Fructus xanthii 提取物通过维持软骨完整性缓解骨关节炎

摘要

本研究方案旨在系统地探究潜在的软骨保护作用 苍耳子 通过整合多组学分析提取骨关节炎相关因子 体内 实验。

摘要

骨关节炎（OA）是一种进行性退行性关节疾病，目前的药物和手术治疗主要缓解症状，而无法逆转其潜在的病理改变，凸显了开发新型治疗药物的迫切需求。本方案旨在研究潜在的软骨保护作用 苍耳子 采用非靶向代谢组学方法，结合超高效液相色谱-高分辨串联质谱（UHPLC-HRMS/MS）对提取物的化学成分进行表征，以研究其抗骨关节炎（OA）作用。随后应用网络药理学与转录组数据挖掘相结合的整合策略，鉴定提取物中的生物活性成分及其潜在作用靶点，并与OA相关差异表达基因进行交叉分析，筛选出核心靶基因。通过基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析，注释提取物调控的主要生物学过程及信号通路。对于 体内 验证过程中，采用斑马鱼软骨损伤模型和小鼠骨关节炎（OA）模型评估提取物的软骨保护作用。进一步通过RNA测序（RNA-seq）分析软骨细胞在给药后的转录组变化，重点关注与OA相关的信号通路及基因表达谱；随后进行酶联免疫吸附测定（ELISA），以验证RNA-seq筛选出的关键蛋白/受体的表达水平，从而进一步确认其调控作用 苍耳子 提取核心OA靶点。该整合的多组学与实验方案为探索其潜力提供了系统性方法 苍耳子 作为干预骨关节炎的一种有前景的植物来源候选物。

引言

骨关节炎（OA）是一种退行性关节疾病，其特征是关节软骨进行性降解、软骨下骨硬化、滑膜炎症以及骨赘形成¹。根据全球疾病负担（GBD）研究，从1990年至2020年，骨关节炎的患病率在204个国家和地区持续上升²，且随着全球人口老龄化加剧，这一趋势预计将进一步加快³。目前估计全球有超过2.5亿人受此影响，对个人健康、医疗系统及社会经济结构造成重大负担⁴。现有的治疗方法主要以缓解症状为目标，最常用的干预手段包括非甾体抗炎药（NSAIDs）和关节腔内注射透明质酸（HA）进行黏弹性补充治疗。然而，这些方法的临床获益有限，并伴随显著的不良反应^5,6。这凸显了开发有效的骨关节炎疾病修饰药物（DMOADs）的迫切需求。

中医（Traditional Chinese Medicine, TCM）长期以来被用于骨关节炎（OA）的治疗，其理论基础源于“"骨痹"这一“"痹证"的亚型⁷。在此理论框架下，OA 的发病机制主要归因于肝肾精气亏虚、气血不足，进而导致风、寒、湿邪侵袭⁸

方案

所有涉及临床样本和小鼠的实验均按照山东省医学生物技术研究中心伦理审查委员会批准的方案进行。材料表中列出了所使用的试剂和设备。

1. 人关节软骨细胞的分离与培养

人关节软骨样本取自山东第一医科大学附属第一医院接受关节镜手术或全关节置换术的患者。软骨切片在手术切除后30分钟内冰上运输至实验室。组织用冰冻的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS；洗涤3–5次）充分清洗，然后用无菌手术剪将软骨精细剪切成约1 mm³大小的碎片。进行连续的酶消化处理，首先用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C下预消化30分钟。持续监测消化过程，直至软骨碎片变薄、体积缩小并呈半透明状，随后在室温下离心收集软骨碎片（200 × g，5分钟）。接着在37 °C下用0.2% II型胶原酶持续轻柔振荡消化过夜（8小时）。持续监测消化过程，直至所有肉眼可见的软骨碎片完全溶解。将释放的细胞在室温下离心收集（200 × g，5分钟），重悬于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的完全DMEM培养基中，并接种至75 cm²培养瓶中。细胞在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中培养。当贴壁软骨细胞达到培养瓶表面积80%融合时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化解离细胞，并按1:3....

