以最少样本量绘制婴儿免疫图谱：整合性单细胞与多组学分析

摘要

本方案描述了从新生儿和儿科患者中采集和保存血液样本的方法，并应用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、蛋白质组学和光谱流式细胞术对这些样本中的免疫细胞群体进行表征。

摘要

出生时，新生儿的免疫系统突然面临一个截然不同的环境，其中富含微生物和环境刺激。越来越多的证据表明，生命早期的免疫系统并非仅仅是未成熟，而是独特地适应了这一发育阶段的特殊需求。在此期间，免疫系统高度动态，经历快速变化以适应不断改变的外部环境。要理解这一复杂且不断演变的免疫格局，必须对新生儿进行直接研究。然而，此类研究的一个主要限制因素是新生儿总血容量较低（约 100 mL/kg），这限制了可用于研究的安全采血量，尤其是在极低出生体重（ELBW）或极度早产的婴儿中。在我们最近的研究中，通过展示如何利用极微量的新生儿血液进行高维免疫谱型分析，解决了这一限制。我们提出了一套优化的纵向采样方案，覆盖生命早期多个时间点，并应用包括流式细胞术、蛋白质组学和单细胞 RNA 测序在内的先进技术，以从最少的样本输入中获取最大信息量。这些方法共同实现了对新生儿循环免疫细胞转录组和蛋白质组特征的全面解析，为生命早期免疫系统的独特发育轨迹提供了新的见解。

引言

本方案针对采集后12小时内处理的100–250 µL血液样本（可立即使用或冻存）进行了优化。出生时，新生儿免疫系统突然进入一个截然不同的环境，其中富含在受保护的宫内环境中原本不存在的微生物和环境刺激物^1,2。这种转变要求免疫系统适应并应对大量新的抗原，这一过程对生存至关重要，但也带来重大挑战^1,2。越来越多的证据表明，生命早期的免疫系统并非仅仅是不成熟或成人免疫系统的微缩版，而是独特地适应了这一关键发育阶段的特定需求^3,4。在此新生儿期窗口内，免疫系统的细胞组分（包括多种T细胞、B细胞和髓系细胞）逐渐成熟，并发展出生命早期特有的特征与功能^5,6,7,8。尽管其重要性显著，但由于伦理和实际限制，新生儿免疫系统仍难以直接研究。主要限制因素之一是新生儿血容量小，平均约为~100 mL/kg^9,10。当从极早产儿（妊娠30周前出生）和极低出生体重（ELBW）婴儿采血时，这一挑战尤为突出，这些婴儿体重可低至400 g，循环血量仅有约40 mL。这限制了可安全采集的血量，凸显出需要采用能从极微量样本中最大化获取数据的方法。为应对这一挑战，本研究展示了利用微量血液样本（100–250 µL），如ELBW婴儿所获得样本，进行高维免疫谱分析的优化方案。

近年来，血液采集和处理技术的进步使得在传统上难以获取样本的人群中研究免疫反应成为可能。微针装置（如Tasso和Touch Activated Phlebotomy系统）最初是为成人居家便捷采血而开发的，现已逐步应用于婴儿，使主要照护者和临床团队能够在最小不适的情况下采集样本。此外，这些装置可在家中使用，避免了反复前往医疗机构带来的压力¹¹，从而提高依从性和可及性。使用该装置时应配合乙二胺四乙酸（EDTA）微量采血管，并按照适当的生物危害防护规程连夜将样本运送至实验室。次日清晨样本到达后，应立即采用红细胞（RBC）裂解法处理，以捕获循环中的免疫细胞⁶。需要注意的是，EDTA采血管适用于活细胞分离，但处理时间至关重要。若需进行刺激性功能检测，样本必须在采集后4小时内处理，理想情况下应在2小时内完成。而对于下文所述的非功能性表型分析，样本应在12小时内处理，以便支持隔夜运输，同时确保细胞回收率，因为细胞活力会随时间推移而下降¹²。与传统的Ficoll密度梯度分离法相比，裂解法更快捷、劳动强度更低，且细胞回收率更高¹³。然而，通过裂解法分离外周血单个核细胞可能残留污染性粒细胞，导致纯度降低，但对于关注这些细胞类型的研究而言，这一特点反而可能具有优势¹⁴。这些权衡突显了在研究新生儿等稀有或敏感临床样本时，方法学上的调整如何在可行性与准确性之间取得平衡。分离后细胞的后续处理也得益于方法学的改进。使用胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）进行冷冻保存仍是免疫细胞处理的可靠方法，尤其适用于胎儿和新生儿血液样本，因为在这些样本中细胞活力和回收率尤为关键。在优化血液采集流程的同时，我们还采用了多种下游技术，以从微量样本中获取最大信息量。本文介绍了一套经过优化的实验方案，支持在整个生命早期阶段进行采样，从而实现对免疫动态变化的深入分析。我们的方法结合了光谱流式细胞术、蛋白质组学和单细胞RNA测序等先进技术，共同提供了对生命早期循环免疫细胞蛋白质组和转录组特征前所未有的洞察。此外，光谱流式细胞术还能够在细胞用量极少的情况下提供功能层面的深入信息。

