Bex-Plex 能够同时可视化蛋白质标记物和核糖核酸转录本，从而对完整组织进行深度空间剖析

摘要

本文介绍了一种结合迭代蛋白染色（IBEX）与RNAscope 原位 杂交技术的方案，用于对完整固定冷冻组织进行深度空间表型分析，实现高分辨率空间剖析应用。

摘要

本文介绍了一种方案，使蛋白质和核糖核酸（RNA）标记在完整组织中能够实现单细胞分辨率的同时空间剖析。实体肿瘤癌症的核心问题之一是无法预测患者对治疗干预的反应。解读这些复杂性需要对完整组织内的细胞行为、相互作用和表型进行定量测量。具体来说，蛋白质组和转录组提供了重叠但不冗余的信息，这对于设计合理的免疫治疗至关重要。然而，目前尚无一种直接且经济高效的方法，能够深入剖析肿瘤微环境中所有细胞的转录和功能状态，同时保留其关键的空间定位信息。为此，我们成功将IBEX（迭代漂白扩展多重性）平台与HiPlex RNAscope结合，同时以单细胞分辨率观察高plex蛋白标记和高plex核糖核酸（RNA）转录本。该方法包含修改后的RNA靶标回收步骤，以保持核形态并实现跨周期的准确图像比对。“Bex-Plex”使我们能够对固定冷冻组织执行未修改的IBEX协议，随后使用HiPlex RNAscope协议，利用修改后的RNA靶标提取确保与IBEX周期的核级比对。该方案针对固定冷冻组织进行了优化，并实现了对转录和功能细胞状态的综合空间分析。在单细胞层面进行画像的能力，不仅提供了关于组织本身的深层信息，还能预测驱动治疗响应性的细微细胞相互作用，为研究肿瘤微环境及相关系统中的空间生物学提供框架。

引言

自2011年问世以来，通过阻断抑制性免疫检查点分子（如PDL-1和CTLA-4）来减少细胞毒性T细胞抑制的癌症免疫疗法，已成为实体^{肿瘤治疗的}金标准。然而，尽管这些药物在患者中被大规模使用，但其临床疗效差异很大，因为许多实体肿瘤癌症要么先天表现出这些治疗，要么最终产生对这些疗法的耐药性².在许多情况下，这主要是由于实体肿瘤极其异质性，即使是在同一^类3型癌症中也是如此。深入了解实体肿瘤中细胞关系，是制定更优治疗方案的关键。因此，确定确切的机制和相互作用是癌症研究的重点。在此，我们旨在开发一种方法，能够实现完整组织中蛋白质和RNA表达的综合空间分析，以更好地表征这些复杂的细胞相互作用。

肿瘤微环境（TME）由塑造肿瘤生长和免疫反应的非癌性细胞和结构组成部分，包括与癌症相关的成纤维细胞、浸润免疫细胞、血管成分以及细胞外基质⁴。近年来，TME的组成和组织对肿瘤是否具有免疫浸润的容忍性或抗性影响，TME是决定^{免疫治疗反应}性的主要因素之一5。在许多癌症中，一种“免疫沙漠”表型，表现为T细胞数量低且存在高度免疫抑制的骨髓系群体，与检查点阻断疗法反应性差相关 ^6,7。趋化因子信号控制着许多这些招募动态。例如，CXCL1和CCL2吸引免疫抑制性骨髓细胞，而CXCR3-CXCL9/CXCl10轴则招募细胞毒性和调控T细胞进入肿瘤⁸。因此，生态位特异性信号环境能强烈影响细胞表型和功能。例如，在结直肠癌患者中，CCL5-CCR5轴控制肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的抑制功能，阻断该信号使TAM偏向抗肿瘤表型，并与临床反应改善^相关9。此外，免疫细胞、癌症相关成纤维细胞和/或肿瘤细胞通过ICAM和PDL-1的直接相互作用，可以诱导免疫耗竭并削弱抗肿瘤免疫¹⁰。这些发现共同强调了空间解析对理解TME如何影响治疗效果的重要性。

