Bex-Plex 能够同时可视化蛋白质标记物和核糖核酸转录本，从而对完整组织进行深度空间剖析

Summary

本文介绍了一种结合迭代蛋白染色（IBEX）与RNAscope 原位 杂交技术的方案，用于对完整固定冷冻组织进行深度空间表型分析，实现高分辨率空间剖析应用。

Abstract

本文介绍了一种方案，使蛋白质和核糖核酸（RNA）标记在完整组织中能够实现单细胞分辨率的同时空间剖析。实体肿瘤癌症的核心问题之一是无法预测患者对治疗干预的反应。解读这些复杂性需要对完整组织内的细胞行为、相互作用和表型进行定量测量。具体来说，蛋白质组和转录组提供了重叠但不冗余的信息，这对于设计合理的免疫治疗至关重要。然而，目前尚无一种直接且经济高效的方法，能够深入剖析肿瘤微环境中所有细胞的转录和功能状态，同时保留其关键的空间定位信息。为此，我们成功将IBEX（迭代漂白扩展多重性）平台与HiPlex RNAscope结合，同时以单细胞分辨率观察高plex蛋白标记和高plex核糖核酸（RNA）转录本。该方法包含修改后的RNA靶标回收步骤，以保持核形态并实现跨周期的准确图像比对。“Bex-Plex”使我们能够对固定冷冻组织执行未修改的IBEX协议，随后使用HiPlex RNAscope协议，利用修改后的RNA靶标提取确保与IBEX周期的核级比对。该方案针对固定冷冻组织进行了优化，并实现了对转录和功能细胞状态的综合空间分析。在单细胞层面进行画像的能力，不仅提供了关于组织本身的深层信息，还能预测驱动治疗响应性的细微细胞相互作用，为研究肿瘤微环境及相关系统中的空间生物学提供框架。

Introduction

自2011年问世以来，通过阻断抑制性免疫检查点分子（如PDL-1和CTLA-4）来减少细胞毒性T细胞抑制的癌症免疫疗法，已成为实体^{肿瘤治疗的}金标准。然而，尽管这些药物在患者中被大规模使用，但其临床疗效差异很大，因为许多实体肿瘤癌症要么先天表现出这些治疗，要么最终产生对这些疗法的耐药性².在许多情况下，这主要是由于实体肿瘤极其异质性，即使是在同一^类3型癌症中也是如此。深入了解实体肿瘤中细胞关系，是制定更优治疗方案的关键。因此，确定确切的机制和相互作用是癌症研究的重点。在此，我们旨在开发一种方法，能够实现完整组织中蛋白质和RNA表达的综合空间分析，以更好地表征这些复杂的细胞相互作用。

肿瘤微环境（TME）由塑造肿瘤生长和免疫反应的非癌性细胞和结构组成部分，包括与癌症相关的成纤维细胞、浸润免疫细胞、血管成分以及细胞外基质⁴。近年来，TME的组成和组织对肿瘤是否具有免疫浸润的容忍性或抗性影响，TME是决定^{免疫治疗反应}性的主要因素之一5。在许多癌症中，一种“免疫沙漠”表型，表现为T细胞数量低且存在高度免疫抑制的骨髓系群体，与检查点阻断疗法反应性差相关 ^6,7。趋化因子信号控制着许多这些招募动态。例如，CXCL1和CCL2吸引免疫抑制性骨髓细胞，而CXCR3-CXCL9/CXCl10轴则招募细胞毒性和调控T细胞进入肿瘤⁸。因此，生态位特异性信号环境能强烈影响细胞表型和功能。例如，在结直肠癌患者中，CCL5-CCR5轴控制肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的抑制功能，阻断该信号使TAM偏向抗肿瘤表型，并与临床反应改善^相关9。此外，免疫细胞、癌症相关成纤维细胞和/或肿瘤细胞通过ICAM和PDL-1的直接相互作用，可以诱导免疫耗竭并削弱抗肿瘤免疫¹⁰。这些发现共同强调了空间解析对理解TME如何影响治疗效果的重要性。

免疫荧光（IF）成像仍然是观察组织中蛋白质表达和细胞间相互作用的基础方法。该领域已从传统的3-4色中叶技术发展到依赖迭代染色和成像的高含量成像工作流程。在这些方法中，通过反复进行抗体标记、成像以及荧光团失活或去除循环，生成大量数据集，以便对更多标记进行染色和成像。迭代漂白扩展多路复用（IBEX）最近被引入，作为一种用户友好且经济高效的迭代成像平台¹²。IBEX兼容商业抗体和传统显微镜，利用硼氢化锂（LiBH₄）淬灭大多数常用染料的荧光而不损伤组织表位，从而为单个组织¹³可获得多达75个参数。通过循环染色获得的图像通过SimpleITK开源软件进行比对，生成适合高维空间分析的复合数据集。

