自组装类人心类中的缺氧-再氧合损伤模型

摘要

自组装型人类心脏类器官（hCOs）是一种新兴的系统，用于模拟人体心脏发育和疾病。本文提供了通过缺氧再氧化生成和损伤hCO的方法，以及损伤后预期的组织学和功能结果细节。

摘要

如果不快速再造血管，缺血性心脏病会导致心肌细胞不可逆性丧失、瘢痕形成和心功能下降。对缺氧-再氧合损伤建模并评估潜在治疗干预的能力是一个未被满足的需求。人类心脏类器官（hCOs）是一个新兴的模型系统，但由于hCO体积小、需维持培养以及分化效率的差异，起步研究可能具有挑战性。该协议提供了用户友好的指南，用于生成和维护人类iPSC衍生的自组装hCOs;处理和组织学分析hCO的方法;以及一种通过缺氧再氧化损伤hCO的方法，模拟人类缺血/再灌注中所见的纤维化和凋亡。该方案为使用hCO作为缺血再灌注损伤动物模型的补充提供了指导，可用于识别和测试可能促进人类心肌恢复的因素。

引言

缺血性心脏病是全球发病率和死亡率的主要原因之一，仅美国就至少有2050万人受到影响 ^1,2,3。如果没有足够的灌注，长期缺氧会导致心肌细胞（CM）死亡和心肌功能障碍。心肌缺血主要通过经皮干预、溶栓治疗或冠状动脉搭桥移植进行血运重建治疗。然而，血运重建是一把双刃剑，可能通过释放活性氧造成额外伤害 ^4,5。虽然再灌注策略取得了巨大成功，但限制缺血性损伤或再灌注后CM损失的方法仍然难以实现。尽管许多挽救梗塞组织的尝试在缺血再灌注的动物模型中证明有效，但这些疗法在人体试验中大多未能取得显著益处，这也凸显了需要人类模型来评估6,7,8,9,10,11,12的治疗方法。

用于模拟心脏损伤的人类平台包括原发组织和人类诱导多能干细胞（hiPSC）衍生系统，^13,14。由于原发组织受样本可用性限制，hiPSC系统已成为心脏病建模的主导人类平台，其遗传可控性和可扩展性优势显著（^{15,16,17,18,19}）。传统的二维高多中性硬化细胞衍生心肌细胞（hiPSC-CM）培养受限于生成的中古细胞尚未成熟、缺乏复杂组织结构，以及无法复制人类心脏中存在的完整细胞多样性^15,20。为解决这些不足，工程化三维心脏组织（EHT）越来越被采用，^{编号为20,21,22,23,24,25,26}。EHT方法包括将预分化的心脏细胞混合到球状体^中，或将分化的心脏细胞播种到支架或模具中（21,22,27）。尽管EHT能够更好地模拟异型细胞相互作用，且相对成熟度高于二维培养，但目前对定制支架或生物反应器的需求限制了其可扩展性 21,27,28。

自组装心脏类器官（hCOs），或称心状体，是一种新型且强大的体外人体模型系统，20,25,26,29。hCO有几个优点。首先，它们可以包含多种细胞类型，包括内皮细胞、成纤维细胞和心外膜细胞，无需多重专门分化方案（26,29,30）。其次，它们的大部分分化发生在三维懸浮培养中，无需专门的模具或组织基质25,26,29,30。最后，hCO具有典型的球形形态，带有中央腔，便于形态学分析。因此，hCO具有类似于二维培养系统的可扩展性，同时保留了部分EHTs的组织复杂性。hCO已被用于药物毒性测试、患者特异性疾病建模，以及心脏发育的某些方面建模 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.虽然前景看好，但HCO相比EHT存在若干局限性，包括无法直接测量力输出。此外，描述的hCO模型中没有原生免疫细胞群体，尽管可以将巨噬细胞填充到hCO中。尽管如此，hCOs仍是一个新兴且快速演变的人类模型系统，编号20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39。