免疫荧光（IF）成像仍然是观察组织中蛋白质表达和细胞间相互作用的基础方法。该领域已从传统的3-4色中叶技术发展到依赖迭代染色和成像的高含量成像工作流程。在这些方法中，通过反复进行抗体标记、成像以及荧光团失活或去除循环，生成大量数据集，以便对更多标记进行染色和成像。迭代漂白扩展多路复用（IBEX）最近被引入，作为一种用户友好且经济高效的迭代成像平台¹²。IBEX兼容商业抗体和传统显微镜，利用硼氢化锂（LiBH₄）淬灭大多数常用染料的荧光而不损伤组织表位，从而为单个组织¹³可获得多达75个参数。通过循环染色获得的图像通过SimpleITK开源软件进行比对，生成适合高维空间分析的复合数据集。

作为蛋白质级表型分析的补充，空间转录组学方法能够提供细胞在其原生环境中转录状态的宝贵信息。值得注意的是，原位杂交（ISH）是一种常用技术，用于识别^{特定组织中}DNA或RNA序列的定位。RNAscope是一种成熟的ISH方法，利用具有独特Z化学成分的探针，以单分子分辨率特异性扩增RNA转录本，并且兼容多种不同样本类型¹⁴。作为通过先进细胞诊断（ACD）广泛采用并商业化的平台，RNAscope提供了针对多种靶点的经过验证的探针，简化了多样化应用的实验设计。

通过在同一组织内结合蛋白质和RNA检测，可以获得更完整的细胞身份和功能视图。短命分泌蛋白，如细胞因子和趋化因子，传统上缺乏可靠的IHC抗体染色，但可以通过定量其mRNA转录本获得其表达信息。此前对RNA和蛋白质共检测的尝试，如传统染色性IHC或TSA-OPAL，受限于非线性信号扩增和耗时的抗原回收协议¹⁵。与这些方法相比，Bex-Plex方法能够同时检测高plex蛋白和RNA，同时保持空间上下文和核状，实现准确的图像配准。

这里介绍“Bex-Plex”，一种整合IBEX和RNAscope平台的协议，实现细胞在原生组织中转录和翻译状态的同步且可定量表征。在Bex-Plex中，固定OCT嵌入组织采用标准IBEX协议，随后稍作修改的RNAscope HiPlex流程，目标回收在60°C下进行，培养时间为1小时，而原99°C的培养期为5分钟。这保留了核的架构，使得在将IF和ISH循环中的独立图像注册为一个时，能够准确对齐fiducial标记。该方案最适合需要同时对完整组织中蛋白质和RNA表达进行空间分析的研究，尤其是在组织可用性有限或空间结构保护至关重要的情况下，如肿瘤微环境分析或免疫分析研究。

使用广泛可用的试剂并兼容大多数成像平台，任何熟悉荧光成像且能使用传统显微镜的技术培训研究人员都可以进行Bex-Plex。这里提供的方案针对固定冷冻样本进行了优化。目前，该方案已在固定冷冻组织中验证，可能需要进一步优化以应用于其他样本类型，如FFPE或人体临床样本。

这种工作流程对于组织有限或珍贵的情境都极为宝贵，如组织活检或样本有限的动物实验，以及那些用解离技术难以提取的细胞表型。Bex-Plex 同时提供关于单个细胞转录和翻译谱的可量化信息，同时保留其空间上下文，这些数据独特地能够解答细胞在原始环境中的关系和串扰问题。

方案

本方案中列出的程序已获得加州大学圣地亚哥分校机构动物护理与使用委员会批准（协议编号S24049）。实验中使用了7至12周龄、基因背景为C57BL/6且处于特定无病原体条件下的雄性和雌鼠。

1. 组织制备

1. 通过批准的主要和次级措施（如_CO2 安乐死和宫颈脱位）安乐死实验小鼠，并将感兴趣的组织采集到补充培养基中。
2. 将4%的对甲醛（PFA）溶液稀释为0.5%或1%的PFA，加入1X PBS，准备一批新鲜的组织固定液。对于低体积组织如淋巴结，使用0.5%的PFA，对于体积较大的组织如肿瘤，使用1%的PFA。
   注意：对甲醛如果摄入或吞服是易燃且有毒的。请佩戴适当的个人防护装备，避免接触皮肤或眼睛。
3. 将组织转移到24孔板中，每孔加2毫升固定液，并在4°C下过夜孵育。
   注意：孵化时间超过16小时可能导致过度凝视问题。
4. 用1X PBS填充新24孔板的孔，并从固定板转移组织。
   暂停点：如有需要，组织可在4°C的1X PBS中保存，最长可达7天。
5. 用解剖镜和工具逐一修剪多余的脂肪和碎屑。在修剪时直接向组织中加入少量1X PBS，以防止组织脱水。
6. 将1倍PBS稀释蔗糖粉，制成30%的w/v蔗糖溶液。
7. 将组织转移到24孔板中，每孔2毫升30%蔗糖，并在4°C下过夜孵育以脱水。当组织沉入井底时，组织已充分脱水。
8. 用OCT填充标记的冷冻模具，然后将组织一件件放入模具中。组织取向取决于起点，但我们的标准建议是最大表面积应与冷温底平行。确保组织完全浸没在OCT中。
9. 将冰放在干冰上10分钟冷冻，并以-80°C保存。

