本研究建立了一种新方法 体内 慢性中度肾功能不全合并心房颤动的比格犬模型 通过 经导管肾动脉栓塞联合快速心房起搏可严重损害左心房内皮功能，通过炎症反应及肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）介导的途径增强促凝活性，增加血栓形成风险。
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研究文章
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本研究建立了一种新方法 体内 慢性中度肾功能不全合并心房颤动的比格犬模型 通过 经导管肾动脉栓塞联合快速心房起搏可严重损害左心房内皮功能，通过炎症反应及肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）介导的途径增强促凝活性，增加血栓形成风险。
心房颤动（AF）与肾功能不全（RI）的共存是一种临床表现复杂的高发疾病现象。本研究探讨了慢性中度肾功能不全合并心房颤动对比格犬左心房内皮功能的影响。通过使用明胶海绵颗粒经导管栓塞左侧肾动脉主干以诱导慢性肾功能不全，并维持动物3个月，以建立慢性肾实质损伤模型。随后通过持续快速心房起搏（基础起搏周期长度为60 ms，电压为舒张期起搏阈值的4倍，持续180分钟）诱导心房颤动。采用苏木精-伊红染色评估组织学改变。利用酶联免疫吸附测定、实时定量聚合酶链反应及蛋白质印迹法检测血浆和心脏组织中与内皮功能、凝血、纤溶、炎症及肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）活性相关的指标。结果显示，成功建立了中度肾功能不全的慢性肾损伤模型，表现为血浆肌酐和尿素氮水平显著升高，肌酐清除率降低。合并肾功能不全与心房颤动的比格犬左心房内皮功能显著受损，同时伴有促凝作用增强和纤溶功能下降。在肾功能不全手术或心房颤动诱导后，炎症标志物水平升高，而在RI+AF联合组中进一步升高。此外，肾功能不全后肾素和醛固酮水平升高，提示RAAS活性增强，而在合并心房颤动后该活性进一步增加。综上所述，本研究成功建立了比格犬慢性中度肾功能不全合并心房颤动的in vivo动物模型，证实该两种病理状态的共存显著干扰左心房内皮功能，并增加血栓形成风险。
心房颤动（AF）是最常见的持续性心律失常类型，与不良临床结局密切相关。由于AF具有全身性病理生理特征，这种心律失常常与多种共病发生复杂的病理生理交互作用，包括认知功能下降、抑郁以及系统性栓塞1。慢性肾脏病（CKD）已被确认为AF发生以及血栓栓塞事件发生的独立危险因素。约15%至20%的CKD患者伴有AF，而在接受肾脏替代治疗的患者中，AF的发生率则介于15%至40%之间2。同时，约30%至60%的AF患者合并存在轻至中度肾功能不全（RI）3。因此，AF与RI的共存已成为患者群体中一种高发的复杂临床现象。AF与RI之间的双向关系显著增加了AF的发生风险，同时也加剧了肾功能损害的进展，最终导致更差的临床结局4。
既往研究中，大鼠常被用于建立肾功能不全（RI）模型；然而，由于其心脏体积较小，不适合进行心脏电生理实验。相比之下，犬常被用于中大型动物的肾功能不全模型研究，其中肾切除术是主要的建模方法5。然而，该方法的建模成功率有限。更重要的是，由于肾切除术并不能直接引起肾实质损伤，因此难以有效模拟肾功能不全的病理过程。因此，建立一种同时具备肾功能不全和心房颤动（AF）的合适动物模型至关重要。值得注意的是，Liang Z 等人通过使用明胶....
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本研究严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》中的建议（出版号：85-23，1996年修订版）进行。研究方案经北京安贞医院机构动物护理与使用委员会批准（批准号：81700293）。本机构的动物护理与使用委员会对研究方案进行了审查并批准。所有操作均尽可能减轻动物痛苦，并尽量减少实验所用动物数量。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 动物模型与实验设计
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慢性中度肾功能不全与心房颤动的动物模型
实验设计与时间线的示意图如下所示 图1经导管栓塞术前后左侧肾动脉血管造影的代表性图像，如图所示 图2A，B 结果显示，经导管栓塞后，小肾动脉分支成功闭塞，再次血管造影显示远端动脉无显影。肾去神经术（RI）术后三个月，比格犬被实施安乐死，肾脏被取出并拍照。观察发现，与右侧肾脏相比，左侧肾脏明显缩小，并出现多灶性、不规则的苍白区域。图 2C，D）。组织学检查 通过 HE染色显示，与对照组相比，RI组的肾小球严重受损，提示RI手术后大部分肾单位功能丧失（图2E，F。同时，如图所示 表1各组间基线血浆肌酐和尿素氮水平无显著差异。然.......