作为蛋白质级表型分析的补充，空间转录组学方法能够提供细胞在其原生环境中转录状态的宝贵信息。值得注意的是，原位杂交（ISH）是一种常用技术，用于识别^{特定组织中}DNA或RNA序列的定位。RNAscope是一种成熟的ISH方法，利用具有独特Z化学成分的探针，以单分子分辨率特异性扩增RNA转录本，并且兼容多种不同样本类型¹⁴。作为通过先进细胞诊断（ACD）广泛采用并商业化的平台，RNAscope提供了针对多种靶点的经过验证的探针，简化了多样化应用的实验设计。

通过在同一组织内结合蛋白质和RNA检测，可以获得更完整的细胞身份和功能视图。短命分泌蛋白，如细胞因子和趋化因子，传统上缺乏可靠的IHC抗体染色，但可以通过定量其mRNA转录本获得其表达信息。此前对RNA和蛋白质共检测的尝试，如传统染色性IHC或TSA-OPAL，受限于非线性信号扩增和耗时的抗原回收协议¹⁵。与这些方法相比，Bex-Plex方法能够同时检测高plex蛋白和RNA，同时保持空间上下文和核状，实现准确的图像配准。

这里介绍“Bex-Plex”，一种整合IBEX和RNAscope平台的协议，实现细胞在原生组织中转录和翻译状态的同步且可定量表征。在Bex-Plex中，固定OCT嵌入组织采用标准IBEX协议，随后稍作修改的RNAscope HiPlex流程，目标回收在60°C下进行，培养时间为1小时，而原99°C的培养期为5分钟。这保留了核的架构，使得在将IF和ISH循环中的独立图像注册为一个时，能够准确对齐fiducial标记。该方案最适合需要同时对完整组织中蛋白质和RNA表达进行空间分析的研究，尤其是在组织可用性有限或空间结构保护至关重要的情况下，如肿瘤微环境分析或免疫分析研究。

使用广泛可用的试剂并兼容大多数成像平台，任何熟悉荧光成像且能使用传统显微镜的技术培训研究人员都可以进行Bex-Plex。这里提供的方案针对固定冷冻样本进行了优化。目前，该方案已在固定冷冻组织中验证，可能需要进一步优化以应用于其他样本类型，如FFPE或人体临床样本。

这种工作流程对于组织有限或珍贵的情境都极为宝贵，如组织活检或样本有限的动物实验，以及那些用解离技术难以提取的细胞表型。Bex-Plex 同时提供关于单个细胞转录和翻译谱的可量化信息，同时保留其空间上下文，这些数据独特地能够解答细胞在原始环境中的关系和串扰问题。

Protocol

本方案中列出的程序已获得加州大学圣地亚哥分校机构动物护理与使用委员会批准（协议编号S24049）。实验中使用了7至12周龄、基因背景为C57BL/6且处于特定无病原体条件下的雄性和雌鼠。

1. 组织制备

1. 通过批准的主要和次级措施（如_CO2 安乐死和宫颈脱位）安乐死实验小鼠，并将感兴趣的组织采集到补充培养基中。
2. 将4%的对甲醛（PFA）溶液稀释为0.5%或1%的PFA，加入1X PBS，准备一批新鲜的组织固定液。对于低体积组织如淋巴结，使用0.5%的PFA，对于体积较大的组织如肿瘤，使用1%的PFA。
   注意：对甲醛如果摄入或吞服是易燃且有毒的。请佩戴适当的个人防护装备，避免接触皮肤或眼睛。
3. 将组织转移到24孔板中，每孔加2毫升固定液，并在4°C下过夜孵育。
   注意：孵化时间超过16小时可能导致过度凝视问题。
4. 用1X PBS填充新24孔板的孔，并从固定板转移组织。
   暂停点：如有需要，组织可在4°C的1X PBS中保存，最长可达7天。
5. 用解剖镜和工具逐一修剪多余的脂肪和碎屑。在修剪时直接向组织中加入少量1X PBS，以防止组织脱水。
6. 将1倍PBS稀释蔗糖粉，制成30%的w/v蔗糖溶液。
7. 将组织转移到24孔板中，每孔2毫升30%蔗糖，并在4°C下过夜孵育以脱水。当组织沉入井底时，组织已充分脱水。
8. 用OCT填充标记的冷冻模具，然后将组织一件件放入模具中。组织取向取决于起点，但我们的标准建议是最大表面积应与冷温底平行。确保组织完全浸没在OCT中。
9. 将冰放在干冰上10分钟冷冻，并以-80°C保存。

