一种在纳米盘中稳定膜蛋白的技术

摘要

本研究概述了将TWIK相关酸敏感性K⁺通道2（Task2）膜蛋白重组到纳米盘中的实验步骤。通过单颗粒冷冻电子显微镜技术验证了其成功组装，获得了清晰的二维分类平均图像。

摘要

许多膜蛋白在基于去污剂的环境中提取时表现出稳定性差、活性丧失以及样品异质性等问题，这对高分辨率冷冻电子显微镜分析构成了重大挑战。纳米盘技术通过使用膜支架蛋白（MSPs）和磷脂，将目标蛋白重构到类似天然的脂双层中，从而克服了这些局限性。在本研究中，人源钾离子通道Task2在适当去污剂存在下进行表达、增溶和纯化，随后进行纳米盘组装。所建立的方案提供了一套可重复的操作流程 ，并通过若干关键验证步骤得以证实：尺寸排阻色谱（SEC）谱图中明显的峰位移动表明颗粒尺寸增大，SDS-PAGE中Task2与MSP共迁移，以及获得具有良好定义的二维分类平均图像并可见二级结构特征。初步的三维重构结果进一步验证了嵌入纳米盘中蛋白的结构完整性。该方法通过提高样品纯度、均一性和颗粒质量，为Task2的高分辨率结构研究提供了可靠平台，同时也为其他膜蛋白的研究提供了可推广的方法框架。

引言

膜蛋白在细胞信号转导、代谢物运输、维持细胞结构完整性和免疫应答中发挥着关键作用。膜蛋白的失调与多种疾病相关，使其成为药物研发的重要靶点¹。冷冻电子显微镜（cryo-EM）的发展使得对大分子量且具有动态特性的膜蛋白进行结构研究成为可能²。获得高分辨率结构的主要挑战在于如何将这些蛋白从其天然的脂双层环境中提取出来，同时保持其天然构象和生物化学功能。此外，膜蛋白高度动态的构象以及抗体筛选的复杂性，为靶向药物发现带来了额外的障碍^3,4。传统的膜蛋白提取方法通常使用去垢剂来模拟疏水性脂双层的性质。然而，这种方法常常会破坏膜蛋白的稳定性，导致蛋白聚集或部分去折叠⁵。此外，去垢剂可能去除对稳定蛋白构象至关重要的脂分子，从而可能改变蛋白构象甚至损害其功能，限制了其在抗体筛选及其他下游应用中的使用⁶。

纳米盘技术最初由 Sligar 及其同事提出⁷这种自组装结构通常由载脂蛋白A1（ApoA1）衍生物（即MSPs）与合成或天然脂质共同形成，可为膜蛋白提供稳定的环境。^7,8,9MSP 通过包绕脂质双层的疏水边缘形成盘状结构。该结构具有一个与脂质酰基链尾相互作用的疏水表面，从而稳定膜蛋白，同时具有朝外的亲水表面，使膜蛋白能够在水溶液中保持可溶性。¹⁰纳米盘为膜蛋白研究提供了一个多功能平台。通过在接近天然的脂质环境中保存纯化的膜蛋白，纳米盘克服了传统去垢剂方法的局限性，维持了膜蛋白的构象和生物学功能 体外因此，该方法已成为膜蛋白结构研究的有力工具。与传统的去垢剂环境相比，纳米盘中的脂质双分子层为膜蛋白提供了结构支撑，有助于稳定其天然构象——这一特性对于易于失活的蛋白质（如G蛋白偶联受体和离子通道）尤为关键。¹¹此外，纳米盘颗粒在组装后具有高度均一的特性，这为获得高质量的冷冻电镜数据以及可靠的表面等离子共振/生物膜干涉动力学数据提供了有力支持¹².

