验组间具有统计学意义的差异。
通过灌胃法每日一次经口给予BPA（50 µg/kg）和TQ（10 或 20 mg/kg），持续30天。所有处理剂均新鲜配制，并以1 mL/kg的总体积给予。本研究中采用的BPA剂量（50 µg/kg/天）是基于美国环境保护局（United States Environmental Protection Agency）和美国食品药品监督管理局（U.S. Food and Drug Administration）所规定的无观察到有害效应水平及参考剂量而选定的。该剂量已在大量实验研究中被广泛使用，用于模拟环境相关水平的BPA暴露，并探究在以往被认为安全的暴露水平下可能发生的神经行为学和生物化学改变。重要的是，不断积累的实验证据表明，在此剂量或更低剂量下仍可能出现神经系统和行为方面的不良影响，这支持了该剂量在评估低剂量BPA毒性中的相关性1,2。TQ剂量（10 和 20 mg/kg）的选择则基于既往实验研究，这些研究已证明该化合物在不引起毒性的前提下具有神经保护和抗氧化作用5,6,7。这些剂量已在啮齿类动物的神经毒性、氧化应激和神经炎症模型中被广泛使用，且远低于重复给药时报道的毒性阈值。本研究未开展预试验以确定剂量；剂量选择依据文献报道的先例和已确立的安全性特征，以确保其有效性和转化应用的相关性。
双酚A连续给药30天。在最后一次暴露后的第31天和第32天进行行为学评估。所有行为学测试完成后，于第32天处死动物。该时间安排旨在为行为学评估提供充足时间，同时尽量减少急性操作或实验操作应激对后续生化、分子及组织病理学分析可能产生的干扰。百里醌在每次给予双酚A后立即通过相同的经胃途径每日给药1次。行为学测试在最后一次双酚A和百里醌给药后进行。实验时间线总结于图1中。
体重测量
使用已校准的数字精密天平（灵敏度±0.1 g）测量体重。每只大鼠在早晨给药前单独称重，并在第1、10、20和32天在标准化条件下进行测量，以尽量减少变异（图2）。
行为学评估
所有行为学参数均由一名对分组情况设盲的观察者进行评分，以尽量减少观察者偏倚和不同观察者之间的差异。动物在行为学测试前至少在测试房间内适应30分钟，以减少由新环境引起的压力。
旷场实验（OFT）与强迫游泳实验（FST）的联合使用可对双酚A（BPA）引起的神经行为毒性进行综合评估，因为已有研究表明BPA会改变啮齿类动物的情绪反应性和运动活动能力2,3。在解读FST中的不动时间时，需考虑OFT所得的运动行为指标，以尽量减少因运动活动改变而带来的潜在混杂效应。
FST：在第32天通过强迫游泳实验评估抑郁样行为，此前于24小时前进行了一次持续15分钟的预实验。将大鼠单独放入圆柱形水箱（直径35 cm，高50 cm）中，水深30 cm，水温25 ± 1 °C，使其自由游泳5分钟。使用摄像机记录不动、游泳和攀爬行为，并通过离线分析评估行为绝望7。
OFT：在第31天采用旷场实验评估类似焦虑行为和自发性运动活动。将每只大鼠单独放入一个白色聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）实验箱（90 cm × 35 cm），箱底均分为24个相等的方格，允许其自由探索5分钟。使用视频摄像机记录动物的活动。以大鼠在中央区和周边区停留的时间以及四肢完全跨入方格的次数作为焦虑相关行为和运动能力的评估指标8。
样本采集
第32天，通过肌内注射氯胺酮（45 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）对大鼠进行深度麻醉。通过足底回缩反射消失确认麻醉深度足够。使用无菌注射器经心脏穿刺采集血液，每只动物获得约3–5 mL血液。在深度麻醉下通过放血法完成安乐死。将血液样本转移至含抗凝剂的试管中，在4 °C条件下以3,000 × g离心10–15分钟。分离后的血浆分装后储存于−80 °C，待进行生化分析。
迅速分离海马和左侧大脑半球，称重后在液氮中速冻，并于 −80 °C 保存，用于后续生化分析；右侧大脑半球则固定于 10% 中性缓冲甲醛溶液中，用于组织病理学和免疫组织化学评估。为确保方法学的一致性并减少样本间的变异，所有动物均系统性地将左侧半球用于生化检测，右侧半球用于形态学分析。重要的是，甲醛固定严格仅限于用于组织学和免疫组织化学实验的组织，未使用任何固定组织进行基于蛋白质的生化检测，从而避免固定导致的蛋白质降解。对于生化检测，取定量的冷冻脑组织（通常每次检测 50–100 mg），根据各生化参数的具体要求，使用特定检测的匀浆缓冲液及标准化的组织与缓冲液体积比进行匀浆。所有分析均在各实验组内保证每项检测所用组织量相等。.
