一种在纳米盘中稳定膜蛋白的技术

摘要

本研究概述了将TWIK相关酸敏感性K⁺通道2（Task2）膜蛋白重组到纳米盘中的实验步骤。通过单颗粒冷冻电子显微镜技术验证了其成功组装，获得了清晰的二维分类平均图像。

摘要

许多膜蛋白在基于去污剂的环境中提取时表现出稳定性差、活性丧失以及样品异质性等问题，这对高分辨率冷冻电子显微镜分析构成了重大挑战。纳米盘技术通过使用膜支架蛋白（MSPs）和磷脂，将目标蛋白重构到类似天然的脂双层中，从而克服了这些局限性。在本研究中，人源钾离子通道Task2在适当去污剂存在下进行表达、增溶和纯化，随后进行纳米盘组装。所建立的方案提供了一套可重复的操作流程 ，并通过若干关键验证步骤得以证实：尺寸排阻色谱（SEC）谱图中明显的峰位移动表明颗粒尺寸增大，SDS-PAGE中Task2与MSP共迁移，以及获得具有良好定义的二维分类平均图像并可见二级结构特征。初步的三维重构结果进一步验证了嵌入纳米盘中蛋白的结构完整性。该方法通过提高样品纯度、均一性和颗粒质量，为Task2的高分辨率结构研究提供了可靠平台，同时也为其他膜蛋白的研究提供了可推广的方法框架。

引言

膜蛋白在细胞信号转导、代谢物运输、维持细胞结构完整性和免疫应答中发挥着关键作用。膜蛋白的失调与多种疾病相关，使其成为药物研发的重要靶点¹。冷冻电子显微镜（cryo-EM）的发展使得对大分子量且具有动态特性的膜蛋白进行结构研究成为可能²。获得高分辨率结构的主要挑战在于如何将这些蛋白从其天然的脂双层环境中提取出来，同时保持其天然构象和生物化学功能。此外，膜蛋白高度动态的构象以及抗体筛选的复杂性，为靶向药物发现带来了额外的障碍^3,4。传统的膜蛋白提取方法通常使用去垢剂来模拟疏水性脂双层的性质。然而，这种方法常常会破坏膜蛋白的稳定性，导致蛋白聚集或部分去折叠⁵。此外，去垢剂可能去除对稳定蛋白构象至关重要的脂分子，从而可能改变蛋白构象甚至损害其功能，限制了其在抗体筛选及其他下游应用中的使用⁶。

纳米盘技术最初由 Sligar 及其同事提出⁷这种自组装结构通常由载脂蛋白A1（ApoA1）衍生物（即MSPs）与合成或天然脂质共同形成，可为膜蛋白提供稳定的环境。^7,

方案

1. 脂质储备液的制备

1. 脂质制备
   1. 使用三种磷脂制备脂质混合物：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）、2-油酰基-1-棕榈酰基甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）和1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸（POPS）。
   2. 使用上述脂质在氯仿中的预配储存液，每种浓度均为25 mg/mL。
      注意：操作氯仿时必须佩戴个人防护装备，所有操作均需在通风橱中进行。氯仿应储存在专用的化学品柜中。
   3. 由于氯仿具有挥发性，使用微量注射器量取前应检查脂质储存液体积是否与初始记录一致。若发生蒸发，需用纯氯仿补足至原体积，并充分混匀。
      注意：每次测量前，应用氯仿冲洗微量注射器两次。
   4. 按质量比DOPE:POPC:POPS = 2:1:1配制100 µL脂质混合物。根据该比例，取V_DOPE 50 µL、V_POPC 25 µL和V_POPS 25 µL。按照计算所得体积量取相应溶液，加入玻璃试管中并充分混匀。
   5. 将玻璃试管置于水浴中，以减少氯仿的挥发，并保持环境温度稳定。
2. 脂质膜制备
   1. 在温和的氮气流下蒸发氯仿，直至液体完全去除，在试管底部形成透明、均一的凝胶状薄膜。
      注意：确保玻璃试管底部可见均匀干燥的脂质....

结果

脂质储备液成功制备的标志是超声处理后形成澄清透明的溶液。对于MSP蛋白，镍亲和层析获得了纯度较高的产物，浓度约为3 mg/mL。纳米盘的组装通过尺寸排阻色谱（SEC）得以确认，其洗脱曲线呈现特征性图谱（图2）。与纳米盘组装前的Task2蛋白SEC图谱（图1）相比，组装后的蛋白峰向更高的洗脱体积（即更晚洗脱）方向偏移。如图2所示，SEC图谱显示两个主要峰：组装完成的纳米盘复合物在15.1 mL处洗脱，游离MSP在18.0 mL处洗脱。我们通过积分峰面积来量化组装效率。组装纳米盘峰的面积为147.2，游离MSP峰面积为31.5，计算得组装效率为82.4%（计算公式：组装纳米盘峰面积 / 总蛋白峰面积）。该定量结果表明，绝大多数MSP已成功与Task2蛋白共同组装进入纳米盘中。目标蛋白与MSP在SDS-PAGE中的共迁移进一步验证了二者共同存在于单一纳米盘复合物中（图3）。最后，经SEC纯化的纳米盘样品被浓缩后进行冷冻电镜（cryo-EM）分析。所得二维分类平均图像.......

讨论

本文介绍了一种通过去除去垢剂将去垢剂溶解的膜蛋白重组到纳米盘中的方法，从而为膜蛋白提供更接近天然状态的脂双层环境。该组装过程的成功取决于多个关键因素。其中最重要的是膜蛋白、膜支架蛋白（MSP）与脂质之间精确的化学计量比。不恰当的化学计量比可能导致蛋白聚集或组装失败。例如，首次尝试使用1:2:50的比例组装纳米盘时，导致Task2蛋白完全聚集。因此，优化化学计量比对于实现成功组装至关重要。脂质储备液的制备以及合适MSP的选择同样关键。脂质组成必须经过优化，以形成均一且透明的溶液，模拟天然膜环境。此外，MSP亚型的选择决定了纳米盘的直径，必须根据目标膜蛋白的大小进行匹配¹⁷。选择能够形成直径大于目标蛋白的纳米盘的MSP，对于容纳并稳定蛋白可能发生的构象动态变化至关重要。

膜蛋白在纳米盘中的成功重建依赖于通过多种正交标准进行的严格验证²⁰。在本研究中，我们遵循了这些既定标准，以证明Task2-纳米盘样品的完整性。我们的生化验证依据Vilela等人¹³

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物珠	Bio-rad	1523920
胆固醇半琥珀酸酯	Anatrace	CH210
氯仿	Sinoreagent		在通风橱中使用
DOPE	Avanti	850725P
甲醇	Sinoreagent
n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷	Anatrace	D310
正戊烷	Adamas		在通风橱中使用
POPC	Avanti	850457P
POPS	Avanti	840034P
SEC	Bio-rad		遵循制造商提供的操作规程正确使用
SnakeSkin 透析管	Thermo	68011
Superose 6 Increase10/300 GL	Cytiva	29091596
超滤离心柱 Amicon Ultra-15	Millipore	UFC905008