本研究比较了TRIzol试剂与经典溶液（FBS + DMSO）在非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血单个核细胞（PBMCs）冻存中的应用效果。TRIzol可在长达6个月内维持良好的RNA完整性，因此推荐用于高质量RNA的保存。
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本研究比较了TRIzol试剂与经典溶液（FBS + DMSO）在非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血单个核细胞（PBMCs）冻存中的应用效果。TRIzol可在长达6个月内维持良好的RNA完整性，因此推荐用于高质量RNA的保存。
冷冻保存的外周血单个核细胞（PBMCs）广泛应用于RNA测序（RNA-seq），其RNA质量直接影响检测结果。然而，冷冻保存过程容易导致PBMCs中RNA降解，如何在长期冷冻保存期间提高RNA质量的问题仍未解决。本研究采用晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者新鲜血液样本分离的PBMCs作为对照，比较经典细胞冷冻保存液（90%胎牛血清[FBS] + 10%二甲基亚砜[DMSO]）与常用RNA提取试剂（TRIzol）在-80 ˚在-80 °C下冻存1、3和6个月。采用多通道微量紫外-可见分光光度计和自动化微流控电泳生物分析仪检测RNA浓度、纯度和完整性（以RNA完整性数值[RIN]表示），为高质量RNA样本的保存提供理论依据。本研究显示，随着冻存时间的延长，PBMC中RNA的浓度、纯度和完整性均呈下降趋势。两种处理方法对RNA浓度无显著影响，但对RNA纯度和完整性具有不同作用。使用TRIzol冻存6个月的PBMC，其RNA完整性仍保持在较理想水平。结果表明，TRIzol有助于实现有效的低温保存，并可维持RNA的高质量。
NSCLC 患者外周血单个核细胞（PBMC）的 RNA 测序在评估免疫治疗疗效方面发挥着关键作用。非小细胞肺癌（NSCLC）是全球常见的恶性肿瘤，约 70% 的患者在晚期才被确诊，预后较差1,2。免疫治疗彻底改变了 NSCLC 的治疗模式，提供了创新的治疗策略3,4。在免疫检查点抑制剂（ICI）治疗中，通过对 NSCLC 患者获取的外周血单个核细胞（PBMCs）进行 RNA 测序（RNA-seq），可监测免疫治疗临床获益的动态变化5。RNA-seq 的样本来源包括肿瘤组织和 PBMCs6,7，其中 PBMCs 在临床试验和基础科学研究中均是重要的生物样本8。冷冻保存是长期储存样本的主要方法，可使细胞和组织保持在静息状态，同时维持其生物学潜能和特性。因此，PBMC 的冷冻保存已成为一种可行且广泛应用的方法。冷冻保存的 PBMC 有利于样本的批量分析，减少实验室内部和实验室之间的变异，并优化资源利用8,9。例如，有研究显示，使用添加 40% 胎牛血清（FCS）和 20% 二甲基亚砜（DMSO）的冷冻 RPMI-1640 培养基进行 PBMC 冷冻保存，结果表明在六个月内，共表达 CD39 和 CD73 的 T 细胞和 B 细胞比例保持相对稳定10。一项研究比较了三种商业化的冷冻保存试剂盒以及两种冷冻保护剂（90% RPMI-10% DMSO、90% 血浆-10% DMSO），结果显示不同方法之间的细胞活力（81.0%）和回收率（73.7%）相似。然而，所有冷冻保存的 PBMC 的活力均显著低于新鲜样本5。进一步的研究表明，将重悬的 PBMC 沉淀加入 TRIzol 试剂后立即在 -80 °C 冷冻。1–2 天后观察到，PBMC 的 RIN 值高于全血样本11。
另一项研究比较了使用TRIzol、RNAlater及其他试剂处理的白细胞样本，结果显示所有方法获得的RNA完整性数值（RIN）均>7。RNA完整性通过自动化微流控电泳生物分析仪进行评估，RIN被计算为衡量RNA质量的定量指标。RIN ≥7的样本被认为适用于RNA-seq分析12。值得注意的是，白细胞+RNAlater组的RNA得率显著低于白细胞+TRIzol组12。然而，目前关于PBMC冻存的研究主要集中在解冻后的细胞活力和免疫细胞表型分析上，对于不同保存条件下RNA质量的系统性、长期评估关注较少。此外，用于保存RNA完整性的PBMC冻存标准化操作流程仍不完善13,14,15。这一空白在非小细胞肺癌（NSCLC）免疫治疗中尤为关键，因为纵向采集的高质量PBMC RNA对于可靠的生物标志物发现及治疗反应监测至关重要。
本研究假设，冻存方法的选择会显著影响从外周血单个核细胞（PBMCs）提取的RNA的长期完整性和质量，而优化的冻存方案可保持RNA适用于RNA测序等高灵敏度检测。为验证此假设，采用晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者血液样本 freshly isolated 的PBMCs作为对照。比较两种处理方法（90% FBS + 10% DMSO 和 TRIzol）在-80 °C下保存1、3和6个月后PBMC样本的RNA保存效果（图1）。采用多通道微量紫外-可见光分光光度计和自动化微流控电泳生物分析仪，评估RNA的浓度、纯度及完整性（以RIN值衡量）。本研究旨在为高质量RNA样本的保存提供理论依据，并推动肿瘤精准医学领域的转化研究与样本保存技术的发展。
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本研究中涉及人体组织样本和临床标本的所有操作均遵循机构指南，并经吉林省肿瘤医院伦理委员会批准（伦理审批编号：202507-002-01）。在样本采集前，已从所有参与者或其法定监护人处获得书面知情同意。研究共收集了19例晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者在吉林省肿瘤医院提供的外周血样本（每位患者10 mL），共获得133份RNA样本。为确保实验室安全，所有涉及危险化学品的操作均在生物安全柜中进行。