迄今为止，用hCO模拟心脏损伤的做法尚有限。已经描述了冷冻损伤模型，但损伤变化很大，且需要单独损伤hCOs限制了可^扩展性。本文描述了一种用户友好的方案，用于生成和损伤缺氧再氧化（H/R）损伤的自组装型hCOs。与其他生成hCO的方案相比，该方案采用简化的分化介质，并采用了Hofbauer等人描述的2D-3D中胚层分化策略，²⁹页。H/R损伤的治疗方案可以在hCO开始跳动后进行，通常发生在分化第8天（D8）到D11左右。H/R持续时间可调节在6小时至24小时之间，以达到预期的损伤水平，范围从轻微到接近完全的CM丧失不等。此外，hCOs通常在H/R损伤后会形成含有Vimentin⁺ 细胞的胶原核心，这种核心的严重程度也会随H/R持续时间增加而变化。这一高通量、可扩展的H/R损伤hCO模型有望满足人类模型开发和测试促进CM恢复或损伤再生的新治疗途径的需求。

方案

所有处理人类细胞系的程序都应遵循当地生物安全规范。所有实验均使用iPSC细胞系DU11进行，该细胞系由杜克大学iPSC核心设施从健康新生儿男性成纤维细胞中提取。

1. hCO的生成

注意：本节描述了从iPSCs生成hCO的标准协议（见图1）。该方案中的所有步骤都应在层流罩内进行，以确保无菌。有关分化培养基的配方，请参见 表1 。

一天	种群集中	工作方向	稀释因子	基础媒体
D0	10毫米CHIR99021	10微米CHIR99021	1:1000	RPMI-1640,2% B27，去胰岛素
	100 mg/mL 抗坏血酸	50 μg/mL 抗坏血酸	1:2000
	10 mg/mL 活性蛋白A	60 ng/mL 活性素A	1:167
D1	5 mM IWP2	5 μM IWP2	1:1000	RPMI-1640,2% B27，去胰岛素
	100 mg/mL 抗坏血酸	50 μg/mL 抗坏血酸	1:2000
D2	5 mM IWP2	5 μM IWP2	1:1000	RPMI-1640,2% B27，去胰岛素
	100 mg/mL 抗坏血酸	50 μg/mL 抗坏血酸	1:2000
	10 mM Thiazovivin	2 μM 噻佐维文	1:5000
D3	5 mM IWP2	5 μM IWP2	1:1000	RPMI-1640,2% B27，去胰岛素
	100 mg/mL 抗坏血酸	50 μg/mL 抗坏血酸	1:2000
D4	5mM IWP2	5 μM IWP2	1:1000	RPMI-1640,2% B27，去胰岛素
D6+	无	无		RPMI-1640,2% B27加胰岛素

