皮内肿瘤移植作为小鼠肿瘤内免疫治疗研究的稳健模型

摘要

随着人们对肿瘤内免疫治疗的兴趣日益增加，选择易于操作且实用的肿瘤模型至关重要。皮下肿瘤虽然易于建立，但难以观察和操作。在本方案中，我们描述了建立皮内肿瘤的方法，该方法可提供更佳的可见性和可及性。

摘要

建立可重复的小鼠肿瘤模型对于评估癌症生物学和免疫治疗策略至关重要。瘤内免疫治疗通过向已形成的肿瘤注射免疫刺激试剂，以逆转局部免疫抑制并激发全身性抗肿瘤免疫反应。目前大多数小鼠癌症研究将肿瘤建立在皮下空间，但由于无法观察瘤内注射过程，该方法在实验性瘤内免疫治疗中存在固有挑战。通过表皮内注射肿瘤细胞可可靠地生成可视化的肿瘤，从而支持准确且可重复的瘤内注射，并便于监测肿瘤生长动力学及治疗反应。本文以C57BL/6小鼠中使用小鼠B16F10黑色素瘤模型为例，介绍一种建立和治疗表皮内肿瘤的可重复方法。将肿瘤细胞悬液进行表皮内注射，在肿瘤植入后7–10天，当肿瘤体积达到约60 mm³时，可直接进行瘤内注射免疫刺激剂，或施加电穿孔、加热等物理治疗。该方法可实现治疗药物的精确定位递送，并使用游标卡尺准确测量肿瘤生长，避免了因无法观察而导致的多次皮下肿瘤治疗所固有的变异性问题。本文通过详细阐述该技术，旨在支持瘤内免疫治疗领域临床前研究的可重复性并推动其发展。

引言

小鼠肿瘤模型是癌症研究中不可或缺的工具。在理想的小鼠模型中，能够诱导出在基因和形态学水平上都高度模拟人类肿瘤的肿瘤¹。这使得研究人员能够在不同领域评估新型治疗方法的有效性，包括肿瘤内免疫治疗（ITIT）。ITIT 是癌症治疗中的一个新兴领域，其方法是将免疫刺激剂直接注射到肿瘤微环境（TME）中。这种局部给药方式可增强局部免疫激活，逆转免疫抑制性的肿瘤微环境，并引发全身性的抗肿瘤免疫反应，即所谓的远端效应²。然而，肿瘤内注射的效率、准确性和一致性取决于在不同肿瘤模型中对注射参数进行可视化和控制的能力。

大多数临床前癌症研究采用皮下肿瘤移植模型。然而，这种方法在进行瘤内治疗时存在局限性，因为在注射过程中无法直接观察肿瘤，除非实施手术。许多瘤内免疫治疗策略需要将试剂精确递送至小鼠的微小肿瘤中，并且通常需要多次完成该操作。若缺乏可视化确认，皮下肿瘤的注射准确性和试剂保留率将难以控制，这可能导致实验数据的误读或出现较大变异³。

皮内肿瘤植入为肿瘤的观察、测量以及瘤内注射提供了一种直接、易于操作、可直观监测且可重复的方法，从而提高了实验的一致性。此外，研究显示，与皮下注射相比，皮内植入的肿瘤可增强肿瘤细胞的免疫原性，并抑制其致瘤性⁴。皮内接种的....

方案

所有操作均经机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循其指南⁵。所有动物实验均在达特茅斯动物实验中心进行。使用6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠，在通风笼架中按照标准条件饲养，自由摄食饮水。所用试剂和设备列于材料表中。 

1. 小鼠脱毛

注意： 所有人员在进行这些操作之前，必须完成机构提供的活体动物操作和麻醉培训。

1. 在进行皮内注射前，按照下述方法剃除每只小鼠 flank 部的毛发；注射操作及以下所述步骤均使用右侧 flank。在接种肿瘤细胞的前一天剃毛。
2. 将小鼠置于稳定的表面上。用左手拇指和食指捏住小鼠颈背部皮肤使其固定，并轻轻将小鼠左侧身体 tucked 进手掌中，以暴露右侧体侧。用无名指和/或小指固定左侧腿部和尾巴，确保右侧 flank 完全暴露。
3. 从后肢向上至下部肋骨区域剃除毛发，以形成清晰的注射区域。
4. 如果需要额外的操作练习空间，可同时剃除两侧 flank 的毛发。
   注意：初学者在学习剃毛和正确固定小鼠时，可对小鼠实施麻醉。

2. 使用染料练习注射

结果

使用染料练习注射时，可通过观察注射部位是否形成可见的“水泡”来确认皮内注射是否成功，而无需处死小鼠。正确的皮内注射会产生一个大而清晰且隆起的“水泡”（图1A–F）。若水泡较小或扁平，提示注射可能部分进入皮下组织。若未形成“水泡”，且染料或细胞在皮肤下扩散，则注射很可能已进入皮下层（图1G–J）。若在练习注射后处死动物，可切开皮肤以识别是否有注射液泄漏至皮下间隙。

皮内注射后约5天，肿瘤应变得可见，7–10天后应适合进行治疗。为确认肿瘤位于皮内而非皮下，可采用两种验证方法。首先，可用非优势手轻轻提起小鼠背部皮肤，用优势手触诊肿瘤以进行检查。皮内肿瘤通常触感坚实、固定且不可移动（图2A、B）；而皮下肿瘤触感较软或呈“松软”状，通常可自由移动，边界较不清晰（图2C

讨论

该方案的成功（图4）依赖于保持一致的皮内注射深度和精确的针头定位，以确保将物质注入真皮层而非皮下层。如果针头角度过陡或注射压力过高，染料或肿瘤细胞可能穿透皮肤进入皮下间隙。注射后，在缓慢拔出针头前短暂停顿，有助于防止液体渗漏或在 flank 部位形成双灶性肿瘤（“雪人”样外观）。在练习注射和操作小鼠时，应始终牢固握持小鼠，以最大限度降低意外针刺伤的风险。若出现问题，可通过观察是否形成可见的“水泡”来排查，该现象表明针头位于皮内；同时确保注射器在使用前不含气泡。保持皮肤紧绷可提高注射准确性，定期更换注射器则可避免针头变钝，从而维持操作精度。在雄性小鼠上进行练习有助于建立稳定的技术，因其皮肤较厚且延展性较差。

使用 freshly prepared 肿瘤细胞悬液也至关重要，因为长时间在冰上保存会降低细胞活力和成瘤率。在注射过程中通过轻柔倒置悬液可保持细胞分布均匀，确保小鼠间肿瘤生长的一致性。在比较不同实验组之间的肿瘤生长动态或免疫反应时，必须注意这些技术细节。当肿瘤生长至适合瘤内注射的大小时，应小心处理所有治疗溶液。确保每种溶.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 天然离心管	USA Scientific	1615-5500
150 cm2 细胞培养瓶	康宁	430825
Fluriso	Vet One	13985-528-60	异氟烷
食用色素	Durkee		用于练习
胰岛素注射器 0.33 x 12.7 mm	Exel	26018
迷你 Arco	Wahl	08787-450A	使用电推剪为小鼠剃毛
PBS，1×，无钙 &和镁	康宁	06325002	pH 7.4 ± 0.1
RPMI 1640, 1x	康宁	12225004
SomnoFlo 低流量电子蒸发器	Kent Scientific	SF-01	麻醉机