结果

非靶向液相色谱-串联质谱数据的质量评估与代谢图谱分析

质控样品表现出优异的重现性，在正离子和负离子模式下总离子流色谱图高度重叠，整个分析批次中的保留时间漂移均低于0.05分钟。原始数据采用基于XCMS的方法进行预处理，包括峰检测、积分及保留时间对齐。通过将精确质量数（≤5 ppm）、同位素分布模式以及高质量的二级质谱（MS/MS）谱图与内部自建谱图数据库进行比对，对潜在代谢物进行注释。经过严格筛选和总离子流归一化后，分别保留了正离子模式下的2,179个和负离子模式下的1,291个可靠特征，构成后续化学计量分析的定量矩阵。

化学成分 苍耳子 提取

植物化学谱型分析揭示了一个结构多样的代谢组，包含酚酸、木脂素、倍半萜类、黄酮类以及羟基肉桂酸衍生物。这些化合物通过多组分、多靶点和多通路的协同机制，发挥抗炎、镇痛、抗过敏、抗菌、免疫调节及抗肿瘤作用。主要鉴定出的生物活性化合物汇总见

讨论

骨关节炎是一种常见的退行性关节疾病，也是全球范围内导致残疾的主要原因之一³⁶其发病机制复杂且为多因素所致，涉及关节组织中生化、细胞和分子水平的多重改变。过去曾被认为是一种简单的 "磨损" 关节软骨现象，OA 现已被广泛认为是一种慢性、累及全关节的疾病，其特征包括软骨降解、滑膜炎症、骨赘形成以及软骨下骨重塑^37,38,39越来越多的证据强调了炎症在骨关节炎病理生理过程中的核心作用，滑膜、软骨和软骨下骨产生的炎症介质与软骨降解密切相关^40,41全球流行病学数据显示，2020年约有5.95亿人受骨关节炎影响，凸显其巨大的社会负担。尽管药物和手术干预在一定程度上可缓解疼痛和功能障碍，但无法阻止或逆转疾病进展^42,.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% PFA	中国碧硕	BL539A	pH 7.4，无菌
C57BL/6 小鼠	中国维通利华实验动物技术有限公司	N/A	雄性，8-10周龄，20-25克
硫酸软骨素	MCE，美国	HY-B2162	纯度 ≥98%
ClusterProfiler（R 软件包）	Bioconductor	免费访问	集成于 R v4.2.2
胶原酶II型，粉末状	Gibco，美国	17101015	≥125 U/mg
Cytoscape	Cytoscape 联盟	免费访问 (https://cytoscape.org/)	v3.9.1（含 CytoHubba）
Cytoscape	Cytoscape 联盟	免费访问	版本 3.9.1
DESeq2（R 软件包）	Bioconductor	免费访问	集成于 R v4.2.2
DMEM，高糖	Gibco，美国	11965092	无菌培养基
乙醇	国药集团化学试剂有限公司，中国	10009218	分析纯，95%
乙酸乙酯	国药集团化学试剂有限公司，中国	10009418	分析纯
胎牛血清（FBS）	中国Cellmax	SA102.02	热灭活
荧光显微镜	日本尼康公司	Eclipse Ti2-U	配备GFP滤光片（488 nm激发） &和数码相机
GEO 数据库	NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r	GEO2R 分析工具
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC，美国	商业的	版本 9.5.1
苏木精-伊红（HE）染色试剂盒	Solarbio，中国	G1120	即用型试剂盒
HERB数据库	中国科学院	http://herb.ac.cn/	V2.0
人MMP-1 ELISA试剂盒	中国雅美生物技术公司	HJ088	对于人类，96孔板
人孕酮受体（PR）ELISA试剂盒	中国上海酶联生物技术有限公司	ml05997	对于人类，96孔板
ImageJ	美国国立卫生研究院（NIH）	免费访问	版本 1.53t
光学显微镜	日本 Olympus	BX53	10×/20× 目标 &和数码相机
冻干机	克里斯特，德国	Alpha 1-4 LDplus	冷冻干燥系统
改良的藏红O-快绿染色试剂盒	Solarbio，中国	G1371	用于骨/软骨染色
中性树胶	Solarbio，中国	G8590	封片剂
青霉素-链霉素	Gibco，美国	15070063	100×，无菌
磷酸盐缓冲液（PBS）	中国Sparkjade公司	CR0013-500ML	pH 7.2–7.4，无菌
R 软件	R 统计计算基金会	免费访问（https://www.r-project.org/）	v4.4.1（含 ggvenn）
无血清细胞冻存液	Biosharp，中国	BL203B	无菌的
金黄色葡萄球菌	美国典型培养物保藏中心（ATCC）	ATCC 25923	标准菌株
STRING 数据库	STRING 联盟	https://string-db.org/	蛋白质相互作用分析
TCMID 数据库	陕西秦岭奇药协同创新中心	https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php	V3.0
Tg(col2a1a:EGFP) 斑马鱼	斑马鱼国际资源中心（ZIRC）	N/A	幼鱼（2 dpf），AB品系
TRIzol试剂	赛默飞世尔科技，美国	15596018CN	用于总RNA提取
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红	Gibco，美国	25200056	无菌溶液
超高效液相色谱（UHPLC）	赛默飞世尔科技，美国	Q Exactive Focus	结合 HRMS/MS
XCMS-online	斯克里普斯研究所	免费访问	基于网络的平台