在过去十年中，纳米盘技术已成为在天然脂质环境中研究膜蛋白的有力工具。例如，Vilela 及其同事¹³通过优化重组条件并验证最终组分的质量，建立了纳米盘组装的系统性框架。具体而言，他们将尺寸排阻色谱法（SEC）与定量指标（包括组装效率和峰对称性）相结合，以客观评估样品的均一性¹³。目前，纳米盘已成为一种多功能平台。通过使用单颗粒冷冻电镜检测组装后的纳米盘重组蛋白，可以获得膜蛋白的高分辨率结构，其适用性已得到充分证实。MSP 条带的双环密度特征是成功结合的关键结构证据^10,14,15。此外，纳米盘在脂双层环境中进行膜蛋白功能分析以及在溶液核磁共振研究中的应用均具有重要价值^16,17。

本方案描述了一种将人源Task2膜蛋白组装入纳米盘（nanodisc）的方法。人源Task2属于双孔结构域K⁺（K₂P）通道家族中的一种pH门控成员^18,19。与其他K₂P通道类似，Task2是一种结构域交换型同源二聚体，每个原体链包含四段跨膜α螺旋（TM1–TM4）、两段回环式孔道螺旋（PH1和PH2）、两个选择性滤过器（SF1和SF2），以及两段形成细胞外帽状结构的螺旋（CH1和CH2）。本研究中所用的目标蛋白为截短形式的Task2，缺失了C端166个氨基酸残基——该区域被预测为高度无序结构，而截短可提高蛋白表达量及生化稳定性。重组Task2蛋白的分子量约为72 kDa，并带有GFP标签。该蛋白此前已使用去垢剂进行溶解和纯化。随后，将其与脂质及膜支架蛋白（MSP）按精确计算的化学计量比混合。通过Bio-Beads去除去垢剂后，样品进一步经尺寸排阻色谱法（SEC）纯化，以获得适用于冷冻电镜（cryo-EM）分析的样品。最后，由单颗粒冷冻电镜数据生成二维（2D）分类平均图像，以验证样品的结构完整性。

方案

1. 脂质储备液的制备

1. 脂质制备
   1. 使用三种磷脂制备脂质混合物：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）、2-油酰基-1-棕榈酰基甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）和1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸（POPS）。
   2. 使用上述脂质在氯仿中的预配储存液，每种浓度均为25 mg/mL。
      注意：操作氯仿时必须佩戴个人防护装备，所有操作均需在通风橱中进行。氯仿应储存在专用的化学品柜中。
   3. 由于氯仿具有挥发性，使用微量注射器量取前应检查脂质储存液体积是否与初始记录一致。若发生蒸发，需用纯氯仿补足至原体积，并充分混匀。
      注意：每次测量前，应用氯仿冲洗微量注射器两次。
   4. 按质量比DOPE:POPC:POPS = 2:1:1配制100 µL脂质混合物。根据该比例，取V_DOPE 50 µL、V_POPC 25 µL和V_POPS 25 µL。按照计算所得体积量取相应溶液，加入玻璃试管中并充分混匀。
   5. 将玻璃试管置于水浴中，以减少氯仿的挥发，并保持环境温度稳定。
2. 脂质膜制备
   1. 在温和的氮气流下蒸发氯仿，直至液体完全去除，在试管底部形成透明、均一的凝胶状薄膜。
      注意：确保玻璃试管底部可见均匀干燥的脂质膜，无残留液滴。避免氮气流过大，以免引起起泡并阻碍氯仿完全干燥。
   2. 向玻璃试管中逐滴加入约2 mL正戊烷，然后采用步骤1.2.1所述的氮气干燥法蒸发溶剂，获得干燥透明的脂质膜。正戊烷在玻璃试管中蒸发，因其化学惰性且与有机溶剂相容。玻璃可避免许多塑料实验器材可能带来的浸出或降解风险，从而在成膜过程中保持脂质纯度。
      注意：正戊烷必须储存在专用试剂柜中，使用时应在通风橱内小心操作，并佩戴适当的个人防护装备。
   3. 松开试管盖，将试管放入真空干燥器中。抽真空并维持真空状态以去除任何残留溶剂。在干燥器底部放置自指示型硅胶以吸收水分。
      注意：应在通风橱中将残留的氯仿和正戊烷彻底蒸发至干燥。
3. 脂质水化及储存液制备
   1. 从真空 干燥器中取出脂质膜，加入250 µL无去垢剂的低盐缓冲液（LSB）（补充表1）进行水化，得到终浓度为10 mg/mL的脂质溶液。
      注意：选择基于钾离子的缓冲液是因为Task2是一种钾离子通道。
   2. 脂质重悬后，将悬浮液均分为四份，分别置于玻璃试管中，超声处理至溶液澄清透明，表明脂质体成功形成（约1.5小时）。超声条件为60%振幅，工作4秒、间歇6秒循环进行。
   3. 合并澄清的脂质溶液，并分装至各微量离心管中，每管1.5 mL。立即用氮气吹扫每管顶部空间，随后于-80 °C保存备用。

