以最小输入绘制婴儿免疫图谱：整合单细胞与多组学分析

摘要

本方案描述了从新生儿和儿科患者采集和保存血液样本，并应用scRNA-seq、蛋白质组学和光谱流式细胞术来表征这些样本中的免疫细胞群体。

摘要

出生时，新生儿免疫系统突然面临一个截然不同的环境，充满了微生物和环境刺激。越来越多的证据表明，早期免疫不仅不成熟，而是独特地适应了这一发育窗口的特殊需求。在此期间，免疫系统高度动态，迅速变化以适应外部环境的变化。理解这一复杂且不断演变的免疫格局需要直接研究新生儿。然而，此类研究的一个主要限制是新生儿总血容量较低（~100 mL/kg），这限制了安全采集的血量，尤其是在极低出生体重（ELBW）或极早产儿中。在我们最近的研究中，我们通过演示如何使用极小体积的新生儿血液进行高维免疫分析，解决了这一局限性。我们引入了一套针对早期生命的纵向采样优化方案，并采用流式细胞术、蛋白质组学和单细胞RNA测序等先进技术，以最大化从最小输入中获得的信息。这些方法共同使得对新生儿循环免疫细胞的转录组和蛋白质组特征有了全面的了解，为早期免疫的独特轨迹提供了新的见解。

引言

该方案优化于采集后12小时内处理100-250微升血液样本，可冷冻保存或立即使用。出生时，新生儿免疫系统被投入到一个截然不同的环境中，充满了此前在受保护的子宫^{内环境中缺乏}的微生物和环境刺激 ^1,2。这一转变要求免疫系统适应并应对大量新抗原，这一过程对生存至关重要，但也带来了^{重大挑战 1,2}。越来越多的证据表明，早期免疫不仅仅是不成熟或成年免疫系统的缩小版。相反，它独特地针对这一关键发展期的具体需求量身定制 ^3,4。在新生儿期窗口期内，免疫系统的细胞组成部分，包括各种类型的T细胞、B细胞和髓系细胞，成熟并发展出^{早期生命中}特有的特性和功能5,6,7,8。尽管新生儿免疫具有重要性，但由于伦理和实际的限制，直接研究仍然困难。一个主要限制是新生儿血容量较小，平均约为100 mL/^kg9,10。当采集极早产儿（出生于孕30周前）和ELBW婴儿的血液时，这一挑战尤为明显，这些婴儿体重可降至400克，循环血量仅40毫升。这限制了安全采集血液的数量，凸显了从极少样本中最大化数据产出的方法的必要性。为应对这一挑战，我们的研究展示了利用微小血容量（100-250微升）进行高维免疫分析的优化方案，例如从ELBW婴儿中获得的血量。

血液采集和处理技术的最新进展使得在传统上样本采集困难的人群中免疫反应的研究成为可能。像Tasso和触摸激活放血系统这样的微针设备最初是为了方便成年人的居家采血而开发的。此后，它们已被改装用于婴儿，使初级照护者和临床团队能够在最小不适的情况下采集样本。此外，它们可以在家中使用，无需因反^复临床就诊而感到压力，从而促进了依从性和可及性。应与设备配合使用乙二胺四乙酸（EDTA）微管，并按照相应的生物危害规程隔夜送往实验室。第二天早晨，样本到达后，应使用红细胞（RBC）溶解方法处理，捕捉循环中的^{免疫细胞6}。值得注意的是，EDTA管能够实现活细胞分离，但时间因素也很重要。对于功能性刺激检测，样品必须在采集后4小时内完成处理，理想情况下不超过2小时。对于下文所示的非功能性表型检测，样本应在12小时内处理，以便隔夜运输并确保恢复，因为细胞存活率会^{随时间下降}。与传统的Ficoll密度梯度分离相比，裂解更快、劳动强度更低，且回收率^更高。然而，通过裂解分离外周血单核细胞可能会留下污染的粒细胞，降低纯度，但对对这些细胞类型的研究有利¹⁴。这些权衡凸显了方法学适应如何在研究稀有或敏感的临床样本（如新生儿样本）时，在可行性和准确性之间取得平衡。分离细胞的下游处理也因方法学的改进而受益。使用胎儿牛血清（FBS）和二甲基亚砒（DMSO）冷冻保存仍然是免疫细胞，尤其是在胎儿和新生儿血液中，细胞存活性和恢复至关重要的过程中，依然是一项稳健的方法。除了优化采血流程外，我们还采用了下游技术，能够从小样本量中提取最大限度的信息。我们引入一套优化方案，促进早期生命的采样，实现对免疫动态随时间的详细检查。我们的方法利用了光谱流式细胞术、蛋白质组学和单细胞RNA测序等先进技术，共同提供了对早期循环免疫细胞蛋白质组和转录特征的无与伦比视角。此外，光谱流式细胞术还能以最小的细胞输入获得功能洞察。