表1：差异化介质表。 每个分化因子的库存浓度、工作浓度和稀释因子，直到第0-6天。所有工作溶液在进食时都要新鲜准备。

图1：一氧化碳微分示意图。请点击此处查看该图的更大版本。

1. iPSC维护
   1. 在12孔板的每个孔底部完全覆盖基底膜基质，比例为1：100，并稀释于冷DMEM/F12介质中。将处理过的平板在37°C下孵育1小时以促进聚合。如果不立即使用，板材可以用薄膜密封，保存在4°C下保存最长2周，并在使用前至少在37°C下孵育60分钟。
2. 分化第3天（D-3）：为后续分化进行iPSC的镀层
   1. 按照步骤1.1.1准备基底膜基质涂层板。
   2. 从iPSC培养中抽取维持培养基，加入足够的细胞脱离液以完全覆盖细胞（12孔板每孔约500微升，6孔板每孔1毫升）。在37°C下孵育5分钟。
   3. 向每个孔加入等量的iPSC维持培养基，轻轻敲击板以帮助细胞脱离。将板子倾斜向自己，轻轻上下移液器在孔底移动，进一步分离粘附细胞，次数不超过3次。用移液管将细胞悬浮液移至15毫升锥形管上。
   4. 颗粒细胞通过300 x g 离心法在室温下，在摆动桶离心机中进行3分钟。抽取上清液，并轻轻将细胞重新悬浮于1毫升iPSC维持培养基中。
   5. 将10微升的细胞悬浮液移至新的1.5毫升微离心管。加入10微升的Trypan Blue，并用移液器混合。将10微升iPSC/Trypan蓝混合物加入血细胞计，计数活细胞。
   6. 将细胞悬浮液稀释至iPSC维持培养基中10万至20万细胞/毫升的最终浓度，使用ROCKi。在涂有基底膜基质的12孔板的每个孔中加入1毫升细胞悬浮液。
      注意：分化前的板状密度取决于特定细胞系的生长速率。每条iPSC线可能需要调整电镀密度。根据品牌和配方不同，ROCKi的浓度可能需要调整。
3. 区分D-2：交换介质以去除ROCKi
   1. 更换培养基为1毫升新鲜的iPSC维持培养基，不含ROCKi。细胞应开始形成小型菌落。蜂群应呈现平坦的外观（见图2A）。如果细胞看起来像鹅卵石、细长或细长，这是自发分化的迹象，分化效率可能会受到影响。
4. 分化D-1：继续培养细胞，无需治疗。
5. 分化D0：分化开始及中胚层诱导
   1. 使用显微镜检查细胞密度，确保分化时的密度达到70%-90%的汇合度（见图2B）。如果亚汇聚，给细胞喂食iPSC维持培养基，等待24小时。如果单元格过于紧密，则像步骤1.2那样拆分单元格
   2. 制备每12孔平板12毫升D0中胚层诱导培养基（10微米CHIR99021,50 μg/mL抗坏血酸，60 ng/mL活性蛋白A，RPMI-1640，配合2%B27补充剂（去胰岛素，RB-））。
   3. 移除现有培养基，替换为每孔1毫升D0中胚层诱导培养基。请注意媒体交流的时间。
6. 区分D1：心脏中胚层特征
   1. 加入D0中胚层诱导培养基后正好24小时，更换为D1心脏中胚层指定培养基（5 μM IWP2,50 μg/mL Ascorbic acid in RB）。
7. 区分D2：hCO的形成
   1. 加入足够的细胞解离试剂覆盖细胞，并在37°C下培养5分钟（见图2C）。向每个孔加入等量的D2心脏中胚层培养基，轻柔地上下移液以释放附着细胞。将细胞悬浮液转移到15毫升锥形管上。
   2. 颗粒细胞通过300 x g 离心，室温下3分钟。再悬浮于1毫升D2心脏中胚层规格培养基（5 μM IWP2,50 μg/mL抗坏血酸在RB-中）。
   3. 取10微升细胞悬浮液，再加入10微升的锥蓝。用任何偏好的方法计数细胞。将细胞稀释至100,000细胞/mL，置于D2心脏中胚层规格培养基中，加入2微米噻唑维文。每块96孔超低附着板使用10毫升细胞悬浮液。
   4. 将细胞悬浮液转移到适当大小的试剂储液槽，并使用多通道移液器向超低连接的96孔板的每个孔注入100微升，最终浓度为每孔10,000个细胞。
   5. 为了在悬浮培养中诱导hCO的形成，需在室温下以500 x g 离心机离心5分钟。离心后，会形成一大团细胞（图2D）——如果该颗粒未被限制，则重复离心。
      注意：并非所有细胞都会被hCO纳入，hCO会呈现为有限的细胞颗粒，单个细胞在明场显微镜下可见。环绕hCO的板中有一些单细胞碎片是正常的。
8. 区分D3：添加介质以稀释ROCKi
   1. 每块平板准备10毫升D3培养基（5微米IWP2,50 μg/mL抗坏血酸在RB-中）。使用多通道移液器，在每个孔中加入100微升D3培养基，且不去除任何培养基。
      注意：此阶段，hCO已凝聚为深色且界限明显的球体。单个单元格将不可见（图2E）。
9. 区分 D4：向 D4 媒体交换
   1. 去除100微升D3培养基，替换为100微升D4培养基（5微米IWP2在RB-中）。为降低吸入风险，将多通道移液器倾斜至约45°角，并以相对于侧壁约90°角握持多通道移液器。将多通道移液器牢牢放在井壁上，缓慢抽取100微升培养基，间歇性检查移液器尖端是否有吸入的hCO。
      注意：hCOs处于悬浮培养中，培养基移除时吸入hCO很常见。为降低吸入风险，将多通道移液器倾斜至约45°角，并以约90°角握住多通道移液器。将多通道移液器牢牢放在孔侧壁上，缓慢抽取100微升培养基，间歇性检查移液器尖端是否有吸入的hCO。
   2. 用100微升D4培养基替换。
10. 区分D6：一氧化碳维持介质
    1. 去除100微升D4培养基，替换为100微升D6+培养基（RPMI-1640加2%B27补充剂RB+）。
11. 微分 D8
    1. 继续每两天更换培养基，去除100微升，换上100微升新鲜D6+培养基。如果成功分化，hCO应增大，保持光滑边缘，并在D6-11附近开始跳动（见图2F）。hCO仍会呈现为深色、边界清晰的球状体，单个细胞不会被看见。