2. MSP的过表达与纯化

1. 膜支架蛋白（MSP）的原核表达
   1. 质粒转化：将携带7×His标签的MSP1D1质粒转化至大肠杆菌（E. coli）BL21 (DE3) 感受态细胞中。将转化混合物涂布于含卡那霉素（50 µg/mL）的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，37 °C过夜培养，以获得单菌落。
   2. 菌种扩增：挑取单克隆菌落接种于5 mL含卡那霉素的LB培养基中，37 °C振荡培养过夜。将过夜培养物按1:100比例接种至液体LB培养基中，37 °C振荡培养至600 nm处光密度（OD₆₀₀）达到2.0–3.0。
   3. 蛋白表达诱导：加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5–1 mM，诱导MSP表达。继续在16 °C振荡培养16–20小时。
2. 细胞裂解
   1. 菌体收集：将细菌培养物在4 °C下离心10分钟。弃去上清液，保留菌体沉淀。
   2. 细菌裂解：将1 L培养物所得沉淀重悬于100–150 mL裂解缓冲液中（补充表1），充分匀浆至形成均匀悬液且无可见团块。向悬液中加入PMSF以抑制蛋白酶活性并减少泡沫产生。
   3. 超声破碎：使用冷藏型超声波细胞破碎仪裂解细菌。设定功率为35%，采用3秒脉冲、6秒间歇的循环模式。为防止过热，每累计超声15分钟后暂停2分钟。持续处理直至裂解液变为澄清浅棕色。
   4. 澄清处理：将裂解液在4 °C下以30,000 g离心45分钟，收集上清液用于后续步骤。
3. MSP纯化
   1. Ni-NTA树脂准备：取3–5 mL Ni-NTA树脂装入重力柱（规格：26.4×134.8 mm）。先用3柱体积（CV）蒸馏水洗涤，再用3 CV洗涤缓冲液1（补充表1）进行平衡。
   2. MSP与树脂结合：将细胞裂解液离心后，将上清液与已平衡的Ni-NTA树脂混合。加入咪唑至终浓度5 mM，在4 °C避光条件下轻柔旋转孵育2小时。
   3. 洗涤去除杂质：依次使用洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2（补充表1）和洗涤缓冲液3（补充表1）进行梯度洗涤，每种缓冲液至少使用50 mL。监测流出液在280 nm处的紫外吸光度（A₂₈₀），持续洗涤至A₂₈₀值低于0.01。
   4. 洗脱：用洗脱缓冲液（补充表1）洗脱目标蛋白，收集洗脱组分。继续洗脱并分段收集，直至洗脱液A₂₈₀低于0.01。
   5. 过程监控与分析：从关键纯化阶段（包括上清液、沉淀、流出液、洗涤组分和洗脱组分）取样，通过SDS-PAGE分析纯化效率（补充图1）。
   6. 透析换液：将合并的洗脱液装入透析袋，在4 °C条件下用透析缓冲液（补充表1）轻柔搅拌透析过夜。
   7. 超滤浓缩：使用超滤装置将透析后的溶液浓缩至MSP终浓度为2–5 mg/mL。所得纯化且浓缩的MSP可用于膜蛋白纳米盘组装。

3. 生物珠的活化

1. 称量
   1. 使用分析天平将约 250 mg 的 Bio-Beads 称取至一个 50 mL 离心管中。
2. 甲醇洗涤
   1. 向离心管中加入 25–30 mL 甲醇，在避光条件下充分旋转或涡旋混合，然后孵育 20 分钟。孵育结束后小心弃去上清液。
   2. 总共重复此甲醇洗涤步骤三次。
      注意：由于甲醇具有挥发性，该操作必须在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。使用过的甲醇应收集起来，并作为生物废液处理。
3. 水相洗涤
   1. 向珠粒中加入 25–30 mL ddH₂O，振荡或旋转离心管以混匀，并孵育 20 分钟。
   2. 弃去上清液，重复此水相洗涤步骤三次。
4. 用不含去垢剂的 LSB 平衡
   1. 向珠粒中加入 25–30 mL 不含去垢剂的 LSB，将离心管置于旋转仪上振荡或旋转以混匀，并孵育 20 分钟。
   2. 弃去上清液，重复此 LSB 平衡步骤三次，以充分预处理珠粒。
5. 分装与保存
   1. 将活化后的 Bio-Beads 均匀分装至三个 1.5 mL 微量离心管中。确保珠粒保持湿润，留有少量 LSB。
   2. 用铝箔纸包裹离心管以避光，并置于冰上保存，用于后续实验。