2. 组织切片

注意：本方案所用的所有试剂和实验室材料必须不含RNase。操作滑套时请注意防止污染。

1. 在无RNase显微镜载玻片上涂覆15微升铬明矾胶，并在烤箱中60°C下培养1小时。镀铬明矾载玻片可在室温下保存长达一个月后再使用。
2. 将嵌入的OCT组织从-80°C冷冻库取出，放入-20°C低温/低温槽中，保持至少20分钟的平衡。
3. 将组织切片切片覆盖在镀铬明矾载玻片上，厚度为10–15微米。
4. 切片中切片的切片保存在4°C，或者当天染色时，让切片与RT平衡。切片切片可在4°C下保存长达5天再使用。

3. 蛋白质染色

1. 在浸泡槽中，将准备染色的玻片浸泡在无RNase的1X PBS中5分钟，以去除组织中多余的OCT。
2. 用疏水屏障笔在载玻片上的组织周围画出盒子，晾干2分钟。
3. 制备10 μg·mL^⁻1 抗小鼠FC受体阻滞液，含RNase无1X PBS。将阻断缓冲液加入载玻片上的样本，使用足够的量形成完全覆盖组织的气泡（100–150微升^·切片1）。
   注意：对于困难组织和/或标记物，有时需要在阻断缓冲区中加入FBS或BSA（通常为1–2%）。
4. 将玻片在RT浸泡在潮湿染色盒中孵育1小时，然后完全浸入装有无RNase的1X PBS浸泡槽中洗涤5分钟。
5. 在无RNase的1X PBS中制备初级抗体染色溶液，计划每次组织切片100-200微升。标准抗体稀释比例范围为1：50至1：200，但建议进行单染色滴定，以确定特定抗体和/或组织类型的最佳稀释因子。涡旋和脉冲使抗体旋转，然后移液以防止荧光聚集体。
6. 从洗涤液中取出载玻片，并用吸水式工作湿巾轻轻吸走样品盒角落的多余液体，以避免稀释抗体溶液。
7. 将抗体溶液与阻断液相同，在组织上形成气泡。
8. 将载玻片水平放置于37°C的烤箱中，孵育1小时。或者，在湿润的箱子中滑入3–4小时。可以使用已针对目标组织优化的标准IF方案。孵化期间保持载玻片在潮湿环境中，以防止脱水。（例如，在染色盘底部用湿纸巾清洗。）
9. 将载玻片浸泡在无RNase的1X PBS中2分钟。重复两次，总共洗三次。如果染色面板需要，在此期间准备无RNase的1X PBS二级抗体染色溶液。标准抗体稀释范围为1：500至1：1000，但建议进行单染色滴定，以确定特定抗体和/或组织类型的最佳稀释因子。
10. 用吸收性工作擦拭片去除载玻片上的多余PBS，并在每个组织切片中加入100–200微升次级抗体染色液。将玻片水平放置于烤箱37°C的温度下，孵化30分钟。或者，载玻片可在湿润箱中以RT染色1–2小时。
11. 将载玻片浸泡在1X无RNase的PBS中2分钟。重复两次，总共洗三次。
12. 将DAPI核染料稀释至最终浓度0.2 μg·mL⁻¹ ，含无RNase的1X PBS，并在每个组织切片中加入100–200微升。
13. 在湿润的箱子中以RT培养10分钟，然后浸入无RNase的1X PBS溶液中，并短暂上下浸泡一次。
14. 用吸水式工作擦拭液去除载玻片上的多余液体，并在每个切片中加入20–30微升水基抗褪入淡入微液。小心地将盖片放在滑套上，确保尽量减少气泡，让装载介质固化15–30分钟。
15. 想象那些染色的幻灯片。关于IBEX面板设计和图像采集的更详细说明，请参见IBEX原始发布协议^12,13。
    暂停点：将安装载玻片在4°C黑暗中保存最多3天，但建议立即进行，以确保最小化RNA降解。