多年来，已有多种技术被用于分析血液来源的免疫细胞，例如全血细胞计数（CBC）¹⁵；此外，也有研究利用DNA甲基化分析新生儿全血样本中的免疫细胞比例^16,17。尽管这些技术有助于了解已知免疫细胞的相对比例，但在缺乏多组学系统的情况下，我们仍难以深入解析细胞的特性。全血细胞计数仅能提供主要血细胞类型的粗略指标，在临床环境中可用于评估整体免疫状态，但其在识别细胞亚型或功能状态方面存在局限性。最近，一些研究开始通过分析婴儿出生后第一周内血浆来源的转录组和代谢组变化来弥补这一不足¹⁸。基于质谱的蛋白质组学已被应用于新生儿样本中的免疫谱型研究¹⁹。该方法能够以无偏倚的方式检测大量蛋白质，并可用于发现潜在的生物标志物，具有强大优势。然而，其关键局限性包括需要相对较多的蛋白质输入量，以及尽管可检测可溶性和不溶性蛋白质，却无法直接提供细胞身份信息。靶向多重蛋白质组学检测（TMPA）为低输入量样本提供了替代方案。这类方法采用靶向抗体检测技术，可在样本量有限的情况下实现高灵敏度的蛋白质谱型分析。其中一种方法已被用于纵向追踪生命早期免疫系统的发育轨迹²⁰。

流式细胞术通过将荧光标记的细胞逐个通过聚焦激光束，并检测所产生的光散射和荧光信号，从而实现对单个细胞水平上免疫细胞蛋白的定量分析。在该技术中，荧光标记的抗体与特定的细胞表面或胞内蛋白结合，从而可根据荧光特征同时检测和量化多种免疫细胞亚群及其特征性标志物。光谱流式细胞术进一步拓展了这一方法，通过捕获每种荧光染料的完整发射光谱，实现精确的光谱解混，可在单次检测中同时分析超过35种标志物^21,22,23。这使得可检测的标志物数量远超传统流式细胞术面板，后者通常仅限于约8至12种标志物。作为这些细胞分析技术的补充，单细胞RNA测序（scRNA-seq）通过使用极少量起始材料即可实现高分辨率、无偏倚的转录组分析，已彻底改变了免疫学研究²⁴。尽管成本较高且依赖于细胞活性，与群体测序相比，scRNA-seq在解析生命早期免疫异质性方面提供了无与伦比的洞察力。总体而言，这些技术进步表明，样本采集、保存与分析方面的创新正在不断被优化，以应对胎儿和新生儿免疫研究中的独特挑战。

本方案已针对通过连续红细胞裂解法分离的冻存外周免疫细胞的分析进行了优化。当研究需要从小体积血液（100–500 µL）中进行高分辨率免疫谱分析，尤其是需要进行纵向分析时，研究人员应考虑采用本方案。该方法广泛适用于足月和早产新生儿，并可兼容多种下游分析，因此适用于新生儿及儿科免疫学领域的多种研究问题。

