一项关于免疫细胞特征与血浆代谢物在桥本甲状腺炎中作用的孟德尔随机化研究

摘要

本研究采用双样本孟德尔随机化和中介分析方法，鉴定出32种免疫细胞表型和9种血浆代谢物与桥本甲状腺炎存在因果关联，并支持部分CD39+Treg-异戊酰肉碱（C5）-HT免疫代谢轴的存在。初步的流式细胞术和代谢组学数据为此通路提供了初步的生物学合理性证据。

摘要

桥本甲状腺炎（HT）是一种自身免疫性甲状腺疾病。尽管免疫细胞在其发病机制中起重要作用，但其具体功能尚未完全阐明。本研究采用两样本孟德尔随机化（MR）分析，整合了来自大型公共数据库中关于免疫细胞特征（ebi-a-GCST90001391 至 ebi-a-GCST90002121）、血浆代谢物（GCST90199621-9020102）和 HT（ebi-a-GCST90018855）的全基因组关联研究（GWAS）汇总统计数据。使用逆方差加权（IVW）法估计因果效应，并通过 MR-Egger、加权中位数及留一法分析评估多效性与结果稳健性。进一步采用双向和中介 MR 分析检验因果方向性，并识别潜在的代谢物介导通路。采用流式细胞术定量外周血样本中的 CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺Treg 细胞。通过液相色谱串联质谱法测定异戊酰肉碱（C5）水平。IVW 分析发现 32 种免疫细胞表型与 HT 风险显著相关（FDR 校正后 P < 0.05）。反向 MR 分析显示，HT 与 2 种免疫特征呈正向因果关联，而另有 4 种免疫特征与 HT 呈负向因果关联（所有 P < 0.05）。敏感性分析未发现水平多效性或异质性。此外，IVW 方法初步鉴定出 9 种与 HT 存在因果关系的血浆代谢物，其中包括增加风险的 C5（OR = 1.120，95% CI：1.032–1.215，P = 0.006）和具有保护作用的麦硫因（ergothioneine）（OR = 0.958，95% CI：0.927–0.990，P = 0.010）。两步法 MR 中介分析将 C5 鉴定为连接 CD3⁺CD39⁺Treg 细胞与 HT 的候选中介因子（中介比例为 8.89%，95% CI：2.34%–15.4%，P = 0.008）。流式细胞术结果显示，HT 患者中 CD39⁺Treg 细胞水平及血浆 C5 浓度升高，且 C5 水平与 CD39⁺Treg 细胞比例呈正相关。本研究确立了免疫细胞表型与 HT 之间的新型因果关系，并强调血浆代谢物（尤其是 C5）在 HT 发病机制中可能发挥的中介作用。这些发现加深了对自身免疫性甲状腺疾病的机制理解，可能为未来生物标志物和治疗靶点的发现提供指导。

引言

桥本甲状腺炎（HT）是一种常见的自身免疫性疾病，其特征是免疫系统攻击甲状腺，导致甲状腺功能减退^1,2。近期研究表明，HT 的发病率呈逐年稳步上升趋势。在中国，其患病率估计介于 0.2% 至 1.3% 之间³。尽管 HT 的确切病因尚不明确，但目前认为其发病机制涉及遗传、环境和免疫系统因素之间的复杂相互作用^4,5。

桥本甲状腺炎（HT）的发病过程深受免疫系统影响^6,7,8。异常的免疫反应会靶向甲状腺组织，引发包括抗甲状腺过氧化物酶抗体（anti-TPO）和抗甲状腺球蛋白抗体（anti-Tg）在内的自身抗体的产生⁹。这些自身抗体与甲状腺细胞相互作用，诱导免疫介导的细胞死亡和炎症反应，最终导致甲状腺功能受损¹⁰。然而，具体的致病通路，尤其是驱动免疫细胞功能障碍的代谢信号，目前尚未完全阐明。调节性T细胞（Tregs），特别是表达CD39的亚群，在维持免疫耐受中发挥关键作用，其通过将细胞外ATP水解为具有免疫抑制作用的腺苷来实现这一功能。Treg细胞功能或其代谢环境的紊乱可导致自身耐受的破坏，但特定Treg亚群与桥本甲状腺炎之间的因果关系仍有待阐明^{11,12,13,14,15,16}。