图2：hCO分化时间线。 类器官分化时间线。（A）分化开始前1天的iPSC菌落（D-1）。注意明显的平坦群落。（B）分化开始当天的iPSCs（D0）在~90%的汇聚度下。（C） 类器官在96孔超低附着板中，类器官形成后立即在D2分化阶段。箭头表示针状IWP2晶体的例子。（D）分化D3的类器官。注意由于细胞间连接形成导致的类器官紧缩显著;此阶段有一些未掺入的细胞碎片是正常的。（E）分化D10的类器官。（F） 箭头表示iPSC菌落，细胞细长，呈鹅卵石状，可能存在自发分化。比例尺 = 1000微米（面板A-E），比例尺条=400微米（F面板）。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 收集和固定hCO以进行免疫染色

1. 使用1000微升移液管，切掉吸头，将hCO转移到1.7 mL微离心管。所有hCO转移完毕后，等待hCO沉入管底，轻柔地去除多余介质。用PBS洗涤hCO一次，等待几秒钟hCO沉入管底，轻柔地去除多余的PBS。
2. 用4% PFA固定hCOs，在室温下30分钟。
   注意：某些抗体可能需要丙酮或甲醇固定以达到最佳表现。请参阅制造商指南。

3. 全装免疫染色

1. 将所需数量的固定hCO转移到1.7 mL微离心管上。去除固定液，用含0.1%Tween-20（PBS-T）的PBS洗涤。
   1. 洗HCO时，尽量去除多余的固定剂。注意不要扰动管底的hCOs。加入~1毫升PBS-T，等待几秒钟，等hCO沉到管底后再进行下一步。
2. 将一级抗体稀释至染色溶液中的所需浓度（10%新生儿犊牛血清，1%DMSO浸泡在0.1%PBS-T中）。每根微离心管加入50-100微升的初级抗体溶液（或足够覆盖每管内所有hCO的体积）。
3. 在摇摇器/摇晃器下，4°C下孵育24小时。去除多余的一级抗体，然后在室温下用PBS-T洗涤三次，每次1小时。在PBS-T中以4°C进行最后清洗，确保去除多余抗体。
4. 将二级抗体稀释至所需浓度，并在每个微离心管中加入50-100微升抗体溶液（或足够覆盖每管所有hCO的体积）。
5. 将hCO与二级抗体一起在4°C的摇晃平台上培养24小时。去除多余的二级抗体，然后在室温下用PBS-T洗三次，每次1小时。在PBS-T中以4°C进行最后一次清洗，确保去除所有多余抗体。
6. 对于全装成像，使用1000微升移液器，且切断尖端，将hCO转移到带正电的玻璃玻片上。去除多余的PBS-T，滴几滴装载介质覆盖hCOs。小心放置盖片以压平hCOs。
   注意：为了保持hCO的三维结构，使用橡胶垫圈或双面胶带绕过滑套边缘，以提高盖滑的高度。使用净化安装介质有助于改善hCO成像，尤其是在hCO未被压平的情况下。

