Fructus xanthii 提取物通过维持软骨完整性缓解骨关节炎

摘要

本研究方案旨在系统地探究潜在的软骨保护作用 苍耳子 通过整合多组学分析提取骨关节炎相关因子 体内 实验。

摘要

骨关节炎（OA）是一种进行性退行性关节疾病，目前的药物和手术治疗主要缓解症状，而无法逆转其潜在的病理改变，凸显了开发新型治疗药物的迫切需求。本方案旨在研究潜在的软骨保护作用 苍耳子 采用非靶向代谢组学方法，结合超高效液相色谱-高分辨串联质谱（UHPLC-HRMS/MS）对提取物的化学成分进行表征，以研究其抗骨关节炎（OA）作用。随后应用网络药理学与转录组数据挖掘相结合的整合策略，鉴定提取物中的生物活性成分及其潜在作用靶点，并与OA相关差异表达基因进行交叉分析，筛选出核心靶基因。通过基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析，注释提取物调控的主要生物学过程及信号通路。对于 体内 验证过程中，采用斑马鱼软骨损伤模型和小鼠骨关节炎（OA）模型评估提取物的软骨保护作用。进一步通过RNA测序（RNA-seq）分析软骨细胞在给药后的转录组变化，重点关注与OA相关的信号通路及基因表达谱；随后进行酶联免疫吸附测定（ELISA），以验证RNA-seq筛选出的关键蛋白/受体的表达水平，从而进一步确认其调控作用 苍耳子 提取核心OA靶点。该整合的多组学与实验方案为探索其潜力提供了系统性方法 苍耳子 作为干预骨关节炎的一种有前景的植物来源候选物。

引言

骨关节炎（OA）是一种退行性关节疾病，其特征是关节软骨进行性降解、软骨下骨硬化、滑膜炎症以及骨赘形成¹。根据全球疾病负担（GBD）研究，从1990年至2020年，骨关节炎的患病率在204个国家和地区持续上升²，且随着全球人口老龄化加剧，这一趋势预计将进一步加快³。目前估计全球有超过2.5亿人受此影响，对个人健康、医疗系统及社会经济结构造成重大负担⁴。现有的治疗方法主要以缓解症状为目标，最常用的干预手段包括非甾体抗炎药（NSAIDs）和关节腔内注射透明质酸（HA）进行黏弹性补充治疗。然而，这些方法的临床获益有限，并伴随显著的不良反应^5,6。这凸显了开发有效的骨关节炎疾病修饰药物（DMOADs）的迫切需求。

中医（Traditional Chinese Medicine, TCM）长期以来被用于骨关节炎（OA）的治疗，其理论基础源于“"骨痹"这一“"痹证"的亚型⁷。在此理论框架下，OA 的发病机制主要归因于肝肾精气亏虚、气血不足，进而导致风、寒、湿邪侵袭⁸。因此，治疗策略着重于祛风除湿、散寒通络⁹。中医治疗以其多靶点作用、良好的安全性及临床显著疗效而著称¹⁰。一些重要方剂如补气通络胶囊（Buqi Tongluo Capsule, BQTL）和附子汤（Fuzi Decoction, FZD）在临床实践中已显示出明确的抗 OA 效应；独活寄生汤（Du Huo Ji Sheng Tang, DHJST）则通过抑制 NLRP3 炎性小体通路缓解 OA 症状，并拥有数百年的临床应用经验支持。类似地，伸筋活血合剂（Shenjinhuoxue Mixture, SHM）可通过下调 IL-1β 和 TNF-α 等促炎介质，减轻疼痛和软骨退变^11,12,13。在单体成分层面，从药用植物中提取的化合物如淫羊藿苷（icariin，又称 Cyanoside A, CyA）和丹皮酚（erianin）已被报道可促进软骨细胞增殖、抑制炎症因子释放，并维持关节稳态^14,15。总体而言，中医提供了一种具有抗炎、软骨保护和缓解症状等多重作用的综合治疗策略。然而，其作用机制的复杂性以及标准化相关问题，仍需持续开展严谨的研究。