传统的观察性研究常受到混杂变量和反向因果关系的限制，这使得确定免疫细胞表型与HT¹⁷之间的明确因果关系变得复杂。此外，由于HT是一种受多种免疫亚群和代谢中间产物影响的系统性疾病，仅关注个别候选因素可能会忽略新的致病驱动因素¹⁸。因此，有必要采用大规模筛查方法，以全面、无偏倚地揭示参与HT的免疫代谢因素的整体图景。近年来全基因组关联研究（GWAS）的进展为免疫细胞表型和血浆代谢物提供了全面的数据，为探索HT的潜在机制开辟了新的途径¹⁹。孟德尔随机化（MR）遵循孟德尔配子随机分配和自由组合的原则¹⁶，利用单核苷酸多态性（SNPs）作为工具变量（IVs），推断暴露因素对结局的潜在因果效应^20,21。该方法有助于减轻混杂因素和反向因果关系的影响，而这些因素常常使传统观察性研究变得复杂^16,22。

鉴于这些进展，本研究的目标有两个方面。首先，采用双样本孟德尔随机化（MR）框架进行了一项探索性、假设生成型分析，系统筛查了731种免疫细胞表型和1400种血浆代谢物，以识别桥本甲状腺炎（HT）的新型候选风险因素。其次，转向基于假设的研究，以评估已识别代谢物（如异戊酰基肉碱）在调节性T细胞与HT风险关联通路中的具体中介作用。因此，本研究整合了大规模MR筛查、中介效应分析及初步临床验证，提供了遗传学支持的证据，支持一种假定的免疫-代谢框架（Treg–代谢物–HT），同时强调了这些发现的探索性质。通过识别这些精确的因果链，本研究为甲状腺自身免疫的代谢调控提供了新的视角，并为未来治疗靶点的选择提供了有力候选分子。

方案

本研究经内蒙古医科大学附属医院医学伦理委员会批准。 所有操作均遵循《赫尔辛基宣言》及相关伦理准则。在开展任何与研究相关的操作之前，已从所有参与者处获得书面知情同意。本研究共纳入两组受试者：桥本甲状腺炎组（HT，n = 10）和健康对照组（Healthy，n = 10）。两组在年龄和性别上相匹配。所有外周血样本均来自门诊患者或接受常规健康体检的个体，在隔夜空腹后于次日早晨采集血液。

研究设计

本研究采用双样本孟德尔随机化（MR）分析和中介分析，评估731种免疫细胞表型（7组）与高血压（HT）之间的因果关系，并探讨血浆代谢物在该关系中的潜在调节作用。分析流程包括5个连续步骤：（1）选择免疫表型的暴露全基因组关联研究（GWAS）数据集；（2）选择高血压结局的GWAS数据集；（3）工具变量的识别与数据协调；（4）主要的双样本MR分析及双向验证；以及（5）两步中介MR分析。研究设计的示意图见补充图1。在MR分析中，遗传变异作为可变暴露的替代指标。为实现有效的因果推断，工具变量（IVs）必须满足三个基本准则：（1）与所关注的暴露因素强相关；（2）独立于可能同时影响暴露和结局的任何混杂因素；（3）仅通过暴露途径影响结局，不存在其他替代性因果路径。

HT 数据源的全基因组关联研究

为确保数据集的兼容性并尽量减少群体分层，所有全基因组关联研究（GWAS）汇总统计数据主要来源于欧洲血统个体。高血压（HT）结局数据来自GWAS数据库（https://gwas.mrcieu.ac.uk/），并使用了ebi-a-GCST90018855数据集。该研究在质量控制和插值后，对395,640名欧洲人（病例数 N_case = 15,654，对照数 N_control = 379,986）进行了GWAS分析，共检测了24,146,037个单核苷酸多态性（SNP）。针对HT特异性的混杂因素（如性别、年龄），原始GWAS（ebi-a-GCST90018855）已在分析模型中纳入了这些协变量，这是GWAS分析流程中的标准做法。

免疫细胞的GWAS数据来源

与免疫细胞特征相关的全基因组关联研究（GWAS）的汇总统计数据来自GWAS目录，涵盖从ebi-a-GCST90001391到ebi-a-GCST90002121的数据库编号（可访问 https://www.ebi.ac.uk/gwas/ 获取）。分析共纳入731种免疫学表型，包括相对细胞计数（n = 192）、形态学参数（MP）（n = 389）、活化系数（AC，n = 118）以及代表表面抗原表达程度的平均荧光强度（MFI，n = 389）²³。最初的免疫细胞GWAS记录了近2200万个单核苷酸多态性对3757名撒丁岛个体中731种免疫细胞表型的影响。