2. 组织切片

注意：本方案所用的所有试剂和实验室材料必须不含RNase。操作滑套时请注意防止污染。

1. 在无RNase显微镜载玻片上涂覆15微升铬明矾胶，并在烤箱中60°C下培养1小时。镀铬明矾载玻片可在室温下保存长达一个月后再使用。
2. 将嵌入的OCT组织从-80°C冷冻库取出，放入-20°C低温/低温槽中，保持至少20分钟的平衡。
3. 将组织切片切片覆盖在镀铬明矾载玻片上，厚度为10–15微米。
4. 切片中切片的切片保存在4°C，或者当天染色时，让切片与RT平衡。切片切片可在4°C下保存长达5天再使用。

3. 蛋白质染色

1. 在浸泡槽中，将准备染色的玻片浸泡在无RNase的1X PBS中5分钟，以去除组织中多余的OCT。
2. 用疏水屏障笔在载玻片上的组织周围画出盒子，晾干2分钟。
3. 制备10 μg·mL^⁻1 抗小鼠FC受体阻滞液，含RNase无1X PBS。将阻断缓冲液加入载玻片上的样本，使用足够的量形成完全覆盖组织的气泡（100–150微升^·切片1）。
   注意：对于困难组织和/或标记物，有时需要在阻断缓冲区中加入FBS或BSA（通常为1–2%）。
4. 将玻片在RT浸泡在潮湿染色盒中孵育1小时，然后完全浸入装有无RNase的1X PBS浸泡槽中洗涤5分钟。
5. 在无RNase的1X PBS中制备初级抗体染色溶液，计划每次组织切片100-200微升。标准抗体稀释比例范围为1：50至1：200，但建议进行单染色滴定，以确定特定抗体和/或组织类型的最佳稀释因子。涡旋和脉冲使抗体旋转，然后移液以防止荧光聚集体。
6. 从洗涤液中取出载玻片，并用吸水式工作湿巾轻轻吸走样品盒角落的多余液体，以避免稀释抗体溶液。
7. 将抗体溶液与阻断液相同，在组织上形成气泡。
8. 将载玻片水平放置于37°C的烤箱中，孵育1小时。或者，在湿润的箱子中滑入3–4小时。可以使用已针对目标组织优化的标准IF方案。孵化期间保持载玻片在潮湿环境中，以防止脱水。（例如，在染色盘底部用湿纸巾清洗。）
9. 将载玻片浸泡在无RNase的1X PBS中2分钟。重复两次，总共洗三次。如果染色面板需要，在此期间准备无RNase的1X PBS二级抗体染色溶液。标准抗体稀释范围为1：500至1：1000，但建议进行单染色滴定，以确定特定抗体和/或组织类型的最佳稀释因子。
10. 用吸收性工作擦拭片去除载玻片上的多余PBS，并在每个组织切片中加入100–200微升次级抗体染色液。将玻片水平放置于烤箱37°C的温度下，孵化30分钟。或者，载玻片可在湿润箱中以RT染色1–2小时。
11. 将载玻片浸泡在1X无RNase的PBS中2分钟。重复两次，总共洗三次。
12. 将DAPI核染料稀释至最终浓度0.2 μg·mL⁻¹ ，含无RNase的1X PBS，并在每个组织切片中加入100–200微升。
13. 在湿润的箱子中以RT培养10分钟，然后浸入无RNase的1X PBS溶液中，并短暂上下浸泡一次。
14. 用吸水式工作擦拭液去除载玻片上的多余液体，并在每个切片中加入20–30微升水基抗褪入淡入微液。小心地将盖片放在滑套上，确保尽量减少气泡，让装载介质固化15–30分钟。
15. 想象那些染色的幻灯片。关于IBEX面板设计和图像采集的更详细说明，请参见IBEX原始发布协议^12,13。
    暂停点：将安装载玻片在4°C黑暗中保存最多3天，但建议立即进行，以确保最小化RNA降解。