多年来，多种技术如全血细胞计数（CBC）被用于分析血液来源的免疫细胞¹⁵，而其他技术则利用DNA甲基化分析新生儿全血样本中的免疫细胞比率^16,17。虽然这些技术有助于了解已知免疫细胞的比例，但没有多组学系统，我们在深入了解细胞方面仍存在局限性。CBC仅能广泛测量主要血细胞类型，使其在临床环境中有助于确立整体免疫状态，但在解析亚型或功能状态方面能力有限。最近，研究开始通过在婴儿出生第一周时就采用血浆来源的转录组和代谢组变化来解决这一^限制。基于质谱的蛋白质组学已被应用于研究新生^{儿样本中的}免疫谱。这种方法非常适合以无偏的方式测量广泛的蛋白质，并识别潜在的生物标志物。然而，关键局限性包括需要较大的蛋白质输入量，以及尽管捕获了可溶性和不可溶性蛋白质，但缺乏直接的细胞身份信息。靶向多重蛋白质组学测定（TMPA）为低输入样本提供了替代方案。这些方法采用靶向抗体检测，为材料有限的样本提供高灵敏度的分析。其中一种仪器被用来追踪早期免疫发展轨迹的纵向²⁰。

流式细胞术通过将荧光标记细胞通过聚焦激光束，测量由此产生的光散射和荧光信号，实现单细胞层面的定量分析。在该技术中，荧光标记抗体结合特定表面或细胞内蛋白。这使得能够同时检测和定量多种免疫细胞亚型及其基于荧光谱的特征。光谱流式细胞术通过捕捉每种氟色素的完整发射光谱，实现精确的光谱解混，并在单一测定^21、22、23中同时检测超过35个标记。这使得分析的标志物数量远多于传统流式细胞术面板，后者仅限于8~12个标记。作为这些细胞计量技术的补充，单细胞RNA测序（scRNA-seq）通过实现高分辨率、无偏的转录组分析，彻底改变了免疫学研究，从极少的输入材料中实现了高分辨率、无偏的转录组分析²⁴。尽管成本更高且依赖细胞存活率，scRNA-seq相比大批量测序提供了无与伦比的早期免疫异质性洞察。这些进展共同展示了收集、保存和分析领域的创新如何被调整以克服研究胎儿和新生儿免疫的独特挑战。

该方案已优化用于分析通过连续红细胞溶解分离的冷冻保存的外周免疫细胞。如果研究人员的研究需要对小体积血液（100-500微升）进行高分辨率免疫分析，尤其是在纵向分析至关重要时，应考虑该方案。该方法广泛适用于足月和早产儿，并兼容多种后续分析，适合新生儿和儿科免疫学的多样化研究问题。

方案

根据耶鲁大学机构审查委员会（IRB），确保了知情家长同意并全面遵守相关国家伦理法规。根据批准的IRB协议，研究团队在婴儿出生后第一周内联系父母，以获得同意，以便入组。在有文献证据的伦理批准之前，没有启动涉及人类来源材料的研究程序。