血浆代谢物的全基因组关联研究（GWAS）数据来源

从GWAS目录（https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020）获取了共计1,400种血浆代谢物的GWAS汇总数据，其中包括1,091种单个代谢物浓度和309种代谢物比率性状。本研究用于MR分析的GWAS数据集来源于欧洲血统个体。所用血浆代谢物GWAS数据的详细特征见补充表1。

免疫细胞表型（撒丁岛队列）、高血压（FinnGen/EBI-a-GCST90018855）和血浆代谢物（欧洲队列）的全基因组关联研究（GWAS）数据集相互独立，无样本重叠，各自联盟的出版物已证实了这一点。这满足了双样本孟德尔随机化（MR）的独立性假设。

工具变量（IVs）的选择

假定工具变量（IVs）与暴露因素存在强关联，同时独立于结局变量。此外，假设只有暴露因素对结局具有直接效应。为确定合适的工具变量，选择与暴露因素相关的单核苷酸多态性（SNPs），显著性水平设定为 5 × 10^-8。为考虑连锁不平衡（LD）的影响，使用 R² 阈值 0.001 在 10,000 千碱基（kb）的窗口范围内对 SNPs 进行聚类。在此距离内，成对 R² > 0.001 的变异位点被排除，以确保所选工具变量的独立性，并消除潜在的 LD 相关性。异质性检验排除了具有显著异质性的 SNPs（F 统计量 < 10）。最后，为控制混杂因素对工具变量的影响，采用 P < 1×10^-5 的标准剔除回文 SNPs 和不兼容的 SNPs，保留有效的 SNPs 作为工具变量。

双样本孟德尔随机化分析

为了评估免疫细胞表型与高血压（HT）之间的双向因果关系，本研究进行了双样本孟德尔随机化（MR）分析和中介MR分析。具体而言，采用双样本MR方法评估了多个与免疫细胞相关的性状。在这些分析中，应用了多种互补的MR方法，包括逆方差加权法（IVW）²⁴、MR-Egger回归²⁵、加权中位数估计法（WME）²⁶、基于模式的简单估计法²⁷以及加权模式估计法。其中，IVW被指定为主要分析方法，统计学显著性定义为 P < 0.05。选择IVW作为主要MR估计方法，是因为其在精确性与平衡多效性假设之间具有最佳平衡。IVW方法通过对具有较小方差的SNP赋予更高权重，从而提高估计的精确性，产生更可靠的因果估计结果。MR-Egger回归用于评估多效性，即基因影响多个表型的现象。若截距检验显示无显著的水平多效性（P > 0.05），则结合截距评估来判断是否存在多效性。异质性通过MR-Egger和IVW方法的Q统计量进行评估，该统计量用于衡量遗传变异对表型影响的一致性程度；若 P > 0.05，表明遗传变异效应之间无显著异质性。为校正731种免疫表型和1,400种代谢物的多重检验，采用了Bonferroni校正阈值（分别为 P < 6.84 × 10⁻⁵ 和 P < 3.57 × 10⁻⁵）。除非另有说明，所有显著结果均通过了多重检验校正。此外，还使用相同的MR方法评估了反向因果关系，以探讨高血压是否会影响免疫细胞特征。在反向MR研究中，高血压被视为暴露因素，而不同的免疫细胞特征被视为结局变量。

在本研究中，采用两步MR框架进行中介分析，以探讨血浆代谢物是否在免疫细胞表型与高血压（HT）之间的因果通路中起到中介作用。该方法可将免疫细胞表型对HT的总因果效应分解为直接效应和通过鉴定出的代谢中介物传递的间接效应。首先估计免疫细胞对HT的总效应，随后分别估计免疫细胞对代谢物的影响（β1）、代谢物对HT的影响（β2）以及中介效应（β1×β2），其中直接效应通过总效应减去中介效应计算得出。总效应（β_总计) = 直接效应（β_直接）+ 间接效应（β_间接的）；间接效应 = β1 × β2；中介比例（%）= (β1 × β2)/βtotal × 100%，其中 β1 表示免疫细胞表型对血浆代谢物的因果效应，β2 表示血浆代谢物对高血压（HT）的因果效应。采用 delta 法估算间接效应的 95% 置信区间。此外，还进行了反向中介 MR 分析，以探究高血压对代谢物以及代谢物对免疫细胞的因果效应，从而补充正向 MR 的结果，增强因果推断的可靠性。所有分析均通过统计计算环境及相关 MR 软件包完成，所用软件列于下文 材料表.

CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺ Treg 细胞检测

取50 µL抗凝全血，加入各10 µL的靶向CD3、CD4、CD25和CD39的单克隆抗体，在试管中充分混匀。混合物避光，室温孵育15 分钟。随后加入2 mL按1:10稀释的FACS溶血溶液，继续避光、室温孵育10分钟以进行溶血。将试管以约300 x g离心5 分钟，弃去上清液。加入2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）后，再次以约300 x g离心5 分钟。弃去上清液，加入500 µL PBS用于检测。使用多激光流式细胞仪进行检测，并通过配套的采集与分析软件分析，获得CD3⁺CD4⁺CD25⁺Treg细胞的比例及其表达CD39的亚群（CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺Treg）的比例。

异戊酰肉碱（C5）水平的测定

患者的C5水平数据来自内蒙古医科大学附属医院临床检验科。具体而言，C5的检测作为常规液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）的一部分，依据标准化的实验室操作流程和质量控制规范进行。

统计学分析

所有统计分析均使用统计软件环境进行。连续变量根据数据是否呈正态分布，分别采用学生t检验或Wilcoxon秩和检验进行比较。分类变量采用卡方检验进行分析。相关性分析使用Pearson相关分析。以p值< 0.05为差异具有统计学意义。

结果

免疫细胞表型对高血压的遗传因果效应

在排除潜在的混杂因素且无水平多效性（P > 0.05）后，采用两样本孟德尔随机化（MR）分析评估免疫细胞表型对桥本甲状腺炎（HT）风险的因果效应。对于每种作为暴露因素的免疫细胞表型，均计算F统计量以评估工具变量的强度。所有工具变量均超过F > 10 的常规阈值，表明弱工具变量偏倚极小。正文所讨论关键免疫性状的详细F统计量见补充表2。总计有32种免疫相关表型与HT风险显著相关（P < 0.05）（图1）。散点图分析（补充 图2A、B）以及采用留一法进行的敏感性分析（补充图3A,B）进一步支持了这些结果的稳健性。

在主要研究结果中，调节性T细胞（Treg）表型表现出最广泛的关联性，其中CD3在CD39+分泌型Treg上的表达（OR = 1.063；95% CI：1.023–1.105；P = 0.002）以及CD39+活化Treg占总Treg的百分比（OR = 1.081；95% CI：1.008–1.161；P = 0.030）被识别为关键的风险相关特征，并被优先用于中介分析。在T细胞的成熟阶段中，CD3在中央记忆型CD8bright（CM CD8br）细胞上的表达在风险相关特征中效应量最大（OR = 1.094；95% CI：1.040–1.150；P < 0.001），而胸腺来源的双阴性（CD4⁻CD8⁻）活化细胞（TD DN AC）则显示出显著的保护性关联（OR = 0.930；95% CI：0.881–0.982；P = 0.009）。在B细胞表型中，表达HLA-DR的髓系细胞亚群 consistently 表现出增加风险的作用，其中CD33dim HLA-DR+ CD11b⁻细胞上HLA-DR的表达达到OR = 1.095（95% CI：1.032–1.162；P = 0.003）。所有六个免疫细胞类别的完整结果：cDC、Treg、T细胞成熟阶段、TBNK、单核细胞、B细胞及髓系细胞表型，均汇总于 图1中。

敏感性分析进一步验证了结果。基于相关统计评估，未发现显著的异质性或水平多效性证据（补充表3和补充表4）。这些结果得到了“留一法”分析的证实。

高血压对免疫细胞的因果效应

结果表明，高血压（HT）与2种免疫特征呈正向因果关联：分泌型CD4调节性T细胞（1.143: 1.023–1.277；P = 0.018）和单核细胞系髓源性抑制细胞（1.373: 1.058–1.782；P = 0.017）。相反，高血压（HT）与4种免疫特征呈负向因果关联：活化型CD4调节性T细胞（0.818: 0.679–0.987；P = 0.036）、活化型CD4+调节性T细胞（0.790: 0.676–0.924；P = 0.003）、活化与静息型CD4调节性T细胞（0.871: 0.780–0.974；P = 0.015）以及CD25++ CD4+ T细胞（0.855: 0.747–0.980；P = 0.017）（图2）。这些发现提示高血压（HT）与调节性T细胞（Treg）活化状态之间存在相互关联，可能反映了疾病驱动的免疫重塑过程。散点图（补充图4）和“逐一剔除”分析法（补充图5）验证了结果的稳定性，敏感性分析也进一步支持了这些结果。异质性和水平多效性评估进一步证实了本研究结果的可靠性（补充表5 和 补充表6）。上述结论得到了“逐一剔除”分析的支持。

血浆代谢物对高血压的遗传因果效应

在筛选出合适的工具变量并排除连锁不平衡和弱工具变量后，共确定了 34,843 个与血浆代谢物相关的 SNP，最小 F 统计量达到 19.50补充表 7）。采用IVW方法，初步发现9种血浆代谢物与HT存在因果关联。其中，4种代谢物与HT风险升高呈正相关：葡萄糖与麦芽糖比值（1.195：1.082–1.319； P < 0.001），牛磺胆酸（1.190：1.073-1.321； P = 0.001）、5-羟甲基-2-糠酰基肉碱（1.127：1.046-1.215；P = 0.002）和 C5（1.120：1.032-1.215； P = 0.006) (表1).