Fructus Xanthii（菊科）的干燥成熟果实，俗称“苍耳子”，已被证实具有广泛的药理活性，包括抗菌、抗炎、抗氧化、镇痛、抗肿瘤和免疫调节作用¹⁶。从Fructus Xanthii中分离出的酚酸类成分可有效减轻类风湿关节炎（RA）中的滑膜增生¹⁷。其中，绿原酸（CGA）作为咖啡酰奎宁酸类衍生物的代表性成分，已被发现能够促进成骨细胞的增殖与分化，同时抑制RANKL介导的破骨细胞生成，从而维持骨骼稳态¹⁸。在同一提取物中鉴定出的其他酚酸类化合物，如新绿原酸（5-CQA）、隐绿原酸（CCA）和原儿茶酸，也表现出抗菌、抗炎、抗肿瘤及抗氧化特性^19,20,21。除酚酸类外，苍耳子中还含有多种其他次生代谢产物，共同参与介导这些生物活性^{16,20,22,23,24,25}。然而，Fructus Xanthii提取物在骨关节炎（OA）中的确切作用及其潜在机制仍尚未被充分研究。

非靶向液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）代谢组学具有无需预先假设、高通量和全局覆盖的特点。该方法可同时检测数千个代谢物特征，全面呈现代谢网络，并能在无需预先设定目标的情况下系统性发现新的生物标志物及异常代谢通路^26，27。结合高分辨质谱技术，该方法适用于多种生物样本（如血清、滑膜液、尿液、软骨组织等）的全面分析，在骨关节炎（OA）研究中展现出显著优势。一方面，该方法可全面筛选与OA病理进展密切相关的差异代谢物（如在滑膜液和滑膜组织中鉴定出的多种代谢物类别），并将其映射至能量代谢、软骨修复、成骨作用和脂质代谢等关键通路，从而加深对OA发病机制的理解。另一方面，整合转录组学和蛋白质组学等多组学数据，有助于揭示代谢重编程在软骨退变、炎症反应和关节结构损伤中的作用，为发现早期诊断生物标志物、评估疾病进展以及开发靶向代谢干预策略（如调控胆汁酸、色氨酸或脂肪酸代谢）提供关键证据，凸显其在OA精准分型与个体化治疗研究中的转化潜力。

斑马鱼作为一种优秀的模式生物，具有多种优势：其基因组与人类高度保守，约70%的人类蛋白质编码基因与其具有同源性^28,29具有发育迅速等关键特征， 体外 受精，透明胚胎便于观察 体内 成像、高繁殖力和低维护成本^30,31,32,33在骨骼研究中，斑马鱼能够清晰地展示骨形成、矿化过程及再生能力，可用于模拟骨质疏松症和软骨损伤等病理状态。然而，在研究以关节软骨退变、滑膜炎症和软骨下骨改变为特征的复杂全关节疾病——骨关节炎（OA）时，斑马鱼模型的应用仍相对有限。

本文介绍了一种整合了基于超高效液相色谱-高分辨质谱/质谱的非靶向代谢组学、网络药理学、转录组挖掘和 体内 通过多组学整合与计算分析，旨在鉴定与骨关节炎（OA）相关的苍耳子提取物的生物活性成分、潜在作用靶点及核心调控通路，并进一步通过实验验证其对OA的软骨保护作用，以探索苍耳子提取物作为干预OA的潜在植物候选药物的应用前景。 体内 模型，并进一步阐明其对软骨细胞转录组的调控机制。

方案

所有涉及临床样本和小鼠的实验均按照山东省医学生物技术研究中心伦理审查委员会批准的方案进行。材料表中列出了所使用的试剂和设备。

1. 人关节软骨细胞的分离与培养

人关节软骨样本取自山东第一医科大学附属第一医院接受关节镜手术或全关节置换术的患者。软骨切片在手术切除后30分钟内冰上运输至实验室。组织用冰冻的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS；洗涤3–5次）充分清洗，然后用无菌手术剪将软骨精细剪切成约1 mm³大小的碎片。进行连续的酶消化处理，首先用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C下预消化30分钟。持续监测消化过程，直至软骨碎片变薄、体积缩小并呈半透明状，随后在室温下离心收集软骨碎片（200 × g，5分钟）。接着在37 °C下用0.2% II型胶原酶持续轻柔振荡消化过夜（8小时）。持续监测消化过程，直至所有肉眼可见的软骨碎片完全溶解。将释放的细胞在室温下离心收集（200 × g，5分钟），重悬于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的完全DMEM培养基中，并接种至75 cm²培养瓶中。细胞在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中培养。当贴壁软骨细胞达到培养瓶表面积80%融合时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化解离细胞，并按1:3比例传代培养。