4. 荧光团漂白与迭代蛋白染色

1. 将载玻片浸入无RNase的1X PBS中，直到盖子滑动轻松滑落，无需施加任何力。根据盖板安装的时间长短，安装时间可能长达16小时。
2. 在切片浸泡期间，轻轻混合至完全溶解，准备1 mg·mL^⁻1 的LiBH₄溶液，混合至完全溶解，等待10分钟激活。当溶液中存在气泡且活性持续时间可达4小时时，就会发生活化。
   注意：LiBH₄ 对水反应，避免粉状库存过多接触水分，并妥善处理废弃物。
3. 在无RNase的1X PBS中洗涤载玻片一次2分钟，去除任何附着介质残留，然后将100–150微升LiBH₄ 溶液移液移液到每个组织上。在潮湿的箱子里孵育15分钟。
   注：根据染色所用荧光团的不同，孵育时间可能需要延长（详见IBEX方法论文）^12,13。
4. 洗一次载玻片，浸泡在无RNase的1X PBS中，然后上下浸泡。
5. 按照步骤3.5-3.15，用额外的蛋白质标记染色载玻片。由于没有LiBH₄漂白，因此无需重新染色核染料。如有需要，重复蛋白质染色。
   暂停点：安装上的切片可在漂白最后一个蛋白/IBEX循环前，在4°C下保存一夜，再进行RNA的漂白。
6. 在漂白最后一个周期的荧光团后，立即使用RNAscope HiPlex。虽然标准IBEX最多可进行六个周期且未丢失组织或表位，但我们不建议该方案的蛋白质染色周期超过三周期，因为RNA转录本质量可能随着时间推移下降。

5. RNAscope HiPlex 的切片准备

1. 将载玻片完全浸入无RNase的1X PBS中，直到盖片轻松滑落，无需施加任何力量。根据盖板安装的时间长短，安装时间可能长达16小时。用无RNase的1X PBS洗一次2分钟，去除任何附着介质残留。
2. 准备200毫升50%乙醇、200毫升70%乙醇和400毫升100%乙醇。
3. 打开杂交烤箱，设定在60°C。 将10倍目标提取试剂稀释至无RNase的DI_{H 2}O工作高汤中，放入烤箱预热至步骤5.8。
   注意：未能预热目标回收试剂至60°C将影响不同周期图像的下游注册。目标回收试剂必须在回收步骤期间保持在60°C。
4. 将玻片浸入50%乙醇中。在RT上潜伏5分钟。
5. 将50%乙醇的载玻片移开，浸入70%乙醇中。在RT上潜伏5分钟。
6. 取出70%乙醇中的载玻片，浸泡在100%乙醇中。在RT下孵育5分钟，然后用新鲜的100%乙醇重复。
7. 取出100%乙醇的玻片，在RT下晾干5分钟。
8. 在每个组织切片中加入100–150微升60°C 1X靶标提取试剂，并将载玻片放入杂交炉中。在60°C下孵育1小时。
9. 取出载玻片，浸泡在无RNase的DI水中15秒冲洗。此时，将烤箱的设定温度调至40°C。
10. 将载玻片转移到100%乙醇中孵育5分钟，然后在RT下干燥至少5分钟。
11. 将蛋白酶III涂抹在切片上，每块组织切片滴1–2滴。将载玻片放入杂交烤箱，在40°C下孵育30分钟。
12. 将玻片浸入无RNase的DI_{H 2}O中，并短暂上下浸泡洗净。用新鲜蒸馏水重复，总共洗两次。