相反，5 种代谢物可能与高血压（HT）风险呈负相关，包括麦角硫因（0.958：0.927–0.990；P = 0.010）、肉碱与丙酰基肉碱（C3）比值（0.895：0.825–0.970；P = 0.007）、腺苷-5’-二磷酸（ADP）与N-乙酰神经氨酸比值（0.890：0.823–0.963；P = 0.004）、精氨酸与谷氨酸比值（0.882：0.802–0.968；P = 0.009），以及 1-(1-烯基棕榈酰)-2-亚油酰-GPE（p-16:0/18:2）（0.873：0.798–0.955；P = 0.003）。

敏感性分析也验证了结果的稳健性。通过异质性和水平多重性评估，进一步证实了这些结果的可靠性（补充表 8 和 补充表 9）。这些结论得到了“逐一剔除”分析的支持。

血浆代谢物对免疫细胞-HT风险的介导作用

基于先前确定的免疫细胞表型和血浆代谢物，采用两样本孟德尔随机化（MR）策略来估计潜在的中介效应。第一步，以32种免疫细胞表型为暴露因素、9种血浆代谢物为结局进行MR分析，共发现12个显著的因果关联，涉及10种免疫细胞表型和8种血浆代谢物，并获得从免疫细胞到代谢物的相应效应估计值β1。其中，最显著的关联出现在CD39+分泌型调节性T细胞（Treg）表面的CD3与C5水平之间（1.050：1.016–1.085；P = 0.004）。第二步，将C5作为暴露因素、HT作为结局进行MR分析，同时包括MR-PRESSO异常值检测以及异质性和水平多效性评估。未发现异常值SNP，亦无异质性或多效性证据（表2），因此可估计血浆代谢物对HT的因果效应（β2）（补充图6）。

在MR分析的最后一步，进行了中介分析，以明确免疫细胞表型对HT的因果效应是否通过血浆代谢物介导。结果表明，C5水平的升高在CD39+分泌型调节性T细胞上CD3与HT发病风险升高之间的通路中起到了中介作用（补充图7 和 图3）。MR-PRESSO异常值检测、异质性检验和多效性检验均未发现存在偏倚的SNP，也未发现异质性或水平多效性的迹象（表3、补充表10 和 补充表11）。其中，C5水平的中介比例为8.89%（2.34%至15.4%）（P = 0.008）。最后，进行了反向中介MR分析以严格检验方向性假设。在代谢物对免疫细胞的反向MR分析中（C5水平对CD39+分泌型调节性T细胞上CD3），未观察到显著的因果效应（经Bonferroni校正后IVW P > 0.05），支持单向关系（表4）。在HT对代谢物的反向MR分析中（HT对C5水平），也未发现因果关联（经Bonferroni校正后IVW P > 0.05），支持所假设的方向性（表5）。鉴于总体效应较小且双向MR中缺乏相互支持的证据，这些中介分析结果应被视为探索性发现。

流式细胞术检测 CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺ 调节性T细胞

为了验证代谢组学分析的结果， 体外 通过实验验证评估了CD39的表达特征⁺ Treg 和血浆 C5。采用流式细胞术定量 Treg 细胞（CD3⁺CD4⁺CD25⁺）及其 CD39⁺亚群（CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺) 在桥本甲状腺炎患者与健康对照者的外周血中。如图所示 图 4A–C，调节性T细胞（CD3⁺CD4⁺CD25⁺）和 CD39⁺ 与健康个体相比，桥本甲状腺炎（HT）患者的 Treg 亚群显著升高（P < 0.001）。采用串联质谱技术进行靶向血浆代谢组学分析进一步显示，HT组的C5水平显著升高（P < 0.001, 图4D）。此外，Pearson相关性分析显示血浆C5水平与CD39阳性细胞频率之间存在正相关关系⁺调节性T细胞亚群（图4E），与假定的 CD39 一致⁺通过MR鉴定出Treg-C5-HT通路。然而，横断面研究设计和样本量较小限制了仅从这些数据中得出因果推论。