1. 样本采集、处理与储存（见图1）

1. 住院血液采集
   1. 收到婴儿样本后收集并处理，保存在4°C，并在采集后12小时内处理。
   2. 收集~250微升全血，储存在抗凝EDTA血液收集管中。将血液收集管倒置8次，混合抗凝剂。
   3. 按照第1.3节（全血样本处理）描述，通过红血溶解处理全血。
   4. 要采集干燥的血迹，可以用无菌针在清理过的脚趾和脚跟上做一个刺伤。
      1. 或者，将EDTA管中25-30微升的血液移液器移至滤纸上。轻轻用滤纸接触血滴。
   5. 每个圈至少用一滴流动的血液填满一个圈。让血迹干。保持滤纸张开，直到血迹完全干燥。
   6. 适当标注采集时间、处理日期、时间点及标本鉴定。
   7. 放入透明塑料拉链储物袋中。将血点卡保存在−20°C或−80°C，以延长稳定性，直到蛋白质组分析准备。
2. 门诊血液采集
   注意：经耶鲁大学机构审查委员会批准，门诊参与者的家长可选择在家中使用微针自采集设备采集血液样本。该装置通过将针刺贴入皮肤获取毛细血管血。选择该方法的家长接受了使用示范套件的门诊培训，随后获得了详细的书面说明和家庭用采集套件。
   1. 使用前务必洗手并戴手套。收集所有必要物品，包括如果只有一方家长采集血液，还要准备一面镜子。
   2. 将设备从工具箱中取出，拧开兼容管子的盖子。
   3. 将管子压入装置，直到密封，填充线朝外。
   4. 脱掉婴儿的尿布，将婴儿扶直。
   5. 按照加热包的说明启动。
      注意：如果没有背包，请使用其他加热方式，比如手。
   6. 将热敷包放在部位（臀部）2-4分钟，以加热并增加血流。
   7. 用酒精棉片清洁该区域并晾干。
   8. 把红色按钮上的透明盖取下来。从装置上撕下拉环，牢牢贴住婴儿臀部最丰满的部分，同时保持他们直立。
      注意：根据需要调整姿势，保持管子完全垂直以便正确采血。
   9. 把按钮按到底一次然后松开。把计时器设为5分钟。根据需要，用镜子观察管子的注水情况。
   10. 血可能在最初1-2分钟内不会出现。在总共最多5分钟后取出装置，若血液在5分钟内达到顶端指示线，则更早。
   11. 稍微扭转一下管子，然后往下拉。迅速把盖子完全扣回管子。将输卵管至少倒置10次，确保每次倒置时血液接触盖子，以防止凝血。
   12. 采集后，样本过夜寄送。
3. 全血样本处理
   1. 在生物安全柜中处理血液样本。
   2. 小心地将250微升血液转移到一个50毫升锥形管中，内含10毫升1x红细胞溶解缓冲液。用10毫升红细胞溶解缓冲液冲洗血液收集管直到空。让细胞在室温（RT）下裂解15分钟。
   3. 溶解完成后，在RT下添加~30毫升PBS，洗涤后以430× 克 在4°C下旋转5分钟。 用真空抽取上清液，不要扰动沉淀。
   4. 按照步骤1.3.2继续转移和冲洗样本，直到细胞沉淀中出现可见红细胞。在430× 克 离心5分钟，然后小心地去除上清液，不扰动沉淀。
   5. 每收集250微升血液，将所得细胞颗粒重新悬浮于2毫升冷冻培养基中（FBS中10% DMSO），并分成两个冷冻保存。
   6. 通过使用血细胞计（使用特兰蓝排除法）计数在摄取培养基中再悬浮的细胞，检查细胞存活率。
   7. 将1.3.5步的1毫升液体转移到每个冷冻瓶。适当标注采集时间、处理日期、时间点及标本鉴定。
   8. 将低温容器在-80°C的冷冻容器中与异丙醇一起中间保存。24小时后，将低温容器转移到液氮中，直到准备分析。