4. 荧光团漂白与迭代蛋白染色

1. 将载玻片浸入无RNase的1X PBS中，直到盖子滑动轻松滑落，无需施加任何力。根据盖板安装的时间长短，安装时间可能长达16小时。
2. 在切片浸泡期间，轻轻混合至完全溶解，准备1 mg·mL^⁻1 的LiBH₄溶液，混合至完全溶解，等待10分钟激活。当溶液中存在气泡且活性持续时间可达4小时时，就会发生活化。
   注意：LiBH₄ 对水反应，避免粉状库存过多接触水分，并妥善处理废弃物。
3. 在无RNase的1X PBS中洗涤载玻片一次2分钟，去除任何附着介质残留，然后将100–150微升LiBH₄ 溶液移液移液到每个组织上。在潮湿的箱子里孵育15分钟。
   注：根据染色所用荧光团的不同，孵育时间可能需要延长（详见IBEX方法论文）^12,13。
4. 洗一次载玻片，浸泡在无RNase的1X PBS中，然后上下浸泡。
5. 按照步骤3.5-3.15，用额外的蛋白质标记染色载玻片。由于没有LiBH₄漂白，因此无需重新染色核染料。如有需要，重复蛋白质染色。
   暂停点：安装上的切片可在漂白最后一个蛋白/IBEX循环前，在4°C下保存一夜，再进行RNA的漂白。
6. 在漂白最后一个周期的荧光团后，立即使用RNAscope HiPlex。虽然标准IBEX最多可进行六个周期且未丢失组织或表位，但我们不建议该方案的蛋白质染色周期超过三周期，因为RNA转录本质量可能随着时间推移下降。

5. RNAscope HiPlex 的切片准备

1. 将载玻片完全浸入无RNase的1X PBS中，直到盖片轻松滑落，无需施加任何力量。根据盖板安装的时间长短，安装时间可能长达16小时。用无RNase的1X PBS洗一次2分钟，去除任何附着介质残留。
2. 准备200毫升50%乙醇、200毫升70%乙醇和400毫升100%乙醇。
3. 打开杂交烤箱，设定在60°C。 将10倍目标提取试剂稀释至无RNase的DI_{H 2}O工作高汤中，放入烤箱预热至步骤5.8。
   注意：未能预热目标回收试剂至60°C将影响不同周期图像的下游注册。目标回收试剂必须在回收步骤期间保持在60°C。
4. 将玻片浸入50%乙醇中。在RT上潜伏5分钟。
5. 将50%乙醇的载玻片移开，浸入70%乙醇中。在RT上潜伏5分钟。
6. 取出70%乙醇中的载玻片，浸泡在100%乙醇中。在RT下孵育5分钟，然后用新鲜的100%乙醇重复。
7. 取出100%乙醇的玻片，在RT下晾干5分钟。
8. 在每个组织切片中加入100–150微升60°C 1X靶标提取试剂，并将载玻片放入杂交炉中。在60°C下孵育1小时。
9. 取出载玻片，浸泡在无RNase的DI水中15秒冲洗。此时，将烤箱的设定温度调至40°C。
10. 将载玻片转移到100%乙醇中孵育5分钟，然后在RT下干燥至少5分钟。
11. 将蛋白酶III涂抹在切片上，每块组织切片滴1–2滴。将载玻片放入杂交烤箱，在40°C下孵育30分钟。
12. 将玻片浸入无RNase的DI_{H 2}O中，并短暂上下浸泡洗净。用新鲜蒸馏水重复，总共洗两次。

6. RNAscope试剂制备与探针杂交

1. 准备RNAscope HiPlex探针托和HiPlex探针稀释剂，需在烤箱或水浴中加热至40°C10分钟。
2. 短暂地脉冲旋转所有50倍探针枪托。通过用RNAscope探针稀释剂将每个独特靶探针稀释为1倍，制备工作探针混合物。计划每组使用50–100微升探针混合物，使用前通过漩涡充分混合。RNAscope HiPlex协议最多可支持3个周期，每周期4个探针（共12个探针，标记为T1-12）。有关探针设计的指导，请参阅原始发布的RNAscope协议¹⁴。
3. 将RNAscope HiPlex Amp 1–3和HiPlex Fluoro T1-T4试剂置于RT下以达到平衡。
4. 取蛋白酶III处理的切片，将50–100微升探针混合物移液到每个组织切片上。横置于杂交炉中，在40°C下孵育2小时。
5. 将玻片完全浸入1X洗涤缓冲液中2分钟。用新鲜缓冲液重复，总共洗两次。
   暂停点：切片可在RT的5X SSC缓冲区中过夜保存，详见ACD的RNAscope协议。如果使用该暂停点，请注意第二天早上需要在1X洗涤缓冲液中进行两次2分钟的洗涤。