方案

根据耶鲁大学机构审查委员会（IRB）的规定，确保获得父母知情同意，并完全遵守相关国家的伦理法规。按照批准的IRB方案，研究团队在婴儿出生后的第一周内联系父母，以在入组前获得其同意。在获得书面伦理批准之前，未开展任何涉及人类来源材料的研究操作。

1. 样本采集、处理与保存（图1）

1. 住院患者血液采集
   1. 收到婴儿样本后立即收集并处理，于 4 °C 保存，并在采集后 12 小时内完成处理。
   2. 采集约 250 µL 全血，储存于含抗凝剂 EDTA 的采血管中。将采血管轻轻颠倒 8 次以充分混匀抗凝剂。
   3. 按照第 1.3 节（全血样本处理）所述方法，通过红细胞裂解法处理全血。
   4. 采集干血斑时，使用无菌采血针在清洁后的足趾/足跟部位进行穿刺。
      1. 或者，从 EDTA 管中吸取约 25–30 µL 血液滴加至滤纸上，轻轻将滤纸接触血滴。
   5. 每个圆圈用自由流动的血液填充至少一次，每圈一滴。让血斑自然干燥，滤纸需保持敞开状态直至血斑完全干燥。
   6. 正确标记采集时间、处理日期、时间点及样本编号。
   7. 将血斑卡放入透明塑料自封袋中。若需长期保存稳定性，应于 −20 °C 或 −80 °C 保存，直至进行蛋白质组学分析。
2. 门诊患者血液采集
   ​注：经耶鲁大学机构审查委员会批准，门诊参与者家长可选择在家中使用微针自采装置采集血液样本。该装置通过皮肤上的采血针获取毛细血管血。选择此方法的家长在门诊接受示范工具包培训后，会获得详细的书面说明和家用采样套件。
   1. 使用前洗手并佩戴手套。准备好所有必需物品，若仅一位家长操作采血，建议准备一面镜子。
   2. 从工具包中取出装置，并拧下配套采血管的盖子。
   3. 将采血管插入装置，直至紧密贴合，确保刻度线朝外。
   4. 脱去婴儿尿布，将婴儿直立抱稳。
   5. 按照热敷包说明书激活加热。
      ​注：若无热敷包，可采用其他加热方式（如用手加热）。
   6. 将热敷包置于采血部位（臀部）持续 2–4 分钟，以促进局部升温及血流增加。
   7. 用酒精棉片清洁采血区域，待其自然干燥。
   8. 取下红色按钮上的透明保护盖。撕开装置上的标签，将装置牢固粘贴于婴儿臀部最丰满处，同时保持婴儿直立。
      ​注：根据需要调整婴儿姿势，确保采血管始终保持完全垂直，以利于正确采血。
   9. 一次性将按钮完全按下后释放。设定计时器为 5 分钟，必要时借助镜子观察采血管内血液填充情况。
   10. 前 1–2 分钟内可能未见血液流出。最多等待 5 分钟，或当血液在 5 分钟内达到顶部指示线时，立即取下装置。
   11. 轻微旋转并向下拉出采血管。迅速将盖子完全扣紧。将采血管至少颠倒混匀 10 次，每次颠倒均需确保血液接触管盖，以防凝血。
   12. 采集后应立即安排样本次日送达运输。
3. 全血样本处理
   1. 在生物安全柜中处理血液样本。
   2. 小心将 250 µL 血液转移至含有 10 mL 1× 红细胞裂解缓冲液的 50 mL 锥形管中。用 10 mL 红细胞裂解缓冲液冲洗原采血管至无残留。室温（RT）静置 15 分钟，使细胞充分裂解。
   3. 裂解完成后，加入约 30 mL 室温 PBS 洗涤，于 4 °C 以 430 × g 离心 5 分钟。使用真空泵小心吸除上清液，避免扰动沉淀。
   4. 继续按照步骤 1.3.2 的方法转移和冲洗样本，直至细胞沉淀中无可见红细胞残留。以 430 × g 离心 5 分钟，小心吸除上清液，避免扰动沉淀。
   5. 每采集 250 µL 血液，将所得细胞沉淀重悬于 2 mL 冻存液（含 10% DMSO 的 FBS）中，并分装至两个冻存管中保存。
   6. 使用台盼蓝排斥法，通过血细胞计数板对重悬于冻存液中的细胞进行计数，检测细胞活力。
   7. 从步骤 1.3.5 中取出 1 mL 液体分别加入每个冻存管。正确标记采集时间、处理日期、时间点及样本编号。
   8. 将冻存管暂时置于含异丙醇的冻存盒中，于 -80 °C 保存。24 小时后，转移至液氮中长期保存，直至准备进行分析。