2. 干血斑（DBS）（图2）

1. 处理当天，将滤纸送去复射。用3毫米金属穿孔器在血迹穿过的地方穿孔2-3圈，尽量正中血点。
2. 用镊子取每个3毫米冲头，加入96孔板或低结合PCR管，内含20微升洗脱缓冲液（1xPBS，1x蛋白酶抑制剂，0.05%Tween 20）。确保冲孔被洗脱缓冲液覆盖。
3. 关闭管子或用塑料裙板覆盖板子，放置在以600转/分钟旋转的数字漩涡上，持续60分钟的RT。
4. 孵育结束时，小心将洗脱液转移到新的低结合管或96孔板上。用过滤器冲头把管子或板子扔掉。
5. 使用BCA测定定量蛋白质含量。
   1. 取每种样品或BSA标准品2微升，分别在水中进行1：10和1：100的序列稀释。通过将15微升稀释样品或标准样品加入200微升1x工作溶液中，制备样品和标准品。在37°C下培养样本30分钟。
   2. 用板读器读取562纳米的信号。根据BSA标准斜率和洗脱缓冲液背景计算最终蛋白质浓度。
6. 在低结合的1.5 mL螺旋盖微管中，为样品以30微升为单位，浓度为0.5-1 mg/mL。将样本冷冻至-80°C，以便后续提交，使用TMPA服务处理。

3. 红细胞溶解血的光谱流式细胞术（见图3）

1. 实验当天，在37°C的水浴中快速解冻一瓶红细胞，直到只剩下一小滴冰。
2. 将细胞悬浮液加入一个15毫升锥形管中，内含10毫升预热（37°C）完整RPMI（用500毫升RPMI 1640、50毫升FBS、5.6毫升青霉素和5.6毫升谷氨酰胺补充剂制备）。在室温下用400× 克 离心机离心5分钟。小心地取出并丢弃上清液。
3. 轻柔地将沉淀液重新悬浮在3毫升的完全RPMI中，并采用适当方法测定细胞计数。
4. 在室温下以400× 克 旋转复浮的细胞5分钟。抽吸并丢弃上清液。
5. 在完全RPMI下将细胞浓度调整为1×10⁶细胞/毫升。每孔注入100微升（0.1×10⁶电池）到96孔V底板。在764× 克 离心机加热2分钟，温度为4°C，然后去除上清液。
6. 在除未染色对照组外的所有样本中，以1：2000稀释的PBS中加入100微升活/死染料，含Fc块和单核细胞块（1：100稀释）。在4°C下孵育15分钟。
7. 用100微升PBS洗涤，离心机在764× 克 下4°C下清洗2分钟。 小心地丢弃上清液。
   注意：必须使用Fc阻滞和单核细胞阻滞，以防止抗体的非特异性结合。
8. 在所有样品中加入100微升表面鸡尾酒，该混合物在FACS缓冲液中稀释（1：200稀释）（500毫升PBS，2.5克牛血清白蛋白（BSA），2 mM EDTA，pH 8.5），除未染色对照组外。在4°C下孵育30分钟。
9. 用100微升FACS缓冲液清洗，离心机在764× 克 、4°C下清洗2分钟。 小心地丢弃上清液。
10. 在每个样品中加入100微升4%对甲醛固定细胞。在夜间用RT孵蛋15分钟。
11. 用100微升FACS缓冲液清洗，在4°C下以764× 克 离心2分钟，然后再悬浮于200微升FACS缓冲液中。
12. 准备超合成珠子作为单色控制。使用与样品相同的方法染色单色控制珠，包括如果样品固定，则进行固定。
13. 使用与样品相同的方法制备荧光-1（FMO）对照。
    注意：对单色控制和FMO的处理应与采样相同。例如，如果样品染色后已定型，FMO和单色控制也应相应固定。
14. 在传统/光谱流式细胞仪上运行样本、单色对照、未染色对照和FMO对照。使用软件分析数据。
15. 根据合适的同型和FMO控制设置门。首先，通过前向散射（FSC）与侧散射（SSC）图选择白细胞群，帮助排除碎片并根据大小和粒度选择细胞。
16. 白细胞选择后，通过前向散射面积（FSC-A）与前向散射高度（FSC-H）的图，进行门控细胞排除双重态。
    注意：这确保了单胞体（单胞体）的选择，沿对角线落下的胞体被视为单胞体，而双胞体和团块则被排除。
17. 通过活细胞检测活体细胞，使用活体染料排除死细胞，确保后续分析仅包含活细胞。
18. 在这些初步门控步骤之后，进一步对活细胞进行门控，以识别特定的谱系标记，以细分不同的免疫细胞群体。根据CD33表达，将活细胞分裂为CD33⁺ 髓系细胞和CD33^- 淋巴细胞。
19. 在CD33⁺ 群体中，区分CD14⁺ 单核细胞，并将CD11c⁺ 树突状细胞（DC）识别为表达CD11c但不表达CD14的细胞。
20. 在CD33^- 淋巴细胞群体中，通过门控CD3⁺ T细胞和亚门来识别CD4⁺ 和CD8⁺ T细胞亚组。
21. 此外，通过CD56表达识别CD56⁺ 自然杀伤（NK）细胞，通过CD19表达识别CD19+ B细胞门控。