7. 探针放大

注意：在应用载玻片前，确保所有试剂均与RT平衡。

1. 在载玻片中加入1–2滴HiPlex Amp1试剂，并在40°C的杂交炉中孵育30分钟。将玻片完全浸入1X洗涤缓冲液中2分钟。重复这个过程，总共洗两次。
2. 将1–2滴HiPlex Amp2试剂加入载玻片，并在40°C的杂交炉中孵育30分钟。将玻片完全浸入1X洗涤缓冲液中2分钟。重复这个过程，总共洗两次。
3. 在载玻片中加入1–2滴HiPlex Amp3试剂，并在40°C的杂交炉中孵育30分钟。将玻片完全浸入1X洗涤缓冲液中2分钟。重复这个过程，总共洗两次。
4. 将1–2滴HiPlex Fluoro T1-T4试剂加入载玻片，并在40°C的杂交炉中培养15分钟。将玻片完全浸入1X洗涤缓冲液中2分钟。重复这个过程，总共洗两次。
5. 在每个组织切片中加入3–4滴HiPlex DAPI试剂，并在RT下培养1分钟。
6. 用吸水式工作擦拭器将载玻片上的液体吸走，去除DAPI。立即在每个段块中加入100微升水基防衰减安装介质（可与IBEX染色步骤中使用的同一种）。小心地在滑套上放置盖片，尽量减少气泡，让装裱介质干燥15到30分钟。
7. 进行影像检查。
   暂停点：安装载玻片可在4°C的黑暗中保存长达3天，但建议尽快进行，以确保RNA降解最小。

8. 切割荧光团及迭代RNA杂交

1. 要去除玻片的盖子滑套，先用4倍SSC缓冲液浸泡至少30分钟，用RT浸泡。洗一次时，将玻片完全浸入新的4倍SSC缓冲液中，并短暂上下浸泡。
2. 打开一瓶新鲜的切割液，用4倍SSC缓冲液稀释，制成10%的工作高汤。
3. 将载玻片放入湿润的盒子中，加入3–4滴10%切割液。在RT下孵育15分钟，然后完全浸入0.5%PBST中洗涤载玻片2分钟。用新的PBST重复，总共洗2次。
4. 要进行RNAscope面板的第二阶段影像，先将HiPlex Fluoro T5-T8试剂与RT平衡。
5. 打开杂交烤箱，温度设为40°C。
6. 将HiPlex Fluoro T5-T8试剂加入载玻片，并在40°C的杂交烤箱中培养15分钟。将玻片完全浸入1X洗涤缓冲液中2分钟。重复这个过程，总共洗两次。
7. 小心地将多余的液体从载玻片中吸走。立即在每个切片中加入100微升装载介质，并小心地在载玻片上放置盖片。让装裱介质干燥15–30分钟后进行成像。
8. 如适用，使用HiPlex Fluoro T9-T12试剂重复步骤8.1–8.7，共计3个RNAscope周期。请注意，虽然RNAscope HiPlex协议支持3个周期，但该方案蛋白质染色所需的额外时间可能会影响RNA质量。因此，3个周期可能并不总是可行，具体取决于所针对的具体转录本。

9. 图像处理

1. 逐轮处理原始文件，并使用一致参数进行图像处理，包括背景减法设置、平滑滤镜和配准转换类型。通道应以一致的分隔符命名（例如，第一周期：CD45 AF532，其中“：”区分循环与标记/荧光）。
2. 启动 SimpleITK 软件（https://github.com/niaid/sitk-ibex），点击 Imaris 扩展> SimpleITK >使用公共通道仿射注册 z-栈。
3. 从每个复用周期上传一个图像文件，并为所有命名通道输入分隔符（例如“：”）。
4. 选择用于图像定位的通道和所有其他图像将对齐的固定图像。建议使用 DAPI 作为基准标记，尽管所有周期之间任何共同命名通道都可以使用。
5. 点击“注册”，然后“重新采样并保存合并图像”。
6. 继续用你选择的软件进行下游分析。有关图像处理和配准的更多信息，请参阅原始IBEX协议^12,13。

Results

图1：Bex-Plex工作流程概述。
固定冷冻组织切片于镀铬明矾载玻片上，先进行最多3个标准IBEX循环，随后进行最多3个RNAScope HiPlex循环，在60°C下进行初步靶标提取步骤，持续1小时。然后对不同周期的图像进行注册和对齐，使用依据标记（如DAPI）创建多路复用数据集进行后续分析。请点击此处查看该图的放大版本。