实验中所用仪器、试剂和耗材的详细信息见材料表。
外周血单个核细胞（PBMC）的分离
外周血样本在采集后2小时内进行PBMC分离处理。采用Ficoll-Paque密度梯度离心法，在室温下以400 × g 离心25分钟（关闭刹车）分离并纯化PBMC。离心后，小心吸取中间乳白色淋巴细胞层（含PBMC）16。重要的是，我们对每份样本和每个组的PBMC输入浓度进行了严格标准化，以确保所有实验条件下细胞数量的一致性，从而最大限度减少因细胞输入量和处理过程带来的变异。这保证了所观察到的差异反映的是不同保存方法的真实效应，而非技术性差异。每位患者的分离PBMC被均分为7管：其中1管用于立即提取RNA，并检测其浓度、纯度和完整性；其余6管以-1 ˚C/min的降温速率进行冷冻保存：3管加入1 mL 90% FBS + 10% DMSO处理，另3管加入1 mL TRIzol处理，随后于-80 °C保存。在冷冻保存1个月、3个月和6个月后，分别进行RNA提取及质量评估。
RNA 提取
将样品从 -80 °C 保存条件下取出，在 4 °C 下解冻至完全融化17。使用 90% FBS + 10% DMSO 或 TRIzol 冷冻保存液保存的样品，用 PBS 洗涤一次，于 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，保留细胞沉淀。采用 TRIzol 法提取总 RNA。具体操作如下：向含有处理后样品的微量离心管中加入 TRIzol 试剂，颠倒混匀，在室温下孵育 5 分钟，以确保充分裂解。随后加入 200 µL 氯仿，剧烈振荡混匀，并在室温下孵育 15 分钟。于 4 °C 下以 2400 × g 离心 15 分钟后，小心吸取上层水相并转移至新的离心管中。加入 0.5 mL 异丙醇，充分混匀，在室温下孵育 5–10 分钟。然后于 4 °C 下以 2400 × g 离心 10 分钟，弃去上清液，管底保留 RNA 沉淀。
将沉淀物用75%乙醇（1 mL）轻轻振荡重悬，随后在4 °C下以1600 × g离心5分钟。弃去上清液，RNA沉淀在室温下空气干燥5–10分钟。最后，将RNA样品溶解于50 µL经DEPC处理的水中，并在55–60 °C水浴中孵育5–10分钟18。RNA浓度与纯度检测。采用多样品微量紫外-可见分光光度计（测量范围：2.5–3000 ng/µL）通过紫外吸收法测定RNA浓度和纯度。RNA浓度根据260 nm处的吸光度值确定，RNA纯度则通过A260/A280比值评估。启动测量软件后，在主界面点击“Nucleic Acid”。检测平台先用双蒸水冲洗两次，然后将1.5 µL RNA样品移液至平台上。选择样品类型为“RNA-40”，点击“Measure”，记录浓度及A260/280纯度值。A260/A280比值在1.9至2.1之间表明RNA纯度较高；比值低于1.8提示存在蛋白质污染，高于2.2则可能提示RNA降解或残留异硫氰酸盐19。
RNA完整性检测
采用自动化微流控电泳生物分析仪及检测试剂盒评估RNA完整性（RIN）。RIN值范围为1至10，其中1表示RNA严重降解，10表示RNA完整。进行分析时，取1.2 µL RNA置于PCR管中，使用PCR仪在70 °C下热变性2分钟，随后立即置于冰上。接着，将1 µL变性后的RNA加入芯片的检测孔中进行分析20。启动软件后，选择"Assays"，然后从下拉菜单中选择"RNA"。根据所用试剂，选择程序"Eukaryote Total RNA Nano Series II.xsy"。点击"Start"以开始检测。约10分钟后，检查梯形条带的峰数量和峰高度是否正常。
统计学方法
对所有数据进行正态性检验。符合正态分布的数据以均值 ± 标准差（SD）表示，不符合正态分布的数据以中位数（四分位距，IQR）表示。两组之间的比较，对于符合正态分布的数据采用配对t检验，对于不符合正态分布的数据采用相关样本非参数检验。对于三组或更多组之间的比较，符合正态分布的数据采用重复测量方差分析，不符合正态分布的数据采用相关样本非参数检验。所有统计分析均使用 SPSS 19.0 和 GraphPad Prism 9 进行。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。
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不同冻存时间和处理方法对PBMC样本RNA浓度的影响
不同冻存时间的影响：以晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的 fresh PBMC 样本作为对照组。样本分别采用 TRIzol 或 90% FBS + 10% DMSO 处理后，在 -80 °C 下冻存 1、3 和 6 个月；随后提取总 RNA 并测定 RNA 浓度。对于 TRIzol 处理的样本，四个组的 RNA 浓度分别为：fresh 组 523.5 (485.0) ng/µL，1 个月组 279.3 (261.7) ng/µL，3 个月组 217.9 (186.9) ng/µL，6 个月组 195.8 (294.8) ng/µL，各组间差异具有统计学意义（P = 0.0196）（图 2A）。对于使用 90% FBS + 10% DMSO 保存的样本，RNA 浓度分别为：fresh 组 523.5 (485.0) ng/µL，1 个月组 221.3 (201.7) ng/µL，3 个月组 156.6 (172.9) ng/µL，6 个月组 303.4 (327.8...