2. 从干血斑（DBS）中提取TMPA（图2）

1. 处理当天，将滤纸恢复至室温。使用3 mm金属打孔器，在血液渗透区域中央尽可能居中的位置，于滤纸上打2-3个孔。
2. 用镊子夹取每个3 mm打下的滤纸片，放入含有20 µL洗脱缓冲液（1x PBS、1x蛋白酶抑制剂、0.05% Tween 20）的96孔板孔中或低吸附PCR管中。确保滤纸片完全浸没于洗脱缓冲液中。
3. 盖紧管盖或将板用塑料封板膜覆盖，置于数字旋涡振荡器上，600 rpm转速下室温孵育60分钟。
4. 孵育结束后，小心将洗脱液转移至新的低吸附离心管或96孔板中，弃去含有滤纸片的管或板。
5. 使用BCA法测定蛋白含量。
   1. 取每份样本或BSA标准品2 µL，用去离子水进行1:10和1:100的系列稀释。将15 µL稀释后的样本或标准品加入200 µL的1x工作液中，每个样本和标准品设两个复孔。37 °C孵育30分钟。
   2. 使用酶标仪在562 nm波长处读取吸光值。根据BSA标准曲线斜率及洗脱缓冲液空白背景值计算最终蛋白浓度。
6. 将蛋白浓度为0.5–1 mg/mL的样本分装至低吸附1.5 mL螺口微量离心管中，每管30 µL。将样本于-80 °C冷冻保存，后续提交进行TMPA服务处理。

3. 红细胞裂解全血的光谱流式细胞术（图3）

1. 实验当天，将一管经红细胞裂解的细胞在37 °C水浴中快速解冻，直至仅剩微小冰粒。
2. 将细胞悬液加入含有10 mL预热（37 °C）完全RPMI培养基的15 mL锥形管中（完全RPMI培养基的配制：500 mL RPMI 1640、50 mL FBS、5.6 mL青霉素-链霉素和5.6 mL谷氨酰胺补充剂）。在400 × g 室温下孵育5分钟。小心移除并弃去上清液。
3. 轻轻将沉淀重悬于3 mL完全RPMI培养基中，采用适当方法进行细胞计数。
4. 将重悬的细胞在400 × g 室温孵育5分钟。吸除并弃去上清液。
5.  将细胞浓度调整至 1 × 10⁶ cells/mL 的完全RPMI培养基中，每孔加入100 µL（含0.1 × 10⁶ 个细胞）至96孔V型底培养板中。在764 × g 4 °C下离心2分钟，弃上清液。
6. 除未染色对照外，向所有样本中加入100 µL以PBS配制的Live/Dead染料原液（1:2,000稀释）以及Fc阻断剂和单核细胞阻断剂（均为1:100稀释）。4 °C孵育15分钟。
7. 用 100 µL PBS 洗涤，764 × g 离心 g 4 °C下离心2分钟。小心弃去上清液。
   注意：必须使用 Fc 封闭和单核细胞封闭，以防止抗体的任何非特异性结合。
8. 向除未染色对照外的所有样品中加入100 µL用FACS缓冲液（500 mL PBS，2.5 g牛血清白蛋白（BSA），2 mM EDTA，pH 8.5）按1:200稀释的表面标记抗体混合物。在4 °C孵育30分钟。
9. 用 100 µL FACS 缓冲液洗涤，在 764 × g 条件下离心 g 4 °C下离心2分钟。小心弃去上清液。
10. 向每个样本中加入100 µL 4%多聚甲醛固定细胞，在室温避光孵育15分钟。
11. 用 100 µL FACS 缓冲液洗涤，在 764 × g 4°C 下离心 2 分钟，用 200 µL FACS 缓冲液重悬。
12. 将超补偿微珠制备为单色对照。使用与样本相同的方案对单色对照微珠进行染色，若样本经过固定，则微珠也需进行固定。
13. 使用与样本相同的步骤制备荧光减一（FMO）对照。
    注意：单色对照和FMO（荧光减一对照）的处理方式必须与样本完全相同。例如，如果样本在染色后进行固定，则FMO和单色对照也应进行固定。
14. 在常规/光谱流式细胞仪上运行样本、单色对照、未染色对照和FMO对照。使用软件分析数据。
15. 根据相应的同型对照和FMO对照设置门控。首先，在前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）散点图上圈选细胞，以选择白细胞群体，从而排除碎片并根据细胞大小和颗粒度进行细胞筛选。
16. 在白细胞筛选后，利用前向散射面积（FSC-A）与前向散射高度（FSC-H）的散点图设门排除双联体细胞。
    注意：这可确保选择单个细胞（单细胞），位于对角线上的细胞被视为单细胞，而双细胞和细胞团则被排除。
17. 使用活率染料对细胞进行活率门控，以排除死细胞，确保后续分析仅包含活细胞。
18. 经过上述初步设门步骤后，进一步对活单细胞根据特定谱系标志物设门，以细分不同的免疫细胞群体。将活单细胞分为CD33⁺ 髓系细胞和 CD33^- 基于CD33表达的淋巴细胞
19. 在 CD33 内部⁺ 群体，分化 CD14⁺ 单核细胞并鉴定CD11c⁺ 树突状细胞（DCs）定义为表达CD11c但不表达CD14的细胞。
20. 在CD33内^- 淋巴细胞群体，圈选CD3⁺ T细胞及亚群门控以鉴定CD4⁺ 和 CD8⁺ T细胞亚群
21. 此外，鉴定 CD56⁺ 通过CD56表达鉴定自然杀伤（NK）细胞，并通过CD19表达圈定CD19+ B细胞。