4. 剖面与嵌入

1. 固定后，将hCO浸泡在30%蔗糖中，4°C过夜以实现低温保护。使用1000微升移液器，带截头，将所需数量的hCO转移到12毫米×12毫米的塑料模具中。小心清除多余的蔗糖溶液，注意不要吸入hCOs。
   注意：转移前，最好在移液器尖端上下移30%蔗糖，以防止hCO粘附在尖端侧面。
2. 加一点OCT，刚好覆盖到hCO的浓度。用细镊子或移液器尖端轻柔地将HCO重新定位于OCT，避免hCO聚集，也没有hCO靠近模具边缘。确保所有hCO尽可能靠近模具底部，以最大化单次冷冻切割中hCO的数量。
3. 将这层OCT冷冻，方法是将模具放入泡沫塑料冷藏箱中，底部铺上一层干冰。等几分钟让OCT硬化，然后把模具从干冰移到工作台上。继续添加OCT，直到模具填满。等OCT第一层完全融化后再换回干冰。
4. 冷冻嵌入的hCO在-80°C下保存，直到准备冷冻切割。
5. 准备切片时，尽量将hCO块对齐，然后开始修剪块体。定期将一段切片放在带电滑台上，目视检查每个切片是否有hCO值。当hCO被可视化时，改为6微米切片。
   注意：嵌合和切片过程中hCO的损失率至少为10%。请做好相应的规划。

5. TUNEL与免疫染色组织切片

1. 用宫颈抹片在需要染色的组织切片周围画出疏水边框。在PBS 0.1% Tween（PBS-T）中洗一次以溶解OCT。
2. 在室温下添加阻断缓冲液（10%新生儿小牛血清，1%DMSO，浸泡PBS-T）1小时。
3. 准备初级抗体溶液。从制造商推荐的免疫荧光浓度开始，但浓度可能需要通过经验方法调节。
   注意：或者，也可以按照制造商的规定在此时进行TUNEL染色。
4. 取下载玻片上的阻挡缓冲液。添加足够的初级抗体溶液覆盖hCO切片。在4°C下培养一级抗体过夜，或在37°C培养3小时。 在装有PBS-T的科普林罐中，室温下洗3次，每次5分钟。
5. 在阻断缓冲液中制备二级抗体染色溶液，包括DAPI或其他泛核标记。添加足够的二级抗体染色液覆盖hCO切片。在室温下，避光孵育1小时。
6. 在室温下，用装满PBS-T的Coplin罐洗3次，每次5分钟。用带有所需安装介质的盖片安装。

6. 通过CardioCount定量核共定位

注意：CardioCount是一种基于深度学习的方法，用于从显微镜图像中评分CM核⁴⁰。CardioCount最初为评估宫颈粘液循环而开发，对多种核染色（包括TUNEL⁴⁰）表现良好。