4. 组装纳米盘

1. 脂质和MSP的制备
   1. 脂质储备液澄清：取一份预先配制的脂质储备液，解冻后立即在离心机中离心 7,000 × g 在 4 °C 下短暂离心 5 秒，使管内液体沉降至管底。
   2. 在水浴中进行超声处理，每5–10分钟监测一次溶液澄清度和温度，以防止过热。超声处理时设置振幅为60%。持续超声处理脂质储备液，直至其变为澄清透明。
   3. MSP 解冻：将一份制备好的 MSP 溶液在冰水浴中解冻。
2. 根据化学计量比配制缓冲液。
   1. 定量膜蛋白 使用尺寸排阻色谱法（SEC）分离纯化的膜蛋白（Task2），该蛋白溶于含0.025% DDM和0.005% CHS的缓冲液中。将500 µL样品以0.5 mL/min的流速上样至Superose 6 Increase柱（Cytiva）。收集在14.8 mL处洗脱的主峰组分并进行浓缩（图1). 使用 NanoDrop 测定蛋白浓度。
   2. 计算蛋白质摩尔量： 使用公式 n = C × V 计算目标膜蛋白的摩尔量（n），其中 C 是摩尔浓度，而 V 是体积。
   3. 确定MSP和脂质的体积： 根据目标蛋白 : MSP : 脂质 = 1 : 5 : 250 的摩尔化学计量比，计算所需 MSP 和脂质储备液的体积。
   4. 配制主混合液： 根据计算结果，混合相应体积的脂质和MSP，制备300 µL的主混合液。
      注意：确保在此混合液中加入去垢剂，以维持与蛋白溶液中一致的浓度，从而防止蛋白过早聚集。
3. 去垢剂去除与纳米盘组装
   1. 初始孵育与重悬混合液：将制备好的混合缓冲液（补充表1) 冰上孵育 10 分钟。然后，将 50 µL 该混合液缓慢加入浓缩的蛋白质溶液中，用移液器轻轻吹打混匀，以确保溶液均一。
   2. 蛋白质-脂质混合物的平衡：将混合液置于冰上 1 小时，每 15 分钟轻轻颠倒试管一次，以充分混匀。
   3. 第一次与Bio-Beads孵育：将混合物短暂离心 7,000 × g 在4 °C下离心5 s，使蛋白质溶液聚集于管底。取一份预活化的Bio-Beads，吸除残留的LSB，将蛋白质溶液加入珠粒中，避光旋转孵育1 h，以防止目标蛋白发生光诱导降解。
   4. 第二次与Bio-Beads孵育：将混合物离心 7,000 × g 在4 °C下离心5秒，小心将上清液转移至另一份已去除LSB的Bio-Beads中，并在避光条件下轻轻颠倒混匀，4–8小时或过夜。
   5. 生物珠最终孵育：将蛋白溶液经4℃避光过夜孵育后取出，短暂离心，将上清转移至第三份即最后一份预活化的Bio-Beads中。4℃避光条件下旋转孵育1小时。
   6. 短暂离心后，将上清液转移至一支干净的微量离心管中，并在17,000 x g 在 4 °C 下离心 10 分钟以去除任何聚集体。
      注意：使用过的 Bio-Beads 应作为生物废弃物处理。
   7. 纳米盘纯化：通过尺寸排阻色谱法（SEC）纯化纳米盘-Task2复合物：将500 µL样品以0.5 mL/min的流速上样至Superose 6 Increase柱，收集在15 mL处洗脱的峰图2).
   8. 最终产物浓度：合并SEC洗脱的峰组分，并将其浓缩至纳米盘-Task2的终浓度为1.2–1.5 mg/mL，适用于冷冻电镜样品制备。