4. 红细胞裂解血液的单细胞RNA测序（图4）

1. 在37 °C水浴中解冻一管冻存的红细胞裂解细胞。将样品加入含有10 mL T细胞培养基的15 mL锥形管中。在4 °C下以430 × g离心5分钟，弃去上清液。
2. 向样品中加入10 mL 1× PBS。在4 °C下以430 × g离心5分钟，弃去上清液。
3. 用台盼蓝染色计数细胞并评估细胞活力。若细胞活力低于70%，则使用死细胞去除试剂盒进行死细胞去除。
   1. 死细胞去除
      1. 使用无菌的双蒸水将20×结合缓冲液原液稀释，得到1×工作液。
      2. 每1 × 10⁷ 个总细胞，用100 µL死细胞去除微珠重悬细胞沉淀。充分混匀，并在室温（RT）下孵育15分钟。
      3. 将磁性分离柱插入合适的磁力架中。使用500 µL 1×结合缓冲液冲洗柱子，以平衡柱子并准备使用。
      4. 用1×结合缓冲液将细胞体积调至500 µL。将细胞悬液加至柱子中，并用新的1.7 mL微量离心管收集穿流液。
      5. 用500 µL结合缓冲液洗涤两次，每次穿流液均收集至同一微量离心管中。
      6. 将穿流液在300 × g下离心10 分钟，弃去上清液。
   2. 用台盼蓝染色重新计数细胞并评估其活力。
   3. 在新的1.7 mL微量离心管中，用含0.04% BSA的40 µL PBS重悬20,000个活细胞。
   4. 立即将细胞置于冰上，送至基因组核心设施进行文库构建和测序。以Cell Ranger输出格式获取测序结果。

结果

我们从10名极早产婴儿的三个时间点采集了干血斑（DBS）卡片：出生后1周（n = 12）、1个月（n = 7）和2个月（n = 3），用于TMPA蛋白质组学分析⁶（图2A）。这些样本与足月婴儿脐带血（TCB；n = 4）和健康成人血液（AB；n = 5）一同进行分析。使用TMPA平台定量了92种免疫相关蛋白的标准化蛋白表达量（NPX）（图2B）。统计分析显示，到2月龄时，早产儿外周血中淋巴细胞激活基因3（LAG3）和信号阈值调节跨膜衔接蛋白1（SIT1）的表达水平显著高于TCB（图2C）。