1. 要使用 CardioCount，请从 GitHub 下载 CardioCount 包或导入到 Google Colab（https://github.com/karraresearchgroup/CardioCount.git、https://drive.google.com/file/d/13iwp9JoHPhs2ONSFkZTGxbEXCGwBFVYx/、https://drive.google.com/drive/folders/1-f9h7MvCBsiCngJnV8-f_lplAJpUeeE3）。CardioCount 版本 1 运行在 Python 3 环境上。
2. 导出图像以单独的512 x 512像素.tif文件形式进行量化，红色通道为组阻核标记，蓝色为一般核标记，绿色为循环核标记（如Ki67）或凋亡标记（如TUNEL）。在 Google Drive 创建一个父文件夹用于这个实验，并将合并后的 tiffs 上传为子文件夹。
   注：CardioCount 的训练对象是填充核的核染色。更为斑点的骑行标志，如Aurora B或PH3，可能与CardioCount不兼容。
3. 在Google CoLab中打开CardioCount笔记本。运行 Cell 1.1 以检查图形处理单元（GPU）的访问权限。运行 Cell 1.2 来连接 CoLab Notebook 和 Google Drive。
4. 运行Cell 1.3，在Google Colab中加载CardioCount和依赖。编辑kfile，读取下载时保存PRODUCTION_LVADMLPaper_Colab_Libraries文件夹的路径名。
5. 在 Cell 2.0 中，编辑 base_folder 读取路径名到包含图像子文件夹的父文件夹。运行Cell 2.0，将此文件夹链接到CoLab。
6. 在单元格2.1.1中，编辑orig_image_folder以匹配包含分析图片的文件夹名称。编辑channel_to_remove读为绿色，编辑new_image_folder将为base_folder下的子文件夹命名，所有移除绿色通道的图片（红/蓝）将被保存。重复这一步骤以移除红色通道，确保编辑new_image_folder以区分包含移除红色通道图像的子文件夹（绿色/蓝色）。
7. 在单元格2.1.2中，红蓝图像裁剪为512 x 512。确保uncropped_image_folder与第6.6步创建的new_image_folder名称相符。对于红蓝图像。请命名destination_image_folder以指定裁剪后的子文件夹，红蓝图片将被保存。重复这个步骤，裁剪绿色/蓝色图像。最后，重复这一步骤，裁剪出原有的三通道合并tiff，存放在base_folder中。
8. 运行Cell 2.2生成概率映射。名称data_specific_folder从单元格2.1.2生成的红蓝和绿蓝图像的名称destination_image_folder。对于model_dir，输入包含分割模型的文件夹的文件路径。要分割红核，使用模型erg_rb_opt，输入200表示历元。将probmap_directory_name重命名为红色/蓝色概率地图的存放文件夹。对绿色/蓝色图像重复这一步骤。要分割绿色核，使用模型edu_mouse_bg_opt，输入100表示历元。
9. 在单元2.3.1中，将基于第6.8步生成的概率映射创建对象映射。该 input_folder 将以单元 2.1.2 中包含红蓝概率图图像的单元 2.1.2 的 destination_image_folder命名。请指定阈值红蓝图像将存储的output_folder。设定核分段置信度阈值（范围0.0-1.0）。运行单元2.3.1。对绿色/蓝色图像重复这一步骤。
   注意：关于核的置信度阈值将依赖于数据集。从0.9的阈值开始，如果太宽松，调整更高，过于严格则降低，基于随机检查概率映射。
10. 在单元 2.3.2 中，步骤 6.10 生成的对象映射单元格数量将被计数并导出为 .csv 文件。该count_folder将以2.3.1单元的存储output_folder命名，该单元保存了阈值红蓝图像。要排除接触图像边界的物体，确保ignore_border_cells读取为真。将csv_path重命名为存储所有子文件夹的路径名base_folder。编辑csv名称以反映红色/蓝色物体的计数。对蓝色/绿色图像重复这一步骤。
11. 在2.4单元中，将计数绿色/红色双阳核。将img_folder重命名为第6.8步生成的包含裁剪三通道图像的子文件夹名称。将childcell_folder重命名为存储阈值红蓝图像的2.3.1单元的output_folder。将parentcell_folder重命名为存储在阈值绿/蓝图像的单元2.3.1的那个output_folder。将dest_folder重命名为将保存双正对象映射的文件夹。重命名csv_path以指定路径名和文件名作为所有子文件夹存储的base_folder，并编辑csv名称以反映双正对象的计数。
12. 通过比较每张图像产生的红、绿和双正计数与原始图像，验证切分的准确性。
    1. 如果CardioCount持续高估图像中核数相对于盲审者计数的数量，则重复第6.9步，置信度阈值提高，重复第6.10-6.11步。如果CardioCount低估了图像中核的数量，相对于盲法审核者会计数的数量，则重复第6.9步，置信度阈值降低，重复第6.10-6.11步。
13. 将红核、绿核和双正核的每个hCO计数加总。计算每个类器官的循环细胞百分比为（双正核 / 总红色 CM 细胞核）乘以100。

7. 缺氧-再氧化损伤

1. 制备缺氧培养基（119 mM NaCl，12 mM KCl，1.2 mM NaH₂PO_4,1.3 mM NaH 2,0.5 mM MgCl_2,0.9 mM CaCl_2,20 mM 乳酸钠，5 mM HEPES，pH = 6.4）⁵。
2. 向细胞培养瓶中，每块96孔hCO板将5毫升缺氧培养基转移至细胞培养瓶。将细胞培养瓶放入缺氧舱，用缺氧气体（5% CO 2,95%_N2）冲洗3分钟。在37°C下潜伏至少1小时后开始缺氧。
3. 去除所有 hCOs 中的培养基。首先用多通道移液器从所有孔中去除约150微升。然后，使用200微升移液器小心地从单个孔中移除剩余培养基，同时不扰动hCOs。
   注意：从所有井中移除所有滤质对于实现可重复的损伤至关重要。
4. 每个井加入50微升缺氧培养基。将hCO板放入缺氧舱，用缺氧气体（5% CO 2,95%_N2）冲洗3分钟。将缺氧舱放入保温箱，温度为37°C，浸泡6小时。
5. 要启动再氧化，先从缺氧舱中取出hCOs，并喂入150微升预热的RB+培养基。在进行下游测定前，至少允许3小时在37°C下进行再氧化。

