本文介绍了一种将迭代蛋白染色技术（IBEX）与RNAscope相结合的实验方案。 原位 用于完整固定冷冻组织深度空间表型分析的杂交技术，适用于高分辨率空间谱型分析应用。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍一种可在完整组织中以单细胞分辨率同时进行蛋白质和核糖核酸（RNA）标志物空间分析的实验方案。实体瘤癌症研究面临的核心问题之一是无法预测患者对治疗干预的响应。解析这些复杂性需要在完整组织内对细胞行为、相互作用及表型进行定量测量。具体而言，蛋白质组和转录组提供的是部分重叠但非冗余的信息，这些信息对于设计合理的免疫治疗策略至关重要。然而，目前尚无简单且经济高效的方法，能够在保留肿瘤微环境中所有细胞关键空间定位信息的同时，深入分析其转录状态和功能状态。为此，我们成功地将IBEX（迭代漂白扩展多重性）平台与HiPlex RNAscope技术相结合，实现了在单细胞分辨率下对高重蛋白质标志物和高重核糖核酸（RNA）转录本的同步可视化。该方法引入了一步改良的RNA靶标修复步骤，以保持细胞核形态，并实现各循环间准确的图像对齐。“Bex-Plex”技术使我们能够在固定冷冻组织上先执行标准的IBEX流程，随后进行HiPlex RNAscope流程，并在其中采用改良的RNA靶标修复步骤，确保与IBEX各循环在细胞核水平上的精确对齐。本方案针对固定冷冻组织进行了优化，支持对转录状态和功能状态的细胞进行整合性空间分析。在单细胞水平上进行此类分析的能力，不仅为组织本身提供了丰富的信息资源，还有助于预测驱动治疗响应的精细细胞间相互作用，从而为研究肿瘤微环境及相关系统中的空间生物学提供了有力框架。
引言
自2011年问世以来，通过阻断抑制性免疫检查点分子（如PDL-1和CTLA-4）以减轻细胞毒性T细胞受抑制的癌症免疫疗法，已成为实体瘤治疗的金标准1。然而，尽管在患者中广泛应用，这些药物的临床疗效差异显著，因为许多实体瘤本身即具有内在耐药性，或最终会发展出对这些疗法的耐药性2。在许多情况下，这是由于实体瘤具有高度异质性，即使在同一癌症类型中亦如此3。更深入地理解实体瘤中发生的细胞间关系，是开发更优治疗策略的关键。因此，明确介导并维持这种耐药性的具体机制和相互作用，已成为癌症研究的前沿课题。本文旨在建立一种方法，实现对完整组织中蛋白质和RNA表达的整合性空间分析，以更准确地表征这些复杂的细胞相互作用。
肿瘤微环境（TME）由非癌细胞及其结构组分构成，可影响肿瘤生长和免疫应答，其中包括与肿瘤相关的成纤维细胞、浸润性免疫细胞、血管组分以及细胞外基质4。近年来，研究已明确TME的组成与空间结构显著影响肿瘤是否允许或抵抗免疫细胞浸润，这是决定免疫治疗疗效的关键因素之一5。在多种癌症中，存在一种“免疫荒漠”表型，其特征是T细胞数量较少且富含高度免疫抑制性的髓系细胞群体，该表型与对免疫检查点阻断疗法反应不佳密切相关6,
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方案
本方案中所述实验程序已获得加州大学圣地亚哥分校机构动物护理和使用委员会（协议编号 S24049）的批准。实验所用小鼠为7至12周龄、C57BL/6遗传背景的雄性和雌性小鼠，饲养于特定病原体阴性条件下。
1. 组织制备
- 采用批准的首要和次要措施（如 CO2 安乐死和颈椎脱位）对实验小鼠实施安乐死，并将目标组织收获至添加补充物的培养基中。
- 通过将4%的多聚甲醛（PFA）储备液用1×PBS稀释至0.5%或1%的终浓度，配制新鲜的组织固定液。对于体积较小的组织（如淋巴结），使用0.5% PFA；对于体积较大的组织（如肿瘤），使用1% PFA。
警告：多聚甲醛具有可燃性，若摄入或吞咽则有毒。操作时应穿戴适当的个人防护装备，避免接触皮肤或眼睛。 - 将组织转移至24孔板中，每孔加入2 mL固定液，并于4°C下过夜孵育。
注意：孵育时间超过16小时可能导致过度固定问题。 - 用1×PBS填充新的24孔板各孔，并将组织从固定液孔板转移至其中。
暂停点：如有需要，组织可在4°C条件下于1×PBS中保存最多7天。 - 使用解剖显微镜和工具逐个修剪组织上的多余脂肪或碎片。在修剪过程中，直接向组织上添加少量1×PBS以防止组织脱水。
- 通过将粉末状蔗糖储备物溶解于1×PBS中，配制3....
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结果
图 1： Bex-Plex 工作流程概览。
固定后的冷冻组织切片置于铬明矾包被的载玻片上，进行最多 3 轮标准 IBEX 染色，随后进行最多 3 轮 RNAScope HiPlex 检测，其中初始靶标修复步骤在 60°C 下进行 1 小时。然后利用定位标记物（如 DAPI）对不同轮次的图像进行配准与对齐，以生成用于下游分析的多重数据集。请点击此处查看该图的放大版本。
我们采用.......