数据可用性：

桥本甲状腺炎的全基因组关联研究（GWAS）汇总统计学数据来自 GWAS 目录（ebi-a-GCST90018855；https://gwas.mrcieu.ac.uk/）。免疫细胞特征的汇总统计学数据来自 GWAS 目录（ebi-a-GCST90001391 至 ebi-a-GCST90002121；https://www.ebi.ac.uk/gwas/）。血浆代谢物 GWAS 数据来自 GWAS 目录（GCST90199621 至 GCST90201020；https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020）。支持本研究结果的数据见补充文件 1。

图1：显示免疫细胞特征对桥本甲状腺炎因果效应的森林图。 本森林图总结了本研究中评估的所有免疫细胞特征对桥本甲状腺炎（HT）的因果效应。缩写：nsnp，单核苷酸多态性（SNPs）的数量；pval，P值；OR，比值比；CI，置信区间。 请点击此处查看此图的放大版本。

图2：森林图显示桥本甲状腺炎对免疫细胞表型的因果效应。 该森林图总结了桥本甲状腺炎（HT）对多种免疫细胞表型的因果效应。缩写：nsnp，SNP数量；pval，P值；OR，比值比；CI，置信区间。 请点击此处查看该图的高清版本。

图3：血浆异戊酰肉碱（C5）在CD39+与桥本甲状腺炎之间中介效应的森林图。 该森林图总结了血浆C5在介导CD39+与HT关联中的因果效应。缩写：OR，比值比；CI，置信区间。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：桥本甲状腺炎患者中 CD39+ 调节性 T 细胞的表达及血浆异戊酰肉碱（C5）水平。 （A）调节性 T（Treg；CD3+CD4+CD25+）细胞及 CD39+ Treg 细胞的流式细胞术设门策略。（B）总 Treg 细胞水平。（C）CD39+ Treg 细胞水平。（D）通过串联质谱法测定的血浆异戊酰肉碱（C5）水平。（E）血浆异戊酰肉碱（C5）水平与 CD39+ Treg 细胞比例之间的 Pearson 相关性分析。缩写：SSC-A，侧向散射面积；FSC-A，前向散射面积；FSC-H，前向散射高度。***P < 0.001，与健康对照组比较。 请点击此处查看本图的放大版本。

表1：九种显著相关的血浆代谢物对桥本甲状腺炎的因果效应。  请点击此处下载该文件。

表2：异戊酰肉碱（C5）水平对桥本甲状腺炎的因果效应（β₂）。 请点击此处下载该文件。

表3：CD3+CD39+调节性T细胞对桥本甲状腺炎的因果效应。 请点击此处下载该文件。

表4：异戊酰肉碱（C5）水平对CD3+CD39+调节性T细胞的因果效应。 请点击此处下载该文件。

表5：桥本甲状腺炎对异戊酰肉碱（C5）水平的因果效应。 请点击此处下载此文件。

补充图1：研究设计与分析工作流程。 请点击此处下载该文件。

补充图2：散点图显示32种免疫细胞特征与桥本甲状腺炎之间关联的因果估计值。 请点击此处下载该文件。

补充图3：评估32种免疫细胞特征对桥本甲状腺炎因果效应稳健性的留一分析。 请点击此处下载该文件。

补充图4：散点图显示桥本甲状腺炎对六种免疫细胞表型的因果效应。 请点击此处下载该文件。

补充图5：采用留一法分析评估桥本甲状腺炎对六种免疫细胞表型因果效应的稳健性。 请点击此处下载该文件。

补充图6：异戊酰肉碱（C5）水平与桥本甲状腺炎风险之间的因果关联。 （A）森林图显示异戊酰肉碱（C5）水平对桥本甲状腺炎（HT）风险的因果效应（β₂）。（B）散点图显示每个单核苷酸多态性（SNP）对HT风险的因果效应估计值。（C）漏斗图用于评估孟德尔随机化（MR）估计值在C5水平对HT风险影响中的异质性。（D）留一法分析表明，整体风险估计值未受到任一单个SNP的显著影响。 请点击此处下载该文件。

补充图7：CD3+CD39+调节性T细胞与桥本甲状腺炎风险之间的因果关联。（A）森林图显示CD3+CD39+调节性T细胞对桥本甲状腺炎（HT）风险的总体因果效应。（B）散点图显示每个SNP对HT风险的因果效应估计值。（C）漏斗图用于评估CD3+CD39+调节性T细胞对HT风险作用的MR估计值异质性。（D）留一法分析表明，任一单个SNP均未对整体风险估计值产生显著影响。 请点击此处下载该文件。