5. 验证纳米盘组装是否成功

1. SDS-PAGE 分析：从 SEC 纯化的组分中取样。
   1. 使用 12% SDS-PAGE 分析样品，以确认关键组分（如 MSP 和目标膜蛋白）的存在，这表明纳米盘组装成功（图 3）。
2. 冷冻电镜样品制备与分析。
   1. 将成功组装的样品浓缩至 终浓度为 1.2–1.5 mg/mL，用于冷冻电镜样品制备。
   2. 首先在 4 °C 条件下以 17,000 x g 离心 10 分钟。取 3 µL 液滴加到新近辉光放电处理的 Quantifoil R1.2/1.3 金网格（300 目，带孔碳膜）上。
   3. 在 4 °C、100% 湿度条件下孵育 5 秒。使用 Vitrobot Mark IV 沥滤 4 秒，并在液氮温度维持的液态乙烷中快速冷冻。
   4. 在 Titan Krios G4 冷冻电镜（工作电压 300 kV）上配备 Falcon G4i 直接电子探测器，使用 EPU 软件采集超分辨率电影堆栈数据。
   5. 设定曝光时间为 2.78 秒，对应像素尺寸为 0.73 Å（165k ×），每帧 EER 电影堆栈的总累积剂量约为 50 e⁻/Ų。

结果

脂质储备液成功制备的标志是超声处理后形成澄清透明的溶液。对于MSP蛋白，镍亲和层析获得了纯度较高的产物，浓度约为3 mg/mL。纳米盘的组装通过尺寸排阻色谱（SEC）得以确认，其洗脱曲线呈现特征性图谱（图2）。与纳米盘组装前的Task2蛋白SEC图谱（图1）相比，组装后的蛋白峰向更高的洗脱体积（即更晚洗脱）方向偏移。如图2所示，SEC图谱显示两个主要峰：组装完成的纳米盘复合物在15.1 mL处洗脱，游离MSP在18.0 mL处洗脱。我们通过积分峰面积来量化组装效率。组装纳米盘峰的面积为147.2，游离MSP峰面积为31.5，计算得组装效率为82.4%（计算公式：组装纳米盘峰面积 / 总蛋白峰面积）。该定量结果表明，绝大多数MSP已成功与Task2蛋白共同组装进入纳米盘中。目标蛋白与MSP在SDS-PAGE中的共迁移进一步验证了二者共同存在于单一纳米盘复合物中（图3）。最后，经SEC纯化的纳米盘样品被浓缩后进行冷冻电镜（cryo-EM）分析。所得二维分类平均图像...

讨论

本文介绍了一种通过去除去垢剂将去垢剂溶解的膜蛋白重组到纳米盘中的方法，从而为膜蛋白提供更接近天然状态的脂双层环境。该组装过程的成功取决于多个关键因素。其中最重要的是膜蛋白、膜支架蛋白（MSP）与脂质之间精确的化学计量比。不恰当的化学计量比可能导致蛋白聚集或组装失败。例如，首次尝试使用1:2:50的比例组装纳米盘时，导致Task2蛋白完全聚集。因此，优化化学计量比对于实现成功组装至关重要。脂质储备液的制备以及合适MSP的选择同样关键。脂质组成必须经过优化，以形成均一且透明的溶液，模拟天然膜环境。此外，MSP亚型的选择决定了纳米盘的直径，必须根据目标膜蛋白的大小进行匹配¹⁷。选择能够形成直径大于目标蛋白的纳米盘的MSP，对于容纳并稳定蛋白可能发生的构象动态变化至关重要。

膜蛋白在纳米盘中的成功重建依赖于通过多种正交标准进行的严格验证²⁰。在本研究中，我们遵循了这些既定标准，以证明Task2-纳米盘样品的完整性。我们的生化验证依据Vilela等人¹³

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物珠	Bio-rad	1523920
胆固醇半琥珀酸酯	Anatrace	CH210
氯仿	Sinoreagent		在通风橱中使用
DOPE	Avanti	850725P
甲醇	Sinoreagent
n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷	Anatrace	D310
正戊烷	Adamas		在通风橱中使用
POPC	Avanti	850457P
POPS	Avanti	840034P
SEC	Bio-rad		遵循制造商提供的操作规程正确使用
SnakeSkin 透析管	Thermo	68011
Superose 6 Increase10/300 GL	Cytiva	29091596
超滤离心柱 Amicon Ultra-15	Millipore	UFC905008