我们利用上述方案分析了小鼠胰导管腺癌（PDAC）模型的肿瘤微环境（TME）（见图1）。从Kras^LSL-G12D/+分离出的肿瘤系;Trp53^L/+;Pdx1-Cre;Rosa26^YFP/YFP（KPCY）小鼠自发性发展胰腺癌并具备人类PDAC的许多关键特征，被皮下注射至C57BL/6小鼠⁷的侧腹。肿瘤携带小鼠随后接受联合免疫疗法，包括抗^PD1（即200微克小鼠1，RMP1-14）和抗CTLA-4（即200微克小鼠^1,9H10），于着床后第10天施用，并每3天持续一次直至实验终点。激动性抗CD40（ip.1,100 μg-mouse-1，FGK45）于着床后第13天单次给药。我们统称此为“FPC”，如先前发布的7,16。每个实验组在植入后16天采集3个肿瘤，固定冷冻切片安装在镀铬明矾载玻片上用于Bex-Plex。

图2：代表性IBEX + RNAscope（Bex-Plex）结果。
（A）胰 管腺癌（PDAC） 肿瘤切片中结合IBEX和RNA镜染色，显示出蛋白质和RNA靶点的共检测及荧光通道的比对。10微米（B）量化T细胞（CD3+ CD11b-）、巨噬细胞（CD11b+ CD68+）和髓系（CD11b+ CD68- Ly6G +/-）免疫区室，基于蛋白质标记通道强度。图表显示了每种细胞类型按处理组划分的平均细胞密度，n=3个肿瘤。（C）定量此前由蛋白质识别的免疫区室中表达 Pdl1 和 Il10 转录本细胞。图表显示了按治疗组划分的平均细胞密度，n=3个肿瘤。请点击此处查看该图的放大版本。

对三例FPC处理的肿瘤和三例同型处理肿瘤进行了一次蛋白质染色周期，以评估治疗组间对髓系谱系细胞的影响。共采集了七个参数，但这里重点关注三个重要标志物：CD11b、Ly6G和CD68（见图2A）。图像采集后，对蛋白染色产生的荧光团进行漂白，并利用探针针对 Il10 和 Pdl1 进行了一轮RNAscope检测（见图2A）。随后，分别的图像使用DAPI作为基准对齐（图2A）。CD11b、CD68、Ly6G和CD3的定量平均荧光强度显示，FPC治疗肿瘤中巨噬细胞和髓系细胞数量相较对照组减少（见图2B）。对所有样本进行了定量比较，数据以均值形式呈现。此外，FPC治疗中表达 Pdl1、 Il10或两者组合的细胞数量在巨噬细胞和髓系间室均呈下降趋势（见图2C）。这些结果表明治疗后免疫抑制细胞数量可能减少，这与预期的生物反应一致。

图3：核保存目标回收条件的优化。
（A） RT靶标取材后组织的代表性图像，显示核肿胀和形态不清晰。核尺寸的例子用黄色轮廓表示。比例条，40微米 （B） 修改靶标取材后组织的代表性图像，显示在调整温度条件下核形态改善。黄色轮廓表示核规模的例子。尺度杆，40微米 （C） 通过基于DAPI的断裂确定的平均核体积，适用于接受RT靶标反复（未预热）、60°C预热靶标反复或在标准间因子条件下无靶标反复的组织。图表条表示均值，误差条表示标准差。P<0.0001，通过普通单向方差分析（星号表示统计显著阈值）;n= 每个条件1639个单元。（D） 表示三张图像对齐前后相关系数的热图。成功注册和因核级差异导致未对齐的注册显示相关分数。

值得注意的是，当Bex-Plex在未进行上述修正靶标检索的情况下进行时，细胞核看起来扩大且边缘不明显，而在正确进行修正目标提取的组织中，细胞核则显得不明显 （见图3A 和 B）。使用室温靶标标反复逆转剂相比预热至60°C试剂，基于DAPI染色的平均核体积增加了33% （见图3C）。通过基于DAPI的分段，从代表性样品场中获得了核体积测量。此外，当该步骤在60°C使用预热回收试剂进行时，平均核体积与标准间断染色后的平均核容量无显著差异 （见图3C）。由于DAPI是图像比对最有效的参考参数，本比较（见图3）凸 显了修改后的反演参数对保持核形态的关键性。正确的图像配准通过接近1的比对相关性分数表示，表明不同周期图像之间的相似性（见图3D， 前后与成功时）。