补充表 1：用于孟德尔随机化分析的血浆代谢物全基因组关联研究数据集特征。  请点击此处下载该文件。

补充表 2：作为孟德尔随机化分析暴露因素的关键免疫细胞表型所用工具变量（SNPs）的特征及 F 统计量。 请点击此处下载该文件。

补充表3：免疫细胞表型对桥本甲状腺炎的孟德尔随机化分析中的多效性评估。 请点击此处下载该文件。

补充表4：免疫细胞表型对桥本甲状腺炎的孟德尔随机化分析的异质性评估。 请点击此处下载该文件。

补充表5：基于孟德尔随机化分析桥本甲状腺炎对免疫细胞表型影响的多效性评估。 请点击此处下载该文件。

补充表6：桥本甲状腺炎对免疫细胞表型的孟德尔随机化分析的异质性评估。 请点击此处下载该文件。

补充表 7：与血浆代谢物相关的单核苷酸多态性。 请点击此处下载该文件。

补充表 8：血浆代谢物对桥本甲状腺炎的孟德尔随机化分析中的多效性评估。 请点击此处下载该文件。

补充表9：血浆代谢物对桥本甲状腺炎的孟德尔随机化分析的异质性评估。 请点击此处下载该文件。

补充表10：通过血浆代谢物对免疫细胞表型—桥本甲状腺炎关联的中介分析进行的多效性评估。 请点击此处下载该文件。

补充表 11：血浆代谢物介导的免疫细胞表型与桥本甲状腺炎关联的中介分析异质性评估。 请点击此处下载该文件。

补充文件1：支持本研究结果的数据。请点击此处下载该文件。

讨论

本研究应用孟德尔随机化方法，探讨免疫细胞表型对桥本甲状腺炎（HT）的因果影响，并分析血浆代谢物的潜在中介作用。研究发现，32种免疫表型与HT风险相关，涉及树突状细胞、调节性T细胞、T细胞成熟阶段、B细胞及髓系细胞，兼具促进风险和保护性效应。此外，9种血浆代谢物与HT存在因果关联，并进一步观察到C5可能部分中介了CD39⁺分泌型调节性T细胞表面CD3表达与HT之间的关联。这些发现应被解读为基于遗传工具推断出的潜在因果效应的证据，而非直接的机制性证实。

在cDC表型中，CD62L-浆细胞样树突状细胞占DC百分比以及浆细胞样树突状细胞上的HLA DR与HT风险升高相关，而CD62L+髓系树突状细胞上的CCR2、CD39+活化Treg占活化Treg百分比以及单核细胞上的CD62L则与保护作用相关。本研究发现的特定免疫细胞表型与HT之间的关联为该疾病的发病机制提供了新的见解。例如，HT风险与浆细胞样树突状细胞上的HLA DR以及CD62L-浆细胞样树突状细胞等特征相关，提示这些细胞类型可能在启动或维持针对甲状腺的自身免疫反应中起关键作用²⁸。大量研究表明，HLA DR+甲状腺上皮细胞可主动刺激桥本甲状腺炎（HT）患者甲状腺组织内的免疫反应^28,29,30,31。本研究揭示了浆细胞样树突状细胞上HLA DR的表达与HT风险升高之间存在相关性， 提示浆细胞样树突状细胞上的HLA DR可能是HT的致病因素之一。先前的研究通过生物信息学方法已鉴定出对HT具有高诊断准确性的关键基因，而免疫检测显示单核细胞浸润与这些关键基因的表达呈负相关。Xu等³²报道，单核细胞上CD62L表达水平较高与HT风险降低相关，这与本研究结果一致。具体而言，CD62L+髓系树突状细胞上的CCR2以及单核细胞上的CD62L等表型与保护效应相关，提示其可能具有调节性或抑制性作用，有助于减轻甲状腺自身免疫反应。

大量证据表明，Th17细胞与Treg细胞之间的平衡在桥本甲状腺炎（HT）的发展过程中起着关键作用^33,34。本研究揭示了HT与多种Treg细胞特征之间的因果关系。具体而言，HT的发病风险与CD39+静息调节性T细胞上的CD25表达水平呈负相关，而Th17/Treg比值则随着HT病情进展而升高³⁵。不同Treg表型与HT风险升高或降低之间存在显著相关性，这凸显了调节性T细胞在维持免疫耐受和防止自身免疫性疾病中的复杂功能。Treg细胞具有双重作用，某些亚群可能加剧自身免疫反应，而另一些亚群则具有抑制作用。这强调了进一步研究以精确界定其在HT中作用的必要性。