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本研究建立了一种中度肾功能不全（RI）合并心房颤动（AF）的体内动物模型，并探讨了在此类病理条件下左心房内皮功能障碍的发病机制。本研究的主要发现如下：首先，在比格犬中通过栓塞左主肾动脉3个月成功诱导了中度肾功能不全；其次，比格犬的心房颤动模型被有效建立；第三，在同时患有肾功能不全和心房颤动的动物中，左心房内皮功能显著受损，伴有促凝作用增强和纤溶活性降低，可能导致血栓形成风险增加；第四，慢性中度肾功能不全与心房颤动的共存与显著增强的炎症反应及肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）活性升高密切相关。
评估合并心房颤动（AF）的肾功能不全（RI）患者发生血栓和出血的风险是临床实践中一个关键课题。近期研究也强调了肾功能与心房颤动之间复杂的相互作用，影响血栓栓塞事件的发生12。缺乏合适的RI动物模型一直是限制该领域基础研究的瓶颈。据我们所知，在本研究之前，尚未有报道建立适用于慢性中度RI合并AF的合适大动物模型。既往研究广泛采用大鼠5/6肾切除术作为RI的经典模型；然而，该方法术后死亡率高，并发症严重（如感染），限制了其应用.......
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作者声明无竞争利益。
本工作得到非传染性慢性疾病-国家科技重大专项（编号：2024ZD052500、2024ZD0521504）、国家自然科学基金（资助号：81700293 和 81970272）以及北京安贞医院高水平研究基金（资助项目编号：2025AZB5005）的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6-0 聚丙烯缝合线 | Ethicon (Johnson & Johnson) | 8706H | 用于股动脉修复 |
| 5F 多功能导管 | Cordis (Cardinal Health) | 521-550S | 用于肾动脉插管和栓塞 |
| 6F 四极电极导管 | St. Jude Medical | 401443 | 用于右心房起搏 |
| 6F 血管导入鞘 | Terumo | RS*A60K10SQ | 用于股动脉通路 |
| ABI 7500 实时荧光定量 PCR 系统 | Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) | 4351105 | 用于 qRT-PCR 的热循环和荧光检测 |
| 可吸收明胶海绵颗粒（50 mg 直径） | 金陵制药 | — | 用于经导管肾动脉栓塞；用对比剂与生理盐水（1:1）配制成混悬液 |
| ADMA ELISA 试剂盒（犬用） | Cusabio | CSB-E09297c | 用于血浆不对称二甲基精氨酸测定 |
| 醛固酮 ELISA 试剂盒（犬用） | Cusabio | CSB-E08014c | 用于血浆醛固酮测定 |
| BCA 蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | 用于蛋白质浓度定量 |
| 比格犬（雄性，4–5 岁，10–12 kg） | 上海交通大学农业实验动物场有限公司 | — | 健康雄性比格犬；在标准条件下单笼饲养 |
| C 型臂 X 线透视系统 | GE Healthcare | OEC 9900 Elite | 用于导管插入术和血管造影过程中的透视引导 |
| 化学发光成像系统 | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | 用于 Western 印迹条带可视化 |
| 肌酐 ELISA 试剂盒（犬用） | 南京建成生物工程研究所 | C011-2-1 | 用于血浆肌酐测定 |
| 带气囊的气管插管（内径 7.0–8.0 mm） | Covidien (Medtronic) | 86449 | 用于气管插管和机械通气 |
| DF-5A 心脏刺激器 | 苏州东方电子技术研究所 | DF-5A | 用于快速心房起搏；设置参数：基本周期长度 60 ms，脉宽 2 ms，电压为阈值的 4×倍 |
| ECL Western 印迹底物 | Thermo Fisher Scientific | 32106 | 增强型化学发光检测试剂盒，用于印迹显影 |
| EDTA 抗凝管 | BD Vacutainer | 367835 | 用于血液采集（血浆分离） |
| eNOS 一抗（兔源） | Cell Signaling Technology | 32027 | 稀释比例 1:1000；用于 Western 印迹（约 130 kDa） |
| 伊红 Y 溶液（水溶液） | Solarbio | G1100 | 用于 H&E 复染（2 分钟） |
| 导尿管（Foley 尿管，8 Fr） | C.R. Bard | 0165SI08 | 用于肌酐清除率（CCr）测定期间的定时尿液收集 |
| GAPDH 一抗（兔源） | Cell Signaling Technology | 5174 | 稀释比例 1:1000；作为 Western 印迹内参（约 36 kDa） |
| GraphPad Prism（版本 8.0） | GraphPad Software | — | https://www.graphpad.com；用于统计分析（单因素方差分析，Dunnett 检验） |
| 苏木精溶液（Harris 法） | Solarbio | G1140 | 用于 H&E 核染色（5 分钟） |
| 肝素钠注射液（未分级） | 常州千红生化制药 | H32022088 | 4000 IU 溶于 10 mL 生理盐水中；用于导管插入术期间抗凝 |
| HRP 标记山羊抗小鼠 IgG 二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 | 稀释比例 1:5000；用于 Western 印迹 |
| HRP 标记山羊抗兔 IgG 二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | 稀释比例 1:5000；用于 Western 印迹 |