采用荧光法定量蛋白检测试剂盒，按照制造商说明书测定组织匀浆中的总蛋白浓度。所有生化参数的检测均在每个实验中使用标准化且等量的蛋白浓度，以确保各样本及实验组之间的可比性。
氧化应激参数的评估
通过使用硫代巴比妥酸反应物（TBARS）法测定血浆和组织样本中丙二醛（MDA）水平来评估脂质过氧化程度7。还原型硫醇（RSH）和谷胱甘肽（GSH）水平采用基于5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）的分光光度法测定7。血浆和组织匀浆中总一氧化氮（NO）水平在硝酸盐还原后通过Griess反应进行测定7。所有生化参数均表示为nmol/g蛋白或µmol/g组织，具体如图3和图4所示。所有生化检测均重复进行两次，取平均值用于统计分析。
除了脑组织分析外，还对血液样本进行了生化检测，以评估双酚A暴露所引起的全身氧化状态。采用TBARS法测定血浆脂质过氧化水平，结果以丙二醛（MDA）当量表示。使用DTNB试剂测定还原型硫醇（RSH）水平，并通过硝酸盐还原后采用Griess反应测定总一氧化氮（NO）水平，具体方法如前所述7。吸光度值分别在532 nm（TBARS）、412 nm（RSH）和540 nm（NO）处通过分光光度法记录。所有检测均在标准化条件下重复进行两次。
双酚A（BPA）是一种普遍存在的环境毒物，可进入全身循环并产生多器官效应；因此，循环中的氧化应激标志物能够提供反映整体氧化还原失衡的补充信息1，2。基于血液的生化参数检测可用于评估中枢与外周氧化改变之间的关系，并提高研究结果的转化应用价值，因为此类标志物在环境与临床研究中常被用于监测与暴露相关的毒性反应。
Western印迹分析
采用Western印迹分析检测海马组织中Keap-1和Nrf-2蛋白的表达水平。取约50 mg组织加入500 µL含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液中进行匀浆。匀浆液在4 °C条件下以14,000 × g 离心10分钟，收集上清液。根据制造商说明书，采用荧光法定量蛋白浓度，并通过标准曲线计算浓度。等量蛋白（30 µg）与含β-巯基乙醇的Laemmli上样缓冲液混合，于95 °C加热5分钟，经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离后，在110 V电压下电转印60–90分钟至PVDF膜。膜用3% BSA封闭后，于4 °C与抗Keap-1和Nrf-2（1:3000）及β-actin（1:1000）的一抗孵育过夜，随后与HRP标记的二抗孵育。通过化学发光法显影蛋白条带，采用密度分析法对条带强度进行定量，并以β-actin为内参进行归一化处理。
组织病理学分析
取右侧半脑的脑组织样本，用10%中性缓冲甲醛固定72小时，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，按标准组织学程序包埋于石蜡中9。新鲜组织保留用于生化分析。根据大鼠脑图谱，在海马和内嗅皮层水平获取冠状切片（5 µm）10。每只动物取连续四张切片贴于载玻片上，用于组织学和免疫组织化学评估，以确保切片厚度和解剖定位的一致性。切片经脱蜡、水化后，按常规染色方案进行苏木精-伊红（H&E）染色11。组织病理学检查由一名经过培训的研究人员在不知晓实验分组的情况下，使用光学显微镜进行，以减少偏倚并消除观察者间的差异。
免疫组织化学分析
根据海马和内嗅皮层对双酚A（BPA）诱导的神经毒性易感性及其在认知与情绪调节中的作用，选择这些脑区作为研究重点1,2。对石蜡包埋的脑组织切片进行Nrf-2和Keap-1的免疫组织化学染色。切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化后，在柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中进行加热诱导的抗原修复。在孵育前，需淬灭内源性过氧化物酶活性。