2. 苍耳子提取物的制备

Xanthium strumarium L.（Fructus Xanthii）的干燥成熟果实采自中国北方的天然种群，并由资深生药学专家鉴定。标本保存于山东第一医科大学标本馆。取20 g精细粉碎的Fructus Xanthii置于提取套管中，使用95%乙醇（约250 mL）进行索氏连续提取，直至完成七至八个虹吸循环。乙醇提取液经滤纸过滤后，滤液于45 °C减压条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥。所得残渣溶于60 mL重蒸水，随后在分液漏斗中依次用60 mL乙酸乙酯进行萃取。混合液剧烈振荡后，于4 °C静置24 h以实现相分离。收集水相，冷冻干燥后于−80 °C保存，待后续使用。

3. 非靶向液相色谱-串联质谱代谢组学的标准化工作流程

1. 基于超高效液相色谱-高分辨串联质谱的非靶向代谢组学分析
   采用超高效液相色谱-高分辨串联质谱（UHPLC-HRMS/MS）平台进行非靶向代谢组学分析。使用预冷的甲醇-水体系快速淬灭并提取代谢物。色谱分离在配备C18/T3色谱柱（100 × 2.1 mm，1.8 µm）的UHPLC系统上完成，柱温维持在40 °C。采用流动相A（含0.1%甲酸的水溶液）和流动相B（含0.1%甲酸的乙腈溶液）进行二元梯度洗脱（0–28 min），流速为0.3 mL/min。质谱检测使用杂交四极杆-Orbitrap质谱仪，在极性切换的全扫描/数据依赖二级质谱（Full MS/dd-MS2）模式下运行，全扫描范围为m/z 70–1,050，分辨率设为120,000（FWHM，m/z 200处）。高能碰撞解离（HCD）碎裂能量设置为20、40和60 eV，动态排除时间为10 s。
2. 原始数据使用ProteoWizard转换为mzXML格式。在XCMS Online平台上使用针对高分辨质谱优化的参数（ppm = 5，bw = 5，snthresh = 6）进行峰提取、保留时间对齐和同位素峰去卷积。剔除在超过50%样本中缺失的特征峰，其余峰面积归一化至总离子流（TIC）。通过比对精确质量数、二级质谱图和保留时间，与内部标准品数据库进行匹配以注释代谢物，质量误差容限设为≤ 5 ppm，点积评分阈值≥80。
   注意：整个实验流程严格遵循标准操作程序。样本采集后立即在液氮中速冻（−80 °C），使用干冰冷链运输，并采用随机化的提取、进样和批次处理流程。每分析10个研究样本后插入一个混合质量控制（QC）样本，用于监测仪器信号漂移。

4. 网络药理学分析

1. 基于网络药理学的活性化合物筛选与靶点预测
   活性成分 苍耳子 从TCMID数据库（https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php）和HERB数据库（http://herb.ac.cn/）中获取化合物。根据推荐的ADME参数标准，即口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18，对获得的化合物进行筛选。通过这两个数据库获取符合条件的化合物的预测人类靶点。收集并整理筛选结果，最终确定15种活性化合物及与之相关的151个非重复蛋白靶点 苍耳子.
2. 转录组数据整合及骨关节炎相关核心靶点的鉴定
   正常样本与骨关节炎（OA）样本软骨组织中差异表达的基因（DEGs）通过GEO2R网络工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r）从GEO数据库数据集GSE51588（n = 5正常，6 OA）和GSE169077（n = 10正常，40 OA）中提取。OA上调基因的筛选标准为log2倍数变化大于1且调整后P值小于0.05。 >0.5 并调节 p值 <0.05。骨关节炎上调基因与151的交集 苍耳子相关蛋白靶标通过R软件包ggvenn进行可视化。利用STRING数据库（https://string-db.org/）构建交集靶标的蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络。将PPI网络数据导入Cytoscape，结合CytoHubba插件的MCC算法筛选出前10个枢纽基因，用于后续的功能富集分析。