| hs-CRP ELISA 试剂盒（犬用） | Cusabio | CSB-E08557c | 用于血浆高敏 C 反应蛋白测定 |
| IL-6 ELISA 试剂盒（犬用） | R&D Systems | CA6000 | 用于血浆白细胞介素-6 测定 |
| ImageJ 软件（版本 1.53） | 美国国立卫生研究院 | — | https://imagej.nih.gov/ij/；用于 Western 印迹密度分析 |
| iNOS 一抗（兔源） | Abcam | ab178945 | 稀释比例 1:1000；用于 Western 印迹（约 130 kDa） |
| 乳酸林格液 | Baxter | 2B2324 | 静脉输液；操作期间以 5–10 mL/kg/h 速率输注 |
| 光学显微镜 | Olympus | BX53 | 用于 HE 染色肾组织切片的组织学检查 |
| 机械呼吸机（兽用） | Midmark | Matrx Model 3000 | 潮气量 15 mL/kg；呼吸频率 12–15 次/分钟 |
| 酶标仪 | BioTek | Synergy HTX | 用于 ELISA 在 450 nm 处的吸光度测定 |
| 中性缓冲甲醛（10%） | Solarbio | P1110 | 用于肾组织固定（24 小时） |
| NO ELISA 试剂盒（犬用） | 南京建成生物工程研究所 | A012-1-2 | 用于血浆一氧化氮测定 |
| 非离子型碘化对比剂（碘海醇） | GE Healthcare | Omnipaque 350 | 每次注射 5–8 mL，流速 3 mL/s，用于肾动脉血管造影 |
| PAI-1 ELISA 试剂盒（犬用） | Cusabio | CSB-E13043c | 用于血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1 测定 |
| PAI-1 一抗（兔源） | Abcam | ab66705 | 稀释比例 1:1000；用于 Western 印迹（约 45 kDa） |
| 石蜡 | Leica Biosystems | 39601006 | 用于组织包埋 |
| PrimeScript RT 试剂盒 | Takara Bio | RR037A | 用于 RNA 逆转录为 cDNA |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液 | Thermo Fisher Scientific | 78440 | 加入 RIPA 缓冲液中用于蛋白提取 |
| 脉搏血氧仪（兽用） | Nonin Medical | 9847V | 用于操作期间持续监测 SpO2 |
| PVDF 膜（0.45 μm） | Millipore | IPVH00010 | 用于 Western 印迹中的蛋白转膜 |
| 肾素 ELISA 试剂盒（犬用） | Cusabio | CSB-E08700c | 用于血浆肾素测定 |
| RIPA 裂解缓冲液 | Beyotime | P0013B | 含 50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、1% NP-40、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS |
| 旋转式切片机 | Leica Biosystems | RM2235 | 用于切割 5 μm 厚的石蜡切片 |
| SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（12%） | Beyotime | P0012A | 用于蛋白质电泳分离 |
| 血清分离管 | BD Vacutainer | 367986 | 用于血液采集（血清分离） |
| 戊巴比妥钠 | Sigma-Aldrich | P3761 | 麻醉：静脉诱导剂量 20 mg/kg；安乐死剂量 150 mg/kg 静脉注射 |
| 分光光度计（NanoDrop） | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | 用于 RNA 纯度和浓度评估（A260/A280） |
| SYBR Green PCR 主混合液 | Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) | 4309155 | 用于定量实时 PCR |
| 三导联心电监护仪 | Philips | IntelliVue MX40 | 用于持续心率和心律监测 |
| TM（血栓调节蛋白）ELISA 试剂盒（犬用） | Cusabio | CSB-E12913c | 用于血浆血栓调节蛋白测定 |
| TM 一抗（兔源） | Abcam | ab230010 | 稀释比例 1:1000；用于 Western 印迹（约 60 kDa） |
| TNF-α ELISA 试剂盒（犬用） | R&D Systems | CATA00 | 用于血浆肿瘤坏死因子-α 测定 |
| t-PA ELISA 试剂盒（犬用） | Cusabio | CSB-E08438c | 用于血浆组织型纤溶酶原激活物测定 |
| t-PA 一抗（兔源） | Abcam | ab157469 | 稀释比例 1:1000；用于 Western 印迹（约 70 kDa） |
| TRIzol 试剂 | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 15596026 | 用于从左心耳组织中提取总 RNA |
| 配备 3.5 MHz 相控阵探头的超声系统 | Philips | EPIQ 7C | 用于术前经胸超声心动图检查 |
| 尿素氮 ELISA 试剂盒（犬用） | 南京建成生物工程研究所 | C013-2-1 | 用于血浆尿素氮测定 |
| vWF ELISA 试剂盒（犬用） | Cusabio | CSB-E08437c | 用于血浆血管性血友病因子测定 |
| vWF 一抗（兔源） | Abcam | ab6994 | 稀释比例 1:1000；用于 Western 印迹（约 260 kDa） |