6. RNAscope试剂制备与探针杂交

1. 准备RNAscope HiPlex探针托和HiPlex探针稀释剂，需在烤箱或水浴中加热至40°C10分钟。
2. 短暂地脉冲旋转所有50倍探针枪托。通过用RNAscope探针稀释剂将每个独特靶探针稀释为1倍，制备工作探针混合物。计划每组使用50–100微升探针混合物，使用前通过漩涡充分混合。RNAscope HiPlex协议最多可支持3个周期，每周期4个探针（共12个探针，标记为T1-12）。有关探针设计的指导，请参阅原始发布的RNAscope协议¹⁴。
3. 将RNAscope HiPlex Amp 1–3和HiPlex Fluoro T1-T4试剂置于RT下以达到平衡。
4. 取蛋白酶III处理的切片，将50–100微升探针混合物移液到每个组织切片上。横置于杂交炉中，在40°C下孵育2小时。
5. 将玻片完全浸入1X洗涤缓冲液中2分钟。用新鲜缓冲液重复，总共洗两次。
   暂停点：切片可在RT的5X SSC缓冲区中过夜保存，详见ACD的RNAscope协议。如果使用该暂停点，请注意第二天早上需要在1X洗涤缓冲液中进行两次2分钟的洗涤。

7. 探针放大

注意：在应用载玻片前，确保所有试剂均与RT平衡。

1. 在载玻片中加入1–2滴HiPlex Amp1试剂，并在40°C的杂交炉中孵育30分钟。将玻片完全浸入1X洗涤缓冲液中2分钟。重复这个过程，总共洗两次。
2. 将1–2滴HiPlex Amp2试剂加入载玻片，并在40°C的杂交炉中孵育30分钟。将玻片完全浸入1X洗涤缓冲液中2分钟。重复这个过程，总共洗两次。
3. 在载玻片中加入1–2滴HiPlex Amp3试剂，并在40°C的杂交炉中孵育30分钟。将玻片完全浸入1X洗涤缓冲液中2分钟。重复这个过程，总共洗两次。
4. 将1–2滴HiPlex Fluoro T1-T4试剂加入载玻片，并在40°C的杂交炉中培养15分钟。将玻片完全浸入1X洗涤缓冲液中2分钟。重复这个过程，总共洗两次。
5. 在每个组织切片中加入3–4滴HiPlex DAPI试剂，并在RT下培养1分钟。
6. 用吸水式工作擦拭器将载玻片上的液体吸走，去除DAPI。立即在每个段块中加入100微升水基防衰减安装介质（可与IBEX染色步骤中使用的同一种）。小心地在滑套上放置盖片，尽量减少气泡，让装裱介质干燥15到30分钟。
7. 进行影像检查。
   暂停点：安装载玻片可在4°C的黑暗中保存长达3天，但建议尽快进行，以确保RNA降解最小。

8. 切割荧光团及迭代RNA杂交

1. 要去除玻片的盖子滑套，先用4倍SSC缓冲液浸泡至少30分钟，用RT浸泡。洗一次时，将玻片完全浸入新的4倍SSC缓冲液中，并短暂上下浸泡。
2. 打开一瓶新鲜的切割液，用4倍SSC缓冲液稀释，制成10%的工作高汤。
3. 将载玻片放入湿润的盒子中，加入3–4滴10%切割液。在RT下孵育15分钟，然后完全浸入0.5%PBST中洗涤载玻片2分钟。用新的PBST重复，总共洗2次。
4. 要进行RNAscope面板的第二阶段影像，先将HiPlex Fluoro T5-T8试剂与RT平衡。
5. 打开杂交烤箱，温度设为40°C。
6. 将HiPlex Fluoro T5-T8试剂加入载玻片，并在40°C的杂交烤箱中培养15分钟。将玻片完全浸入1X洗涤缓冲液中2分钟。重复这个过程，总共洗两次。
7. 小心地将多余的液体从载玻片中吸走。立即在每个切片中加入100微升装载介质，并小心地在载玻片上放置盖片。让装裱介质干燥15–30分钟后进行成像。
8. 如适用，使用HiPlex Fluoro T9-T12试剂重复步骤8.1–8.7，共计3个RNAscope周期。请注意，虽然RNAscope HiPlex协议支持3个周期，但该方案蛋白质染色所需的额外时间可能会影响RNA质量。因此，3个周期可能并不总是可行，具体取决于所针对的具体转录本。

9. 图像处理

1. 逐轮处理原始文件，并使用一致参数进行图像处理，包括背景减法设置、平滑滤镜和配准转换类型。通道应以一致的分隔符命名（例如，第一周期：CD45 AF532，其中“：”区分循环与标记/荧光）。
2. 启动 SimpleITK 软件（https://github.com/niaid/sitk-ibex），点击 Imaris 扩展> SimpleITK >使用公共通道仿射注册 z-栈。
3. 从每个复用周期上传一个图像文件，并为所有命名通道输入分隔符（例如“：”）。
4. 选择用于图像定位的通道和所有其他图像将对齐的固定图像。建议使用 DAPI 作为基准标记，尽管所有周期之间任何共同命名通道都可以使用。
5. 点击“注册”，然后“重新采样并保存合并图像”。
6. 继续用你选择的软件进行下游分析。有关图像处理和配准的更多信息，请参阅原始IBEX协议^12,13。