5. 斑马鱼中最大耐受浓度（MTC）的测定

在受精后2天（2 dpf）的转基因斑马鱼幼鱼（Tg col2a1a:EGFP）被随机分配至6孔板中，每孔30条幼鱼。每孔加入3 mL含有系列稀释浓度Fructus Xanthii提取物的暴露培养基。每日移除濒死或死亡的幼鱼。幼鱼在28 °C条件下持续暴露72小时，之后确定最大耐受浓度（MTC），即幼鱼死亡率不超过10%的最高浓度。

6. 斑马鱼骨损伤模型的建立

在受精后2天（2 dpf）的Tg col2a1a:EGFP转基因斑马鱼幼鱼被分为四组：对照组、模型组、硫酸软骨素（CS）阳性对照组以及Fructus Xanthii提取物处理组。除对照组外，其余各组均暴露于金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，OD600 = 0.8，1 × 10⁸ CFU/mL）中24小时，以诱导骨骼损伤。通过在落射荧光显微镜下确认颅面区域软骨特异性绿色荧光强度较对照组降低至少50%，来验证造模成功。

7. 斑马鱼幼虫中软骨特异性荧光的定量评估

幼虫持续暴露于不同浓度梯度的 苍耳子 在28 °C下用提取物或1,000 µg/mL硫酸软骨素A（阳性对照）处理72 h。随后，从每个6孔重复孔中随机选取10条幼鱼（每组n = 30）。选取的幼鱼用0.016%三卡因麻醉，并侧向置于1%低熔点琼脂糖垫上。使用配备荧光相机的体视显微镜，在2×放大倍数下（激发波长488 nm，发射波长525/50 nm）采集荧光图像。利用图像分析软件，定量分析颅面区域（包括角舌软骨和Meckel’s软骨）中软骨特异性EGFP荧光强度。对积分密度值进行背景校正后，将校正值归一化至对照组，用于软骨保护功效的统计分析。

8. 在 C57BL/6J 小鼠中诱导骨关节炎（OA）

雄性C57BL/6J小鼠（6–8周龄，20–22 g）在22 °C ± 2 °C、12小时光照/黑暗循环的无特定病原体（SPF）条件下饲养。小鼠适应环境一周后，采用随机数字表法随机分为三组（每组n = 8）：（1）假手术对照组，（2）ACLT诱导的骨关节炎组（ACLT），以及（3）ACLT联合苍耳子提取物干预组（ACLT + Fructus Xanthii提取物）。所有手术操作均按照已验证的实验方案在无菌条件下进行。

小鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）进行麻醉（遵循机构批准的实验方案），并做正中髌旁切口以暴露右膝关节囊。在手术显微镜下切断前交叉韧带以诱导关节不稳定，随后使用6-0可吸收缝线逐层缝合关节囊和皮肤。假手术组小鼠接受相同的关节切开术操作，但不切断韧带。通过进行抽屉试验或评估模型组小鼠组织学切片中关节损伤程度，来评价关节稳定性，并确认造模成功。

术后连续三天给予丁丙诺啡（0.1 mg/kg，皮下注射）进行镇痛。治疗药物通过灌胃法每日给药一次。ACLT + Fructus Xanthii 提取物组给予100 µL浓度为1,000 µg/mL的Fructus Xanthii提取物生理盐水溶液，其余两组则给予100 µL生理盐水作为溶剂对照。术后8周，小鼠通过CO₂窒息法处死，随后行颈椎脱位确认死亡，取膝关节组织用于组织学分析。

9. 组织病理学染色

1. 膝关节组织的组织学制备与染色
   切除手术后的膝关节 整块 术后第8周取材，置于4 °C的4%多聚甲醛（PFA）中固定48 h。固定后的关节组织在10%乙二胺四乙酸（EDTA；pH 7.4）中脱钙14天，经梯度乙醇脱水后，包埋于石蜡中。从包埋组织中制备连续矢状面切片（5 µm），并进行以下组织学染色操作。
   1. 苏木精和伊红（H&E) 染色
      苏木精和伊红（H&E 染色用于评估总体组织结构、软骨完整性及滑膜增生。
   2. 番红O/快绿染色
      使用番红O/快绿染色法检测软骨组织中的蛋白聚糖。采用配备数字相机的光学显微镜观察染色切片，并在10×和20×放大倍数下采集图像。
2. 基于OARSI的软骨退变半定量评分
   为半定量评估软骨退变，对染色切片进行回顾性重新评估，并依据国际骨关节炎研究学会（Osteoarthritis Research Society International）骨关节炎软骨组织病理学评估系统进行评分。该系统根据关节软骨退变的等级（0–6级，反映软骨丢失程度）和分期（0–4期，反映损伤的空间分布）来评价软骨损伤的严重程度。
   采用事后设盲策略对所有评估进行分析。所有组织切片均通过移除原始分组标签，并以匿名序列号重新编码以消除身份信息。两名经验丰富的病理学家在不知晓分组信息的情况下，独立对切片进行评分。对两套评分结果进行交叉验证。当评分差异≥1分时，两名病理学家共同重新评估存在分歧的切片，以达成共识评分。最终的共识评分用于后续统计分析，以确保组织病理学结果的客观性、稳健性和可重复性。

