用于评估骶神经和周围神经刺激对膀胱功能影响的大鼠动物模型

摘要

本方案详细描述了刺激麻醉大鼠骶神经、胫骨神经和腓神经的详细手术技术。这些模型使得神经调节对膀胱功能的影响能够研究，有助于确定最佳刺激参数，并研究骶神经和周围神经刺激疗法的作用机制。

摘要

神经调节是一种治疗多种器官功能障碍的方法，已被证明在治疗下尿道功能障碍方面有效。尽管临床上取得了成功，神经调节背后的机制仍未完全明了，这凸显了标准化且可重复的动物模型的必要性。利用骶神经和周围神经刺激进行膀胱神经调节的临床前模型已有二十多年历史;然而，现有文献对手术方法学细节提供有限。本文详细描述并直观展示了已确立的骶神经刺激技术。它还描述了一种经过修正的胫神经刺激方法，并引入了一种利用腓神经刺激在大鼠模型中的新型膀胱神经调节方法。改良型胫神经刺激方法涉及从胫神经起点（坐骨神经的一个分支）暴露并刺激胫神经，而非以往研究中描述的内侧踝部。鉴于临床实践中腓神经刺激用于膀胱神经调节的引入，本文提出了一种独特的大鼠模型，以探讨其在控制下尿道功能中的机制。针对三种神经调节方法的逐步指导，包括神经暴露、电极放置及基于典型运动反应的电极成功植入验证。举例说明了腓神经刺激对膀胱功能影响的代表性案例，以展示醋酸诱导膀胱过度活动大鼠模型中的适用性。本文提出了一套标准化且技术上易于理解的神经调节机制研究方案，包括膀胱感觉信号的改变、脊柱和脊柱上方调节通路的变化、刺激参数的优化，以及不同刺激靶的效能比较。

引言

神经调节利用低振幅电刺激来改变末端器官¹的功能。在下尿路功能障碍的背景下，如膀胱过度活跃综合征（OAB）、非阻塞性尿潴留、神经源性膀胱和膀胱疼痛综合征，神经调节被用作行为疗法和药物治疗失败患者的三线治疗方法^。对于过动膀胱膀胱（OAB）患者的神经调节，后胫神经刺激和骶神经刺激（SNS）在临床实践中被广泛应用。针对其他周围神经（包括神经和腓神经）的实验性神经调节方法正在研究中，3,4,5,6。

尽管神经调节已被用于膀胱和肠道疾病的治疗中已有数十年历史，但其作用机制尚未完全明了。正如多学科专家组综述所述，目前使用的刺激参数大多由制造商基于试^错法选择7.因此，继续利用动物模型阐明潜在通路并优化刺激参数以提升治疗效果非常重要。已经进行了多项临床前实验，使用了清醒和麻醉的动物，包括老鼠、老鼠、绵羊、狗和猫。随着全球伦理指南和研究政策鼓励使用更简单、体型较小的物种，近年来啮齿动物模型被最频繁地使用。

膀胱功能障碍大鼠模型中的SNS主要采用两种方法学方法。第一种由Zvara等人描述，涉及使用血管导管或脊针将刺激电极植入骶椎^孔。第二种方法是暴露L6神经根，并将刺激电极置于L6神经下方，使用硅胶胶固定电极与神经⁹之间的接触。骶椎孔电极放置技术与临床方法相呼应。使用L6根暴露的方法虽然技术上有挑战，但能提供精准定位和更稳定的神经通路。

文献中已描述了模拟胫骨后神经刺激的大鼠动物模型。最常用的方法包括手术暴露胫神经，位于踝关节上方后肢内侧，位置^为10,11,12,13,14,15,16。另一种方法是在胫神经附近经皮插入针电^极。本文旨在详细描述胫神经刺激的起点，即臀大肌与股二头肌之间，坐骨神经分为胫神经、总腓神经和腓骨神经三个分支。此外，本研究引入了腓骨神经刺激作为一种新型动物模型，用于研究一种新的神经调节方法。该大鼠模型的转化相关性得到了最近临床引入的腓骨神经刺激膀胱神经调节的支持^18,19。

方案

这些动物按照机构指南安置在南丹麦大学动物护理设施。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用指南进行。丹麦动物实验监察机构伦理委员会批准了研究程序（协议号2022-15-0201-01158）。试剂和所用设备列于 材料表中。

1. 电极的制备

注：胫神经、腓骨神经和L6神经刺激使用^了20个双极钩状电极。以下步骤简要介绍了电极的设计和制造。

1. 剪断两根等长、125微米的聚四氟乙烯（PTFE）镀银线，并将它们扭转在一起。
2. 从线材一端剥离4–5毫米的聚四氟乙烯，均匀修剪裸露端，然后将针尖向上弯曲，穿过23克针，形成两根相距2毫米的平行钩子。
3. 将电极固定在板上，并将钩子朝上并延伸到板的边缘。
4. 将双组分硅胶混合5秒。从钩子处滴下一滴1–2毫米，晾干约5分钟。
5. 从电极另一端剥取一段1–2厘米长的PTFE涂层，以便与刺激器连接。