结果

图1：Bex-Plex工作流程概述。
固定冷冻组织切片于镀铬明矾载玻片上，先进行最多3个标准IBEX循环，随后进行最多3个RNAScope HiPlex循环，在60°C下进行初步靶标提取步骤，持续1小时。然后对不同周期的图像进行注册和对齐，使用依据标记（如DAPI）创建多路复用数据集进行后续分析。请点击此处查看该图的放大版本。

我们利用上述方案分析了小鼠胰导管腺癌（PDAC）模型的肿瘤微环境（TME）（见图1）。从Kras^LSL-G12D/+分离出的肿瘤系;Trp...

讨论

Bex-Plex的工作流程将迭代蛋白染色平台IBEX与RNAscope原 位 杂交集成，实现单细胞分辨率下同时检测蛋白质和RNA转录本。该方案的主要目标是提供一种可重复的综合空间分析方法，用于完整组织中蛋白质和RNA表达的综合分析。在同一组织中同时测量蛋白质和RNA表达的能力此前存在技术挑战：高成本、复杂的抗原提取步骤、有限的多重复用能力、分辨率限制（非单细胞）、非线性信号放大，以及用于下游处理的庞大生物信息学流程 ^17,18,19。与现有方法如多重免疫荧光、OPAL/TSA染色和空间转录组学平台相比，Bex-Plex能够实现可重复、定量且高plex的同时检测，同时保持空间上下文和核形态，实现图像准确对齐。此外，Bex-Plex 可以在标准实验室环境中运行，并以单单元分辨率生成数据，处理简便。利用该方案全面理解肿瘤微环境中的细胞间相互作用，对于开发更有效的免疫疗法和改善不同疾病状态的患者结局至关重要。

我们的方法在嵌入OCT的固定组织上进行，遵循标准IBEX工作流程，不作修改...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 ml 微离心管	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 证酒精	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC 缓冲液	Invitrogen	AM9765
24 孔板
Alexa Fluor 488 抗小鼠 CD11b 抗体	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 抗小鼠 CD3e 抗体	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 抗小鼠 Ly6G 抗体	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 抗小鼠 CD68 抗体	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm 固定和渗透溶液	BD	554722
铬铝明胶	Fisher	NC1692262
共聚焦显微镜（例如 Leica Stellaris）
冷冻模具	VWR	25608-922
冷冻切片仪（例如 CryoStar NX50 冷冻切片仪）	Thermofisher Scientific	957100
冷冻切片刀（例如 Leica 低型号一次性刀片 DB80LX）	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
解剖显微镜（例如 Zeiss SteREO Discovery.V8）
解剖工具
干冰
用于切片染色的浸泡罐（例如 Simport Scientific EasyDip 切片染色罐）	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
加热水浴
组织学刷（例如 Ted Pella 骆驼毛刷）	Fisher Scientific	NC2023341
杂交烤箱（例如 HybEZ II 杂交系统）	ACD	321710
图像分析软件（根据选择）
ImmEdge 疏水屏障 PAP 笔	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
锂硼氢化物	STREM Chemicals	93-0397
微量移液管（P-10、P-20、P-200、P-1000）
迷你微离心机（例如 Corning LSE 迷你微离心机）	Corning	6770
小鼠 BD Fc 阻断剂	BD	553142
No 1.5 盖玻片	VWR	48393-241
移液管吸头（P-10、P-20、P-200、P-1000）
RNAscope HiPlex Probe, mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex Probe, mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 试剂盒 v2（包括检测套件、裂解原液、蛋白酶试剂、目标检索试剂和洗涤液）	ACD	324409
RNAscope Protease III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITK 软件: https://github.com/niaid/sitk-ibex
切片染色托盘/湿度箱
Sucrose Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus 显微镜载玻片	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Tween-20，分子生物学级别	Promega	H5152
UltraPure DNase/RNase 无菌水	Fisher Scientific	10977023