10. RNA测序（RNA-seq）

将原代人关节软骨细胞（第2–3代）以每孔5 × 10⁵个细胞的密度接种于6孔板中。细胞经24小时无血清饥饿处理后，分为两组（每组n = 3）：（1）对照组：仅用溶剂处理（0.1% DMSO）；（2）Fructus Xanthii提取物组：用DMSO溶解的1,000 µg/mL Fructus Xanthii提取物处理细胞。
处理24小时后，按照制造商说明书使用TRIzol试剂提取总RNA。采用RNA分析仪检测RNA完整性（RIN ≥7.0）和浓度。使用RNA测序文库构建试剂盒制备链特异性cDNA文库，并在高通量下一代测序（NGS）平台上以双端150 bp（PE150）模式进行测序。使用FastQC对原始FASTQ文件进行质量控制，随后在进行下游分析前，利用Trimmomatic进行接头序列切除和质量修剪。

11. RNA-seq 数据处理

表达下调的差异表达基因 苍耳子 提取与对照组； p < 0.05 和 logFC < −0.5）从RNA-seq数据集中提取，并与前10个核心靶点取交集。所得与之相关的核心靶点 苍耳子 使用 ggvenn 软件包对提取物和骨关节炎进行了可视化分析。

12. 酶联免疫吸附测定（ELISA）

第2至3代人关节软骨细胞以5 × 10的密度接种于6孔板中⁵ 每孔细胞数。细胞在无血清培养基中孵育24小时以诱导静息状态。随后将细胞分为以下三组（每组n = 3）：
(1) 空白对照：仅用溶剂（0.1% DMSO）处理细胞；(2) 阳性对照：用IL-1β诱导细胞炎症，随后用溶剂（0.1% DMSO）处理；(3) 苍耳子 提取组：采用IL-1β诱导细胞炎症，随后用溶于0.1% DMSO的1000 µg/mL苍耳子提取物进行处理。细胞培养上清液在孵育24 h后收集，并于−80 °C保存备用。采用市售的特异性针对人MMP1和PGR的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒分别检测培养上清液中MMP1和PGR的水平。实验操作严格按照试剂盒生产商的说明书进行。

13. 统计分析

所有统计分析均使用统计分析和绘图软件进行，数据以均值 ± 标准差（SD）表示。采用Shapiro–Wilk检验评估数据正态性，采用Levene检验评估方差齐性。组间比较根据情况采用单因素或双因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey或Šidák事后检验。两两比较采用双尾Student t检验。非参数数据采用Mann–Whitney U检验进行分析。双侧P值< 0.05被认为具有统计学显著性。

结果

非靶向液相色谱-串联质谱数据的质量评估与代谢图谱分析

质控样品表现出优异的重现性，在正离子和负离子模式下总离子流色谱图高度重叠，整个分析批次中的保留时间漂移均低于0.05分钟。原始数据采用基于XCMS的方法进行预处理，包括峰检测、积分及保留时间对齐。通过将精确质量数（≤5 ppm）、同位素分布模式以及高质量的二级质谱（MS/MS）谱图与内部自建谱图数据库进行比对，对潜在代谢物进行注释。经过严格筛选和总离子流归一化后，分别保留了正离子模式下的2,179个和负离子模式下的1,291个可靠特征，构成后续化学计量分析的定量矩阵。

化学成分 苍耳子 提取

植物化学谱型分析揭示了一个结构多样的代谢组，包含酚酸、木脂素、倍半萜类、黄酮类以及羟基肉桂酸衍生物。这些化合物通过多组分、多靶点和多通路的协同机制，发挥抗炎、镇痛、抗过敏、抗菌、免疫调节及抗肿瘤作用。主要鉴定出的生物活性化合物汇总见