2. 动物制备

注：在无菌条件下，PE-50导管末端经加热膨胀，植入雌性Sprague-Dawley大鼠（250–300克）膀胱穹顶内，并用包绳缝线固定。管子的远端从动物背部伸出，盘绕在皮下袋²¹中。手术后膀胱恢复时间为五天。

1. 按照机构批准的方案，对动物进行聚氨酯麻醉（1.5克/公斤，腹腔内注射）。在实验开始前约2小时，分三次分段，每隔15分钟给药。
2. 将动物转移到加热垫上，并使其俯卧。
3. 胫骨和腓骨神经刺激时，剃除大鼠大腿区域及背部下半部分的后肢。将尾巴和5毫升注射器置于大鼠左后肢下方，固定尾巴和腿部，如 图1A所示。
4. 对于SNS，将大鼠从尾部剃到胸椎的背部，并在腹部下方放置50毫升离心管，抬高腰椎和骶部区域。
   注意：所有神经刺激实验均为非存活程序。使用干净的手术技术。

3. 腓骨神经和胫神经的剥离及电极植入

1. 用手术刀在膝关节与坐骨结节之间的中心切开3–3.5厘米的切口（见图1B）。
2. 通过将剪刀滑入皮肤下方并剪断结缔组织，将皮肤与肌肉分离。
3. 用牵开器打开皮肤，露出连接臀大肌与股二头肌的筋膜（图1C）。
4. 使用直剪刀切断筋膜，并切割臀大肌与股二头肌之间的空间，直到坐骨神经可见（图1D，E）。
5. 将牵开器重新定位在股二头肌上，以实现坐骨神经及其分支——胫神经、腓神经和腓神经——的良好暴露（图2A）。在此语境中，“腓神经”指的是在分成深腓神经和浅腓神经之前的共同腓神经。胫神经是最大的分支;腓肠神经最小，腓骨神经直径介于此。
6. 使用弯曲镊子和微剪将腓神经与周围结缔组织分离。然后用微钳小心地将组织两侧及下方分开，分离出一段5毫米长的神经。同样的程序对胫神经进行刺激（见图2B）。
   注意：避免用镊子夹住神经压迫神经，尽量减少对神经的拉扯。
7. 用手术刀在背部下半部分切开一个5毫米长的切口，然后将止血钳从切口下方滑入皮下通道。小心推进止血钳，直到尖端在后肢切口处露出（见图2C）。
8. 用止血钳抓住电极未接钩的端，缓慢地将仪器从背部下半部的切口抽出。使用两把镊子，将电极的另一端（钩端）相对于皮下平面弯曲成90°角，并确保电极的钩子紧邻且垂直于神经（腓骨或胫骨）（图2D）。
   注意：正确放置电极对于避免拉伸神经非常重要。
9. 使用弯曲的微型产钳抬起神经，并将电极钩子滑入神经下方。将双组分硅胶混合5秒，用棉签擦干神经，并涂上足够的胶水覆盖钩子和神经附近区域（见图2E–G）。
   注意：涂胶前，将电极连接到刺激器，并在运动阈值水平刺激神经，以确认电极正确放置。电机阈值被确定为引发持续相位足运动所需的最低电压。腓神经刺激产生足部相位背屈，而胫神经刺激则产生足底屈曲。在没有运动对刺激的反应时，检查刺激器与电极之间的连接。
10. 在背部切口的结缔组织中放置一根5-0尼龙支线，保持两端足够长。这些端用于固定电极，确保稳定定位。
11. 用4-0 Vicryl缝合后肢切口的皮肤。

4. 暴露L6神经并植入电极

1. 用手术刀在腰部和骶骨上方切开4–5厘米的中线切口。放置牵开器以打开切口，暴露下方的背部肌肉和椎骨棘突的尖端（见图3A）。
2. 触摸髂嵴，并以此作为定位L6棘突的标志。它可以被识别为位于髂嵴下方的第一个棘突（见图3B）。
3. 用剪刀切除L5到S2椎骨顶部的筋膜。然后仔细分离并分离双侧椎旁肌，以暴露棘突、椎板和关节突。用微剪刀切除剩余的结缔组织和肌肉，直到骨骼结构清晰可见（见图4A，B）。
   注意：这会形成一个解剖窗，可以暴露地标并进入L6神经干。识别L6的后面关节;L6神经干位于该关节的后方。同时，识别骶骨和骶髂关节。L6神经干位于该关节的尾侧和内侧（图4B）。
4. 使用隆格尔小心切除S1的棘突，并逐渐断裂并移除S1与S2椎骨之间骶骨的小碎片，露出L6神经干（图4C）。
5. 用弯曲的镊子和微剪刀将L6神经与周围组织分离。将神经连接到双极PTFE镀层银线电极，并使用生物相容性硅胶将其与周围组织隔离，步骤3.9（图4D）所述。
   注意：刺激L6神经会导致盆底肌肉收缩和尾部抽搐。
6. 在相反侧重复同样的程序进行双侧神经刺激。
7. 用4-0 Vicryl缝合皮肤。