8. 乳酸脱氢酶释放测定法

1. 在重新灌注开始后，于预期时间点从受损和未受损的hCO阱中采集20微升培养基。将1：10稀释于180微升LDH储存缓冲液（200 mM Tris-HCl（pH 7.3），10%甘油，1%BSA）。在-20°C下保存，直到准备进行检测。采集前上下移液器多次搅拌培养基
2. 解冻了冷冻的介质。每个培养基样品在黑壁透明底96孔板的一个孔中加入45微升LDH储存缓冲液。每孔加入5微升1：10稀释培养基，最终稀释为1：100。通过混合50微升LDH检测酶混合物和0.25微升还原酶底物，制备LDH检测试剂，用于每个待测样品。
3. 每孔含有1：100稀释培养基，加入50微升LDH检测试剂。在室温下、避免光照下孵育60分钟。在兼容的板读器上进行生物发光信号的检测。

9. 钙成像

1. 制备含有酚红的RPMI-1640、0.04%聚状酸钙和5微米Cal520-AM的钙染料染色溶液。保护样本免受光照。
2. 从每个用于钙成像的井中去除100微升培养基。加入100微升钙染料染色液，在37°C下、遮光下培养30分钟。
3. 从每个孔中去除100微升钙染料培养基，替换为100微升无酚类红的RPMI-1640。在37°C下孵育30分钟至1小时，以让染料冲洗。
4. 利用具备连续成像/流控功能的显微镜，将96孔超低连接板置于工作位置。用10倍物镜，识别hCO的基底，注意Cal520瞬态。
5. 在室温下录制钙瞬变的30秒记录。如果使用共焦显微镜，则无法完整成像整个hCO的影像。选择靠近hCO底部的焦平面，在钙瞬变期间细胞轮廓可见。

10. 钙瞬态分析（见图3）

1. 钙瞬态分析可以通过多种峰值分析软件进行。以下是使用 Spiky ImageJ 插件⁴¹ （https://pccv.univ-tours.fr/ImageJ/Spiky/）进行分析的说明。
2. 在每个hCO的可见单元中，向ROI管理器添加五个2×2像素的兴趣区域（ROI）。注意不要将ROI与细胞核或细胞边界重叠，因为hCO的运动会影响瞬态分析。
3. 在分析>集测量值中，选择 平均灰度强度。在ROI管理器中，选择 多测量 以捕捉所有ROI和所有帧的均灰度。
4. 保存一个包含所有投资回报率平均灰度强度的.csv文件。保存每张图片的所有投资回报率位置以备后用。
5. 在新电子表格中，添加一列时间。计算每帧的时间，方法是将30秒除以总帧数，再乘以帧数。请保存为编辑后的.csv。
6. 在斐济打开编辑后的.csv文件，并打开Spiky插件。在分析选项中，选择所需的分析参数。
7. X轴显示情节时间，Y轴显示ROI #1的平均灰色强度。选择 分析峰值，并确认基线、峰值起止和峰值幅度的正确注释。如果识别到错误数量的峰值，请在分析选项中更改参数，包括基线的最小峰值幅度，并从峰值阈值开始，直到峰值识别成功。
8. 保存所有中间文件。每分钟拍数（bpm）可以通过将60除以每个ROI的高峰到峰值间隔平均来计算。
9. 对所有每一氧化碳的投资回报率重复上述分析。

图3：钙瞬态分析。 （A）红色框指示打开下拉菜单的按钮，用于选择分析参数。（B）红色框表示用于绘制代表性未受伤hCO中ROI中时间（s）与平均灰度强度的关系。（C） 红色框表示选择峰值分析的按钮。（D）代表性未受损hCO的钙瞬态痕迹和峰值分析。红色三角形表示峰值最大点，粉色方块表示峰值上游和下坡的最大坡度，绿色方框表示峰值起点，蓝色方框表示基线。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