我们通过流式细胞术对一名患者经红细胞裂解后的白细胞样本中的免疫细胞群体进行了分析图3A我们采用了一套全面的设门策略，以准确鉴定并分离特定的白细胞亚群 (

讨论

从极少量的新生儿和婴儿血液中获取高质量的免疫学数据，需要在多个步骤中进行方法学上的调整。在本方案中，我们描述了四种互补的策略：（i）优化血液采集和冷冻保存方法，以维持细胞活性并用于后续实验；（ii）应用光谱流式细胞术进行多参数免疫表型分析；（iii）采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）高分辨率解析免疫细胞异质性；以及（iv）使用TMPA。这些方法共同作用，在应对样本体积有限和技术挑战的同时，最大限度地提高数据产出。

血液采集与保存是决定下游实验成功的关键因素。我们发现，在红细胞裂解后，含有10% DMSO的FBS冻存液可在大多数免疫细胞中实现较高的回收率，这与既往关于DMSO保护作用的研究结果一致²⁸。冻存过程中的操作至关重要：细胞必须迅速转移至程序控温冻存容器中，因为DMSO在室温下具有毒性，操作延迟会增加细胞死亡的风险²⁹。样本在-80 °C下保存时间不应超过24小时，以避免冰晶积累。从采集到处理的时间是另一个关键步骤；超过12–24小时后，细胞活力会显著下降

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA，pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15575-038
1× 红细胞裂解缓冲液	Invitrogen	3177165
BCA 蛋白检测试剂盒	Abcam	ab287853
BD Microtainer MAP 微量离心管	Fisher Scientific	22-253-270
Bel-Art Cryo-Safe -1°C 冷冻控制器	Millipore Sigma	41122800
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A9647-100G
Brilliant Ultra Violet 496 抗人 CD3	Thermo Fisher Scientific	364-0038-42
Brilliant Ultra Violet 661 抗人 CD11c	BD BioScience	612968
Brilliant Vil750 抗人 CD14	BioLegend	367135
Brilliant Violet 570 抗人 CD8a	BioLegend	301038
Brilliant Violet 711 抗人 CD56	BioLegend	318336
cOmplete Mini 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物	Millipore Sigma	11836170001
死细胞去除试剂盒	Miltenyi Biotec	130-090-101
二甲基亚砜（DMSO）	Thermo Fisher Scientific	BP231-100
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（DPBS），不含钙、不含镁	Thermo Fisher Scientific	14190144
胎牛血清（FBS）	Gibco	A5256801
Fisherbrand 数字涡旋混合器	Thermo Fisher Scientific	02215418
固定缓冲液	BioLegend	420801
GlutaMAX 补充剂	Gibco	35050061
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-201
名称	公司	目录编号
OctoMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-109
Pacific Blue 抗人 CD4	BioLegend	344619
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Thermo Fisher Scientific	15140-122
RB780 抗人 CD33	BD Biosciences	755606
Rierdge 3 mm 金属打孔器	Rierdge	sdd231031pc-01
RPMI 1640 培养基	Gibco	11875-093
Spark UV 387 抗人 CD19	BioLegend	302289
Tasso 采样试剂盒	Tasso	N/A
Thermo Scientific 螺口微量离心管	Thermo Fisher Scientific	14-755-287
Whatman 309 蛋白保存卡	Cytiva	41111700
Zombie NIR 可固定活力检测试剂盒	BioLegend	423105
软件与程序包
Adobe Illustrator	2024
bbknn	1.5.1
FlowJo	10.8.1
GraphPad Prism	9.4.0
名称	版本
Scanpy	1.9.1
Scrublet	0.2.3
商用检测试剂盒
Chromium 单细胞 5’ 试剂盒	10X Genomics	PN-1000263
Olink Reveal 或 Target 96 炎症检测面板	Olink	https://olink.com/products/olink-target-96