切片在4 °C下与Nrf-2（1:100）和Keap-1（1:200）一抗孵育过夜。根据制造商说明书，使用商品化的即用型基于聚合物的HRP检测系统进行检测，该系统包含与辣根过氧化物酶偶联的种属特异性二抗。采用3,3′-二氨基联苯胺（DAB）作为显色底物显示免疫反应性，随后用苏木精复染。切片经脱水、透明处理后封片。
阴性对照切片在平行处理过程中未进行一抗孵育。为进行定量分析，每只动物选取三个不相邻的切片进行评估。所有组别的图像均在相同的曝光条件下采集。每张切片分析16个无重叠的视野，使用ImageJ软件完成。感兴趣区域手动勾画，扣除背景染色信号后，免疫反应强度以平均灰度值表示。计算每只动物的平均值，并用于统计学分析。
组织病理学评分
在苏木精和伊红（H&E）染色切片上对组织病理学改变进行半定量评估。每张切片随机选择10个不重叠的视野进行观察，病理学参数独立评分。根据受累细胞的比例，采用四分制对海马和内嗅皮层的损伤严重程度进行分级：0分（<5%），1分（≤三分之一），2分（三分之一至三分之二），3分（>三分之二）。每只动物的平均评分用于统计分析。
统计学分析
数据采用 SPSS 软件（版本 29.0）进行分析，结果以均值 ± 标准差（SD）表示。样本量根据既往研究和功效分析确定，表明每组六只动物可提供 >80% 的检验效能以检测具有生物学意义的差异。数据分布的正态性通过 Shapiro-Wilk 检验进行评估。方差齐性通过 Levene 检验进行评价。组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验。统计学显著性设定为 p < 0.05。
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体重
在研究的第1天和第32天，各组之间的体重差异无统计学意义（F(3,20)=2.750，p > 0.05；图2）。
行为测试结果
旷场实验分析显示，双酚A（BPA）暴露显著降低了动物的运动活性，表现为与对照组相比，穿越格数明显减少（p < 0.001）。经10 mg/kg和20 mg/kg的百里醌（TQ）处理后，与BPA组相比，穿越格数显著增加（p < 0.001），其中BPA+TQ II组的增加幅度大于BPA+TQ I组（p < 0.001；F(3,20)=183.031；表1）。
与对照组相比，双酚A暴露显著减少了在开放场中心区域停留的时间，并增加了在周边区域停留的时间（p < 0.001）。两种剂量的百里香醌均显著逆转了这些...
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本研究评估了双酚A（BPA）——一种聚碳酸酯塑料的结构成分，在美国环保署（USEPA）认定的安全剂量50 µg/kg1,2下——对大鼠脑组织氧化应激、Keap-1/Nrf-2信号通路、行为学及组织病理学改变的影响。此外，还研究了百里醌（TQ）——一种具有明确抗氧化特性的天然化合物——在两个不同剂量（10 mg/kg 和 20 mg/kg）5,6,7下的潜在神经保护作用。研究结果表明，亚慢性暴露于安全剂量的BPA可引起显著的氧化失衡，破坏Keap-1/Nrf-2信号通路，导致行为障碍，并引发明显的组织病理学损伤；而同时给予TQ治疗则能以剂量依赖的方式有效缓解这些异常改变。
本研究中，双酚A暴露30天导致海马区Keap-1表达升高，Nrf-2水平降低，同时伴有大脑皮层和血浆中丙二醛（M...