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讨论
Bex-Plex 工作流程将迭代性蛋白质染色平台 IBEX 与 RNAscope 原位 杂交技术相结合，能够在单细胞分辨率下同时检测蛋白质和RNA转录本。本实验方案的主要目标是提供一种可重复的方法，用于对完整组织内蛋白质和RNA表达进行整合式空间分析。在同一组织中同时检测蛋白质和RNA表达此前面临诸多技术挑战：成本高昂、抗原修复步骤复杂、多重检测能力有限、分辨率不足（非单细胞水平）、信号放大非线性，以及下游分析需要复杂的生物信息学流程17,18,19。与现有的多重免疫荧光、OPAL/TSA染色和空间转录组学平台相比，Bex-Plex 能够在保持空间背景和细胞核形态完整的前提下，实现可重复、定量且高重数的同步检测。此外，Bex-Plex 可在标准实验室环境中完成，生成的数据具有单细胞分辨率，且易于后续处理。利用该方案深入理解多种组织环境中（如肿瘤微环境）的细胞间相互作用，对于开发更有效的免疫疗法并改善不同疾病状态下的患者预后至关重要。
我们的方法在包埋于OCT中的固定组织上进行，遵循标准的IBEX工作流程而不作修改，随后采用稍作调整的RNAsc.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。在本稿件的撰写过程中未使用任何基于人工智能的工具。
作者贡献：
SK 参与了数据整理、数据分析、研究和撰写。CM 参与了数据整理。PH 参与了数据分析。AV 参与了数据整理。VM 参与了研究构想、数据整理、数据分析、研究监督和撰写。
致谢
本工作由加州大学圣地亚哥分校儿科学系过敏、免疫与风湿病学部以及美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所资助 R00GM147841（MOSAIC K99/R00）和国家癌症研究所 U54CA272220（加州大学圣地亚哥分校 FIRST 项目）提供支持。作者还要特别感谢 Andrea Radtke 建立了原始的 IBEX 方法，若无此方法，我们将无法开发出 Bex-Plex。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml 微量离心管 | Biopioneer | MCNT-1.5F | |
| 200 证明乙醇（EtOH） | Fisher Scientific | BP28184 | |
| 20X SSC 缓冲液 | Invitrogen | AM9765 | |
| 24 孔板 | |||
| Alexa Fluor 488 抗小鼠 CD11b 抗体 | Biolegend | 101217 | |
| Alexa Fluor 523 抗小鼠 CD3e 抗体 | Invitrogen | 58-0032-82 | |
| Alexa Fluor 647 抗小鼠 Ly6G 抗体 | Biolegend | 127610 | |
| Alexa Fluor 700 抗小鼠 CD68 抗体 | Biolegend | 137025 | |
| BD Cytofix/Cytoperm 固定与通透溶液 | BD | 554722 | |
| 铬明胶 | Fisher | NC1692262 | |
| 共聚焦显微镜（例如 Leica Stellaris） | |||
| 冷冻模具 | VWR | 25608-922 | |
| 冷冻切片机（例如 CryoStar NX50 Cryostat） | Thermofisher Scientific | 957100 | |
| 冷冻切片机刀片（例如 Leica 低剖面一次性刀片 DB80LX） | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| 解剖显微镜（例如 Zeiss SteREO Discovery.V8） | |||
| 解剖工具 | |||
| 干冰 | |||
| 载玻片染色浸渍罐（例如 Simport Scientific EasyDip 载玻片染色罐） | Fisher Scientific | 22-038-489 | |
| Fluoromount-G | Fisher | OB10001 | |
| 加热恒温水浴 | |||
| 组织学刷（例如 Ted Pella 驼毛刷） | Fisher Scientific | NC2023341 | |
| 杂交炉（例如 HybEZ II 杂交系统） | ACD | 321710 | |
| 可选图像分析软件 | |||
| ImmEdge 疏水屏障 PAP 笔 | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| 硼氢化锂 | STREM Chemicals | 93-0397 | |
| 微量移液器（P-10、P-20、P-200、P-1000） | |||
| 小型微量离心机（例如 Corning LSE 小型微量离心机） | Corning | 6770 | |
| 小鼠 BD Fc 封闭剂 | BD | 553142 | |
| 1.5 号盖玻片 | VWR | 48393-241 | |
| 移液器吸头（P-10、P-20、P-200、P-1000） | |||
| RNAscope HiPlex 探针，mm-CD274-T7 | ACD | 420501-T7 | |
| RNAscope HiPlex 探针，mm-IL-10-T6 | ACD | 317261-T6 | |
| RNAscope HiPlex12 试剂盒 v2（包含检测试剂、裂解储备液、蛋白酶试剂、靶点修复试剂和洗涤缓冲液） | ACD | 324409 | |
| RNAscope 蛋白酶 III | ACD | 322337 | |
| RNase ZAP | Millipore Sigma | R2020-250 | |
| Simple ITK 软件：https://github.com/niaid/sitk-ibex | |||
| 载玻片染色托盘/湿室 | |||
| 蔗糖 Bioxtra | Sigma | S7903-1KG | |
| Superfrost Plus 显微载玻片 | VWR | 48311-703 | |
| Tissue-Tek OCT 包埋剂 | VWR | 25608-930 | |
| Tween-20，分子生物学级 | Promega | H5152 | |
| UltraPure 无 DNase/RNase 水 | Fisher Scientific | 10977023 |
参考文献
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Zhao, X., Subramanian, S. Intrinsic resistance of solid tumors to immune checkpoint blockade therapy. Cancer Res. 77 (4), 817-822 (2017).
- Bailey, P.,
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