按照上述方案应产生形成良好的hCO细胞，并在分化第7-12天（D7-12）之间开始跳动。随着hCO在第25天以后成熟，自发性宫缩可能不再可见，除非有电起搏。H/R损伤可以在hCO开始跳动后的任何时间进行——我们通常对15天（D15）或更晚的hCO进行损伤。

伤情确认
与人类心肌梗死类似，hCOs的H/R损伤会导致细胞死亡。临床上，可以通过测量细胞死亡释放到循环中的蛋白质（如LDH、心肌钙蛋白、肌红蛋白或肌酸激酶）来评估心肌损伤的程度。同样，LDH的释放也可以在H/R损伤后hCO培养基中轻松测量。 图4A 展示了利用商业化的微板生物发光测定法，在H/R损伤后24小时内D21-D28 hCO释放LDH的代表性结果。在缺氧6小时和再灌注24小时后，细胞外LDH活性预期显著增加，相比未受损的hCOs（1518±454.9 RLU 对 8542 ± 4719 RLU，平均 ± s.d.，p = 0.0002，双侧t检验）。

讨论

本文呈现了通过H/R生成和损伤自组装hCO的逐步方案。缺血性心脏病的特征是病理生理重塑，包括心肌细胞死亡、纤维化重塑、电功能障碍和功能衰退。这些扰动在hCO模型系统中可见，包括TUNEL⁺ CM增加、LDH释放增加、Vimentin⁺ 组织面积增加以及钙处理改变导致功能同步丧失。值得注意的是，尽管hCO相对不成熟，但它们并未显示出组织再生的证据。因此，该H/R模型可作为测试再生干预的实用平台，无需长时间的成熟程序，同时也用于心脏保护性治疗的筛选。

存在许多生成hCO的协议，该协议基于Hofbauer等人于2021年首次描述的二维-三维微分^方法。先前使用自组装hCO的损伤模型采用了冷冻损伤，即需要用小型探针²⁹手动损伤单个hCOs。虽然冷冻损伤会导致显著的局部损伤，类似于人类心肌梗死，但在大量hCO中实现一致且...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase溶液	西格玛-奥尔德里奇	A6964-500ML
抗心脏肌钙蛋白T抗体	阿布卡姆	EPR20266
B-27补充剂（50X），无血清	吉布科	17504044
B-27补充剂，不含胰岛素	吉布科	A1895602
BioTek Synergy Neo2 板读器	生物科技
Cal-520，调幅	AAT生物探索	21131
CardioCount V1	卡拉实验室	PMID：38984052
细胞系（<人>智人，男性）- DU11 iPSC系	杜克大学干细胞核心
带电显微镜载玻片，白色玻璃	VWR	89500-496
CHIR 99021	托克里斯	4423
克隆R	干细胞技术	5888
康宁96孔透明超低附着微型板	费舍尔	7007
一次性输液槽	VWR	89094-678
DMEM/F-12，HEPES	吉布科	11330057
EVOS荧光显微镜	EVOS
Geltrex低生长因子基底膜基质，无LDEV，干细胞认证	吉布科	A1413302
人类活素 一种重组蛋白	PEPROTECH 公司/生命科技	120-14E-50UG
IWP-2	干细胞技术	72124
L-抗坏血酸（结晶/认证ACS）	费舍尔科学	A61-100
小鼠抗维门素	DSHB	AMF-17b
mTeSR Plus	干细胞技术	100-0276
多孔细胞培养板等;12口井	VWR	10062-894
普鲁罗尼克F-127	西格玛-奥尔德里奇	P2443
ReLeSR	干细胞技术	100-0483
RPMI 1640 中型	吉布科	11875119
RPMI 1640 中等，无酚红	吉布科	11835-030
噻佐维文	干细胞技术	72254
组织技术O.C.T.复合体	樱花美利坚美国公司（VWR）	25608-930
蔡司旋转盘共焦点显微镜	蔡司