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影响生物样本中RNA质量的因素众多，包括分析前变量、运输条件、室温下处理的持续时间、组织坏死、温度及冷冻产物、分装体积和数量，以及储存时长，这些均对RNA质量有显著影响21。对于相同的样本，冷冻保存时间和处理方法的差异会显著影响RNA质量。既往研究强调了RNA完整性的关键作用，较低的RIN值表明RNA分子断裂比例较高，可能严重损害下游实验的结果。
本研究提出，TRIzol 可替代传统的 90% FBS + 10% DMSO 冻存液，用于晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血单个核细胞（PBMCs）的长期（-80 °C）保存，并有效维持高质量RNA，适用于RNA测序（RNA-seq）。我们建立了一套标准化的PBMC RNA质量评估流程（涵盖细胞分离、RNA提取及质量检测），并通过比较两种冻存液在冻存1、3和6个月后RNA的浓度、纯度和完整性，系统验证了这一核心假设，进而开发出可减轻长期冻存对RNA质量影响的优化方案。
本研究系统评估了不同冷冻保存时间和处理方法对中国台湾晚期非小细...
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作者声明无利益冲突。
我们衷心感谢参与者在实验中的协助以及对基金的支持。本研究得到了吉林省科学技术厅（项目编号：YDZJ202501ZYTS691）和吉林省卫生健康委员会（项目编号：2023jc064）资助项目的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Agilent 2100 生物分析仪 | Agilent | G2939B | 检测RNA完整性，通过生成RNA完整性数值（RIN）评估RNA质量 |
| Agilent RNA 6000 Nano试剂盒 | Agilent | 5067-1511 | 与Agilent 2100 生物分析仪配合使用，提供用于RNA完整性分析的专用试剂和芯片 |
| 离心机 | Eppendorf | 5424R | 用于提取RNA |
| 离心机 | Eppendorf | 5810R | 用于提取外周血单个核细胞（PBMC） |
| 氯仿 | 中国医药集团有限公司 | 20191031 | 用于Trizol法RNA提取，分离含有RNA的水相与含有杂质的有机相 |
| 二甲基亚砜 | 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司 | DH105-2 | 作为PBMC的冷冻保存液，实现样本在-80 °C下的长期保存 |
| 离心管 | Corning | MCT-150-C | 用于样本储存、试剂混合、离心及其他实验操作 |
| 乙醇 | 山东利尔康消毒科技股份有限公司 | 25071901A | 在Trizol法RNA提取中，用于洗涤RNA沉淀以去除残留杂质 |
| 胎牛血清 | Xpbiomed | C04001-500 | 作为PBMC的冷冻保存液，实现样本的长期保存 |
| Ficoll分离液 | 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司 | CC0161 | 用于通过密度梯度离心法分离和纯化PBMC |
| GeneTouch(Plus) 梯度PCR仪 | Bioer | TC-EA-48DA | 用于RNA的热变性处理（70 °C，2分钟），随后进行生物分析仪检测 |
| 异丙醇 | 中国医药集团有限公司 | 20210929 | 在Trizol法RNA提取中，用于RNA沉淀 |
| Nanodrop 8000 分光光度计 | 基康公司 | ND-8000 | 通过紫外吸收法测定RNA浓度（基于260 nm处的吸光度）和纯度（基于A260/A280比值） |
| PCR管 | Corning | PCR-02-C | 用于RNA的热变性处理（70 °C，2分钟），随后进行生物分析仪检测 |
| 磷酸盐缓冲液 | Procell系统 | PB180327 | 用于PBMC的直接裂解与保存，或后续总RNA提取 |
| 三重分离试剂 | Adsin | ads60154 | 用于PBMC的直接裂解与保存，或后续总RNA提取 |
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