4. 红细胞溶解血的scRNA测序（见图4）

1. 在37°C的水浴中解冻一瓶冷冻保存的红细胞。将样本加入15毫升锥形管中的10毫升T细胞培养基中。离心机在430× 克 ，4°C下5分钟。 丢弃上清液。
2. 再往样品中加入10毫升1x PBS。离心机在430× 克 ，4°C下5分钟。 丢弃上清液。
3. 用锥蓝计数细胞并评估存活率。如果存活率低于70%，则使用死细胞清除套件进行死细胞清除。
   1. 死细胞去除
      1. 用无菌双蒸馏水稀释20倍结合缓冲液，得到1倍工作溶液。
      2. 将细胞沉淀悬浮在每1×10个7个细胞中，使用100微升的死细胞去除微珠。充分混合后，在室温（RT）下孵育15分钟。
      3. 将磁性分离柱插入相应的磁性支架中。使用前用500微升1x结合缓冲液冲洗色谱柱至平衡。
      4. 将细胞体积提升至500微升，并使用1倍结合缓冲液。将细胞悬浮液涂于柱上，并收集流动液到新的1.7 mL微离心管中。
      5. 用500微升结合缓冲液洗两次。在同一根微离心管中收集流水。
      6. 用300× 克 离心机加热洗出液10分钟。丢弃上清液。
   2. 用锥蓝数细胞并评估其存活能力。
   3. 将2万个活细胞重新悬浮在40微升PBS中，含0.04% BSA的新型1.7毫升微离心管中。
   4. 立即将冰冻的细胞送往基因组核心设施进行文库生成和测序。收集以Cell Ranger输出格式的测序结果。

结果

我们从10名极早产儿的三个时间点采集了DBS卡：1周（n = 12）、1个月（n = 7）和2个月（n = 3），进行TMPA蛋白质组学分析⁶ （见图2A）。这些样本与足月婴儿脐带血（TCB;n = 4）和健康成人血（AB;n = 5）一同分析。使用TMPA平台定量了92个免疫相关蛋白的归一化蛋白表达（NPX）（见图2B）。统计分析显示，早产儿外周血中淋巴细胞激活基因3（LAG3）和信号阈值调节跨膜适配器1（SIT1）的表达显著高于TCB（见图2C）。