讨论

骨关节炎是一种常见的退行性关节疾病，也是全球范围内导致残疾的主要原因之一³⁶其发病机制复杂且为多因素所致，涉及关节组织中生化、细胞和分子水平的多重改变。过去曾被认为是一种简单的 "磨损" 关节软骨现象，OA 现已被广泛认为是一种慢性、累及全关节的疾病，其特征包括软骨降解、滑膜炎症、骨赘形成以及软骨下骨重塑^37,38,39越来越多的证据强调了炎症在骨关节炎病理生理过程中的核心作用，滑膜、软骨和软骨下骨产生的炎症介质与软骨降解密切相关^40,41全球流行病学数据显示，2020年约有5.95亿人受骨关节炎影响，凸显其巨大的社会负担。尽管药物和手术干预在一定程度上可缓解疼痛和功能障碍，但无法阻止或逆转疾病进展^42,...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% PFA	中国碧硕	BL539A	pH 7.4，无菌
C57BL/6 小鼠	中国维通利华实验动物技术有限公司	N/A	雄性，8-10周龄，20-25克
硫酸软骨素	MCE，美国	HY-B2162	纯度 ≥98%
ClusterProfiler（R 软件包）	Bioconductor	免费访问	集成于 R v4.2.2
胶原酶II型，粉末状	Gibco，美国	17101015	≥125 U/mg
Cytoscape	Cytoscape 联盟	免费访问 (https://cytoscape.org/)	v3.9.1（含 CytoHubba）
Cytoscape	Cytoscape 联盟	免费访问	版本 3.9.1
DESeq2（R 软件包）	Bioconductor	免费访问	集成于 R v4.2.2
DMEM，高糖	Gibco，美国	11965092	无菌培养基
乙醇	国药集团化学试剂有限公司，中国	10009218	分析纯，95%
乙酸乙酯	国药集团化学试剂有限公司，中国	10009418	分析纯
胎牛血清（FBS）	中国Cellmax	SA102.02	热灭活
荧光显微镜	日本尼康公司	Eclipse Ti2-U	配备GFP滤光片（488 nm激发） &和数码相机
GEO 数据库	NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r	GEO2R 分析工具
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC，美国	商业的	版本 9.5.1
苏木精-伊红（HE）染色试剂盒	Solarbio，中国	G1120	即用型试剂盒
HERB数据库	中国科学院	http://herb.ac.cn/	V2.0
人MMP-1 ELISA试剂盒	中国雅美生物技术公司	HJ088	对于人类，96孔板
人孕酮受体（PR）ELISA试剂盒	中国上海酶联生物技术有限公司	ml05997	对于人类，96孔板
ImageJ	美国国立卫生研究院（NIH）	免费访问	版本 1.53t
光学显微镜	日本 Olympus	BX53	10×/20× 目标 &和数码相机
冻干机	克里斯特，德国	Alpha 1-4 LDplus	冷冻干燥系统
改良的藏红O-快绿染色试剂盒	Solarbio，中国	G1371	用于骨/软骨染色
中性树胶	Solarbio，中国	G8590	封片剂
青霉素-链霉素	Gibco，美国	15070063	100×，无菌
磷酸盐缓冲液（PBS）	中国Sparkjade公司	CR0013-500ML	pH 7.2–7.4，无菌
R 软件	R 统计计算基金会	免费访问（https://www.r-project.org/）	v4.4.1（含 ggvenn）
无血清细胞冻存液	Biosharp，中国	BL203B	无菌的
金黄色葡萄球菌	美国典型培养物保藏中心（ATCC）	ATCC 25923	标准菌株
STRING 数据库	STRING 联盟	https://string-db.org/	蛋白质相互作用分析
TCMID 数据库	陕西秦岭奇药协同创新中心	https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php	V3.0
Tg(col2a1a:EGFP) 斑马鱼	斑马鱼国际资源中心（ZIRC）	N/A	幼鱼（2 dpf），AB品系
TRIzol试剂	赛默飞世尔科技，美国	15596018CN	用于总RNA提取
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红	Gibco，美国	25200056	无菌溶液
超高效液相色谱（UHPLC）	赛默飞世尔科技，美国	Q Exactive Focus	结合 HRMS/MS
XCMS-online	斯克里普斯研究所	免费访问	基于网络的平台