此外，在T细胞成熟阶段、TBNK、单核细胞和B细胞群中，均观察到一种一致的模式，即某些免疫表型与桥本甲状腺炎（HT）的较高风险相关，而另一些则似乎具有保护作用^32,36,37,38。这凸显了免疫细胞在HT发病机制中的复杂作用。研究还进行了逆向孟德尔随机化（MR）分析，以探讨HT对免疫细胞特征的影响。分析结果显示，HT与某些免疫细胞表型水平的升高相关，例如分泌型CD4调节性T细胞和单核细胞样髓源性抑制细胞（monocytic MDSCs），而与另一些细胞表型水平的降低相关，尤其是活化的CD4调节性T细胞和CD25+ CD4+ T细胞。

值得注意的是，中介分析凸显了C5水平在从免疫细胞表型进展为HT过程中的因果作用。既往研究表明，血浆C5水平可促进糖尿病周围神经病变的发展³⁹，并与肌少症及骨骼肌指数降低相关⁴⁰。此外，在脂质代谢方面，具有衰弱表型的个体中异戊酰肉碱浓度较低⁴¹。本研究观察到的8.89%中介比例提示，C5可能是CD39⁺Treg–HT通路中一个潜在的机制性连接环节，值得在未来的实验和临床研究中进一步探究其作为候选生物标志物和治疗靶点的价值。

尽管本研究提供了有价值的见解，但仍有一些局限性需要考虑。首先，孟德尔随机化（MR）方法依赖于所使用的工具变量有效且不受混杂因素或多效性影响的假设^42,43,44。其次，主要的MR分析基于欧洲血统的全基因组关联研究（GWAS）数据，而免疫细胞的GWAS数据来源于撒丁岛奠基者人群，其独特的连锁不平衡结构可能限制结果的普适性；未来需要在多样化的非欧洲人群中开展研究，以验证其在特定人群中的适用性。第三，中介分析发现C5可能代表一种探索性关联因素。未来需要纳入更多样化人群的研究来确认这些关联，并探索潜在的人群特异性效应。最后，流式细胞术和血浆验证实验为MR结果提供了支持性证据；然而，样本量相对有限。更大规模的实验和临床研究对于验证这些免疫代谢相互作用至关重要，并有助于探索靶向CD39⁺Treg细胞或相关代谢通路是否可为桥本甲状腺炎（HT）提供新的治疗机会。

结论

综上所述，本研究揭示了免疫细胞表型（特别是 CD39⁺ 调节性T细胞）与桥本甲状腺炎（HT）之间的因果关系，并通过探索性中介分析确定 C5 是该通路中的一个潜在中介因子。这些发现揭示了一条新的免疫代谢轴，为自身免疫性甲状腺疾病的机制研究以及生物标志物开发和治疗干预提供了新的思路。未来基于更大规模前瞻性队列的研究可进一步验证这些结果，并探索免疫调节在 HT 治疗中的潜在应用价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CD25-PE 单克隆抗体	BD Biosciences	340938	用于人 CD25 检测的流式细胞术抗体
CD39-PE-Cy7 单克隆抗体	BD Biosciences	567526	用于人 CD39 检测的流式细胞术抗体
CD4-FITC 单克隆抗体	BD Biosciences	340133	用于人 CD4 检测的流式细胞术抗体
D3-APC 单克隆抗体	BD Biosciences	555333	用于人 CD3 检测的流式细胞术抗体
FACS 溶血液	BD Biosciences	349202	用于流式细胞术样本制备的红细胞裂解缓冲液
流式细胞仪	BD Biosciences	FACSCanto II	用于免疫表型分析的多色流式细胞仪
流式细胞术分析软件（FACSDiva）	BD Biosciences	—	用于流式细胞术数据采集与分析的软件
gwasglue 软件包	R 软件包	—	GWAS 数据集整合工具
ieugwasr 软件包	R 软件包	—	IEU GWAS 数据库接口工具
液相色谱–串联质谱系统（LC–MS/MS）	Thermo Fisher Scientific	—	用于血浆异戊酰肉碱（C5）定量分析
磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Fisher Scientific	AM9624	无菌 PBS，pH 7.4，用于洗涤和重悬细胞
R 软件	开源软件	版本 4.4.1	统计分析环境
TwoSampleMR 软件包	R 软件包	—	双样本孟德尔随机化分析软件包
VariantAnnotation 软件包	Bioconductor	—	变异数据注释工具