该方案的成功实施体现在细胞核形态的保存、强且特异的RNA信号以及蛋白质和RNA通道的准确比对。相比之下，次优结果可能包括核扭曲、RNA信号弱或弥漫，以及成像周期间的错位（见图3D，前后与失败前）。如 图3C所示，核形态应在整个方案中保持，且在定性和定量上均可见。在实施Bex-Plex之前，用户应通过 分别 的蛋白质和RNA染色来确定目标组织的真实性。这不仅确保了目标组织的蛋白质和RNA染色优化，还提供了相关的空间图案，这些图案在Bex-Plex合成时应被保留。例如，CD11b与CD68和Ly6G共定位，并表现出细胞膜着色（见图2A）。这是意料之中的，因为CD11b是全髓系细胞标志物，而CD68和Ly6G是巨噬细胞和中性粒细胞髓系亚组的标志。成功的RNA检测表现为局部于单个细胞的明显点状信号，而次优结果可能表现为染色弱或弥漫。RNA探针信号应在核内及周围表现出定位，具体取决于转录本功能。结构性蛋白标记如维瑙素可用于通过揭示复杂组织中的细胞膜，提高细胞转录本定位的分辨率。阴性或对照样本预计显示背景染色极少且无非特异性探针信号，确认蛋白质和RNA检测的特异性。

Discussion

Bex-Plex的工作流程将迭代蛋白染色平台IBEX与RNAscope原 位 杂交集成，实现单细胞分辨率下同时检测蛋白质和RNA转录本。该方案的主要目标是提供一种可重复的综合空间分析方法，用于完整组织中蛋白质和RNA表达的综合分析。在同一组织中同时测量蛋白质和RNA表达的能力此前存在技术挑战：高成本、复杂的抗原提取步骤、有限的多重复用能力、分辨率限制（非单细胞）、非线性信号放大，以及用于下游处理的庞大生物信息学流程 ^17,18,19。与现有方法如多重免疫荧光、OPAL/TSA染色和空间转录组学平台相比，Bex-Plex能够实现可重复、定量且高plex的同时检测，同时保持空间上下文和核形态，实现图像准确对齐。此外，Bex-Plex 可以在标准实验室环境中运行，并以单单元分辨率生成数据，处理简便。利用该方案全面理解肿瘤微环境中的细胞间相互作用，对于开发更有效的免疫疗法和改善不同疾病状态的患者结局至关重要。

我们的方法在嵌入OCT的固定组织上进行，遵循标准IBEX工作流程，不作修改，随后采用稍作修改的RNAscope HiPlex方案。一个关键区别是RNA杂交工作流程开始时的靶点-重现步骤：制造商要求的99°C5分钟，而是在60°C下进行1小时的反复。这种调整保留了核结构，这对于蛋白质和RNA循环之间的准确图像比对至关重要。该方案的关键步骤包括保持目标回收温度的稳定、利用LiBH₄高效漂白荧光团，以及通过快速处理和使用无RNase试剂来最小化RNA降解。确保在60°C使用预热的靶标反复试剂至关重要;即使孵育步骤改变，若未做到这一点，也可能引发核膨胀。

虽然研究表明15分钟的LiBH₄ 孵育足以使许多常用荧光团失活，但建议在运行整个Bex-Plex方案前，针对每个蛋白质周期逐一验证该过程。在最初的IBEX文献中，充分表征指出并非所有IBEX兼容的荧光体^{均具有同等}的漂白性。此外，我们实验室观察到一些高丰度结构标志物如维门素可能需要更长的漂白时间。确认所使用的荧光团和标记物组合能够充分漂白，应能防止残留信号溢出到后续的蛋白质和RNA循环中。IBEX社区页面提供了优秀的IBEX兼容面板设计资源，专门通过标注抗体疗效和荧光团漂白次数²⁰，减轻新用户的负担。此外，迭代染色和漂白不应影响RNA转录本质量，但尽快完成蛋白质循环并使用无RNA酶试剂以减少随时间可能发生的RNA降解非常重要。未能做到这一点会影响探针杂交，导致任何RNAscope周期的信号降低，尤其是低丰度转录本。该方案中常见的问题包括RNA信号较弱、荧光团漂白不完全以及成像周期间的错位，这些问题可通过优化染色条件和成像参数来缓解。