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作者声明无任何利益冲突。
本项目由该校科研项目协调办公室资助（项目编号 TIP.A4.24.003）。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸) | Thermo Scientific | 69-78-3 | |
| 台式离心机 NF048 | Nüve | 43560 | |
| Beta_Actin | ThermoFisher Scientific, 美国 | 7D2C10 | |
| 双酚A | Merck | 239658 | |
| BSA溶液 | Proteintech, 美国) | 66201-1-Ig | |
| 丁基化羟基甲苯 | Sigma Aldrich | 128-37-0 | |
| 数字式匀浆器ör | Daihan Scientific | https://www.artlaboratuvarcih azlari.com/urun/daihan-hg- 15d-dijital-homojenizator-set -a?srsltid=AfmBOorx_az06ulc HpSzKZsuP8-47Za4BkvLOM2 2Xhp00tgwWhJ-86Vc | |
| 苏木精-伊红–染色剂 | Bio Optica | W01030708 | |
| 盐酸 | Merck | 7647-01-0 | |
| Image J 软件程序 | NIH；美国华盛顿 | https://imagej.net/ij/ | |
| 免疫组织化学染色试剂盒 | Lab VisionTM UltraVisionTM 大容量检测系统：抗多价抗体 | HRP, TA-125-HL | |
| Leica Autocut 14051956472 | 德国 | https://www.leicabiosystems. com/histology-equipment/mic rotomes/histocore-autocut/ | |
| 光学显微镜 | Nikon, Eclipse | Ni-U, 940728 | |
| N-(1-萘基)乙二胺 | Thermo Scientific | 1465-25-4 | |
| 纳米微孔板读数仪 | BMG LABTECH | SPECTROstar Nano | |
| 磷酸盐缓冲液 | Merck | P4417 | |
| Keap-1 一抗 | Proteintech | 货号 10503-2-AP, 1:200 | |
| Nrf-2 一抗 | Proteintech | 货号 16396-1-AP, 1/100 | |
| Qubit Protein BR 检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific-INVITROGEN | Q33211 | |
| 柠檬酸钠 | Merck | 03-04-6132 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Thermo Scientific | 151-21-3 | |
| 氢氧化钠 | Merck | 1310-73-2 | |
| 硝酸钠 | Merck | 7631-99-4 | |
| 链霉亲和素过氧化物酶 | Thermo Scientific | SHRP248-B | |
| 磺胺嘧啶 | Thermo Scientific | 63-74-1 | |
| 硫代巴比妥酸 | Merck | 504-17-6 | |
| TQ | CAYMAN | 490-91-5 | |
| 三羧基丙酸，99% | Thermo Scientific Chemicals | 139360500 | |
| 三氯乙酸 | Thermo Scientific Chemicals | 76-03-9 | |
| Tris-HCl | Thermo Scientific | 1185-53-1 | |
| 三氯化钒 | Sigma Aldrich | 7718-98-1 | |
| West Pico PLUS 化学发光底物及 iBright 750 | Thermo Fisher Scientific 系统 | https://www.clinxsci.com/product/mini _chemiluminescence_imaging_system ?gad_source=1&gad_campaignid= 16224184202&gbraid=0AAAAAoN6 UOOtoB8UD0deumBAMD8Xi-1l-&g clid=CjwKCAjwgeLHBhBuEiwA L5gNEXtK2CNSLS1GqllMuNgkrFYD aW7yK585njQjFja485Fkwj9lRUEKD BoCgLoQAvD_BwE | |
| 硫酸锌溶液 | Merck | 7733-02-0 |
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