我们通过流式细胞术分析患者红细胞溶解白细胞样本中的免疫细胞群体（见图3A）。我们采用了全面的门控策略，准确识别和分离特定的白细胞亚群 （

讨论

从极少量的新生儿和婴儿血液中获得高质量的免疫数据，需要跨多个步骤进行方法学调整。本方案介绍了四种互补策略：（i）优化血液采集和冷冻保存以保留可存活细胞以供后续应用，（ii）光谱流式细胞术用于多参数免疫表型分析，（iii）scRNA-seq以高分辨率解析免疫异质性，以及（iv）TMPA。这些方法共同最大化数据产率，同时解决样本量有限和细胞种群脆弱的技术挑战。

血液采集和保存是后续成功的关键决定因素。我们发现，含有10% DMSO的FBS冷冻培养基在红细胞溶解后，大多数免疫细胞能实现高度恢复，这与之前关于DMSO保护效果的发现一致²⁸。冷冻过程中必须正确处理：细胞必须迅速转移到控速冷冻容器中，因为DMSO在RT上有毒，延迟会增加细胞死亡风险²⁹。样品在-80°C下保存时间不应超过24小时，以避免冰晶积累。从采集到处理的时间是另一个关键步骤;超过12-24小时³⁰小时后存活率大幅...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA，pH 8.0	赛莫飞世尔科学公司;	15575-038
1x红细胞溶解缓冲液	Invitrogen	3177165
BCA蛋白质检测试剂盒及nbsp;	Abcam	ab287853
BD Microtainer MAP 微管	费舍尔科学公司;	22-253-270
贝尔-阿特低温安全 -1&度;C 冻结控制器	米利波尔西格玛	41122800
牛血清白蛋白（BSA）	西格玛-奥尔德里奇	A9647-100G
《璀璨紫外线496反人类CD3 》;	赛莫飞世尔科学公司;	364-0038-42
Brilliant Ultra Violet 661 反人类 CD11c	生物科学学士及nbsp;	612968
Brilliant Vil750 反人类 CD14	生物传说	367135
辉煌紫罗兰570反人类CD8a	生物传说	301038
辉煌紫罗兰711反人类CD56	生物传说	318336
cOmplete，迷你型，无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒	米利波尔西格玛	11836170001
死细胞清除套件	米尔滕尼生物技术公司及nbsp;	130-090-101
二甲基硫酸盐（DMSO）及nbsp;	赛莫飞世尔科学公司;	BP231-100
杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（DPBS），不含钙、镁及;	赛莫飞世尔科学公司;	14190144
胎儿牛血清（FBS）及nbsp;	Gibco	A5256801
Fisherbrand 数字漩涡混音器	赛莫飞世尔科学公司;	02215418
固定缓冲器及nbsp;	生物传说	420801
GlutaMAX补充剂	Gibco	35050061
MACS 多站立	米尔滕尼生物技术公司及nbsp;	130-042-303
手稿列目	米尔滕尼生物技术公司及nbsp;	130-042-201
名称	公司	目录号
OctoMACS 分离器	米尔滕尼生物技术公司及nbsp;	130-042-109
太平洋蓝反人类 CD4	生物传说	344619
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	赛莫飞世尔科学公司;	15140-122
RB780 反人类 CD33	BD生物科学	755606
Rierdge 3mm 金属冲击器	Rierdge	SDD231031PC-01 
RPMI 1640 中型	Gibco	11875-093
Spark UV 387 反人类 CD19	生物传说	302289
塔索收藏套件	塔索	无
Thermo Scientific 螺旋盖微管	赛莫飞世尔科学公司;	14-755-287
Whatman 309 蛋白质保护器	Cytiva	41111700
僵尸近红外可修复可修复可行工具包	生物传说	423105
<强>软件和包
Adobe 插画师	2024
BBKNN	1.5.1
FlowJo	10.8.1
GraphPad 棱镜	9.4.0
名称	版本
斯坎皮	1.9.1
斯鲁布莱特	0.2.3
<强>商业测定
铬单胞5英尺球衣	10X基因组学	PN-1000263
Olink 揭示或目标96炎症面板	奥林克	https://olink.com/products/olink-target-96