必须将蛋白质染色与RNA探针杂交之间的时间限制在5天以内。在多载玻片上进行Bex-Plex时，强烈建议一次处理一切片，以减少RNA降解的变异性。同样，限制探针杂交与成像之间的时间。虽然我们成功成像了扩增后3天内的影像，但不建议延长存储时间。如果在多次染色或杂交周期后信号减少，可能需要在整个协议中提高速度。理想情况下，我们建议尽快处理，因为延迟会降低RNA完整性并降低扩增能力。其他方法包括减少蛋白质周期的数量，以便更易适应协议的时间限制，或改变RNA探针面板设计以包含更高丰度的靶点。在结合IBEX和RNAscope之前，分别验证每个周期的抗体和探针面板，以确定每个周期的预期信号质量。如果靶材回收后发生核膨胀，可能是靶标回收试剂未得到适当预热。确保提取试剂在稀释并预热至60^°C后不让其冷却，并且在1小时的载玻片孵育期间温度保持稳定。最后，如果图像配准和对准在无核膨胀的情况下失败，意味着图像采集参数（如位深、体素大小或Z轴位置）在周期间存在不匹配。在出现此类错误时，可能需要重复该方案并调整设置以保持一致。这些故障排除策略对于确保实验间的重复性和一致性至关重要。

Bex-Plex生成的数据使得组织空间景观的深入视图得以实现，达到了此前无法达到的层面。然而，该方案的一个主要限制是由于RNA随时间逐渐降解，可能的迭代蛋白循环次数低于单纯IBEX。虽然标准IBEX已进行最多6个周期，但我们不建议Bex-Plex的蛋白质染色周期超过3个周期。即便如此，该协议仍支持最大数量的RNAscope周期，这种多路复用深度对于大多数应用来说已足够。

其他限制还包括不同组织类型的变异性以及可能出现的自发荧光或染色伪影，影响信号解读。更脆弱的组织能承受更少的周期，不同组织类型可能具有影响染色的独特特性。这些限制可以通过单周期染色的蛋白质或RNA进行评估，并在运行Bex-Plex之前加以解决。切片在镀铬明矾载玻片上将显著改善组织的附着性和结构完整性，但自体荧光是所有免疫荧光技术的共同考量因素。此外，目前该方案尚未在FFPE或人体临床样本中得到验证，因此需要进一步优化以适应此类应用。然而，鉴于IBEX和RNAscope主要在福马林固定石蜡嵌入（FFPE）组织上进行，Bex-Plex有可能扩展到这些样本类型。成功实现还需进一步优化抗原提取，甚至可能实现靶点提取步骤，以保持RNA质量。

总体而言，Bex-Plex 提供了一种简单、经济且广泛可及的高空间分析方法。该方法特别适用于肿瘤微环境分析、免疫细胞分析以及信号相互作用的空间映射等应用。这一综合视角增强了在多种实验模型中探讨免疫调控、肿瘤异质性和治疗响应机制的能力。Bex-Plex对于需要研究完整组织中细胞间相互作用的情境非常宝贵，比如肿瘤微环境或其他组织在炎症和稳态期间发生的相互作用。特别是，通过探测短寿命分子的转录本结合表型蛋白标记，解析细胞因子信号的空间动态，将为疾病状态间的细胞相互作用提供更深入的理解。未来的改进可能包括增加多重复用能力、与自动图像分析流程的集成，以及通过扩展工作流程以涵盖FFPE组织来适应临床活检样本。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 proof EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC buffer	Invitrogen	AM9765
24 well plates
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 anti-mouse CD3e Antibody	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD68 Antibody	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm fixation and permeablization solution	BD	554722
Chrome alum gelatin	Fisher	NC1692262
Confocal microscope (e.g Leica Stellaris)
Cryomolds	VWR	25608-922
Cryostat (e.g CryoStar NX50 Cryostat)	Thermofisher Scientific	957100
Cryostat blades (e.g Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Dissection microscope (e.g Zeiss SteREO Discovery.V8)
Dissection tools
Dry Ice
Dunk tank for slide staining (e.g Simport Scientific EasyDip Slide Staining Jars)	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
Heated water bath
Histology brushes (e.g. Ted Pella Camel Hair Brushes)	Fisher Scientific	NC2023341
Hybridization oven (e.g. HybEZ II Hybridization System)	ACD	321710
Image analysis software of choice
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
Lithium borohydride	STREM Chemicals	93-0397
Micropipettes (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Mini Microcentrifuge (e.g. Corning LSE Mini Microcentrifuge)	Corning	6770
Mouse BD Fc Block	BD	553142
No 1.5 Coverglass	VWR	48393-241
Pipette tips (P-10, P-20, P-200, P-1000)
RNAscope HiPlex Probe, mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex Probe, mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 (includes detection kit, cleaving stock solution, protease reagents, target retreival reagents, and wash buffer)	ACD	324409
RNAscope Protease III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITK software: https://github.com/niaid/sitk-ibex
Slide staining tray/humidity chamber
Sucrose Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus Microscope slides	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Tween-20, Molecular Biology grade	Promega	H5152
UltraPure DNase/RNase free water	Fisher Scientific	10977023