5. 刺激电极插入骶孔

1. 用手术刀在骶骨上方做一个中线切口，并用牵开器打开切口，露出下面的背部肌肉。
   注意：按步骤4.2中提到的触诊髂嵴，定位L6/S1标志。
2. 通过钝器清扫，将椎旁肌肉与棘突分离。重新定位牵开器，以暴露棘突并促进S1骶椎孔的接触（图5A）。
3. 确定S1孔的位置，位于S1棘突的尾侧和外侧。用预装单极电极的18号针探测S1骶椎孔（见图5B）。
   注意：使用180微米PTFE涂层不锈钢线，两端均剥离5毫米绝缘层。
4. 将针尖对准S1孔，保持与脊柱平行，且相对于动物背部约倾斜30°。沿着神经轨迹轻轻前移钢丝，同时缓慢抽出针头。对侧S1孔重复此程序进行双侧刺激。
   注意：为了确认电极的正确位置，请将导线的远端连接到刺激器。电刺激会引起尾巴抽动。
5. 用5-0 Vicryl缝线将导线固定在相邻的棘突（L6）上（见图5C）。
6. 用手术刀在颈后切开1厘米的切口，并用止血钳从颈后切口到骶骨切口处形成皮下通道。
7. 将导线的远端穿过隧道，并在颈部后方进行外部处理（见图5D）。
8. 使用4-0 Vicryl缝线缝合骶骨和颈部后方皮肤。

6. 膀胱测量记录

1. 5天后，在进行刺激实验前，将PE-50管路外部化，连接到压力传感器和输液泵。
2. 以3 mL/h的速度连续输注膀胱，持续2小时，以稳定膀胱参数。
3. 利用单次膀胱内输液周期，评估膀胱测量参数，包括基线压力、阈值压力、膀胱顺应性、排便压力和膀胱容量，均在神经刺激前、中、后进行。
4. 每次实验结束时，按照伦理标准，通过麻醉过量安乐死动物。

结果

为展示评估神经调节对下尿路功能影响的实验设计，本研究在大鼠模型中应用腓神经刺激，研究膀胱内输注0.5%醋酸引起的膀胱过度活动。膀胱功能通过单次排尿周期的膀胱测定术记录，涵盖刺激前、中、后（图6 A，B）。实验装置包括两种不同持续时间的腓神经刺激，使用双相刺激波形，频率为10 Hz，脉冲持续时间为0.2毫秒，刺激强度为运动阈值的3倍（1.2–3 V）。

通过在刺激期间后足的相位背屈确认了腓神经的成功刺激。

腓神经刺激导致排便模式发生明显变化，包括刺激期间及之后膀胱容量的下降。在长时间（1小时）刺激期间，排尿压力增加，短期（10分钟）刺激后基线压力、阈值压力和排便压力均发生变化。

讨论

本文详细描述了麻醉大鼠中植入骶神经、胫骨和腓神经刺激电极的外科手术方法。

在骶椎孔植入铅电极以持续低振幅刺激S3骶神经，是治疗下尿道功能障碍和粪失禁的广泛认可方法。在患者中，电极通常置于S3孔，靶向有髓鞘和无髓鞘轴突的混合^体。该位置对应大鼠脊髓的L6–S1段。准确定位大鼠的目标神经具有挑战性。这凸显了需要制定详细的、逐步的方案，配合清晰的视觉指引，并利用神经刺激引发运动反应，确认目标神经的刺激。

在大鼠中使用胫神经刺激的研究采用了神经夹层和腿内侧踝部上方的刺激，或使用针电极进行经皮刺激。本文提出的方法通过单一切口从坐骨神经起点暴露胫神经和腓神经，允许同时刺激两条神经，同时显著简化手术过程并减少手术侵入性。

腓骨神经刺激作为治疗过产膀胱（OAB）患者的神经调节方法，最早由Krhut等人于2021年^提出。与骶神经调...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
18 G 一次性注射针	KRUUSE	121282
Dumont镊子5TM型	DUMONT	1708-5TM-PO	弯曲
Dumont镊子7XL型	DUMONT	0508-7XL-PO	弯曲
Grass SD9方波脉冲刺激器	Somatco	1077/183
止血钳	Fine Science Tools/Teleflex	13018-14/PO181059	≥ 14 cm，细尖
虹膜剪刀	World Precision Instruments	14218	直剪刀
Kwik-Sil硅弹性体	World Precision Instruments	KWIK-SIL	双组分胶
微型Adson镊子	World Precision Instruments	501245
微型剪刀	S&T	SAC-15 R-8	弯曲尖端 ≤ 10mm长
NaCl 0.9% 100 mL	B.Braun	N/A
PE-50管	Instech	BTPE-50
Prolene 5-0缝线	Ethicon	EH7257
Rongeur	George Tiemann & Co	160-424-08	细弯尖端
手术用刀	Swann-Morton	0505
聚氨酯	Sigma-Aldrich	U2500
Vicryl 4-0缝线	Ethicon	V451
Vicryl 5-0缝线	Ethicon	V303
银色特氟龙涂层铁丝 0.125 mm	World Precision Instruments	AGT0525
不锈钢特氟龙涂层铁丝 0.18 mm	World Precision Instruments	SST30407-50