利用人类天冬酰胺合成酶从冷冻电磁图谱可视化蛋白质构象动态的工作流程

Summary

该协议概述了如何在CryoSPARC中进行三维变异分析（3DVA）以及在Phenix中进行变异细化，以分析冷冻电子显微数据中的构象异质性。以人类天冬酰胺合成酶为例，阐述了如何生成变异图、可视化主成分以及优化相应的原子模型。

Abstract

本文介绍了一套综合工作流程，用于利用CryoSPARC中的三维变异分析（3DVA）和Phenix中的变异细化，分析单颗粒低温电子显微镜（cryo-EM）数据中的构象异质性。该协议描述了如何计算从粒子图像得出的主成分的变异图，可视化结构变化的主要模式，并针对单个变异系细化相应的原子模型集合。最终输出包括一系列三维变异图、代表离散构象态的精细多模型原子结构，以及适合比较结构分析和电影生成的可视化文件。该工作流程广泛适用于分辨率范围内（通常为 ~6.0 Å）的低温电磁重建，在主链和侧链层面可以有意义地解释构象异质性。它特别适合捕捉连续域运动、铰链弯曲运动以及协调的局部重排，这些仅靠离散分类难以解决。变异图谱与精细模型集合的结合，使构象极端的结构性直接比较成为可能，支持如均方根涨落（RMSF）计算等定量分析，并为动态结构特征与生化或功能假设的联系提供了框架。以人类天冬氨酸合成酶（ASNS）为例，展示该工作流程的实际应用。

Introduction

表征大分子结构中的构象异质性是单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）分析中日益重要的方面。该协议的目标是提供一个实用的工作流程，直接从冷冻电磁数据集中提取、可视化和精炼结构变异的主导模式，方法是利用CryoSPARC¹ 中的三维变异分析（3DVA）结合Phenix²中的变异细化。本文旨在指导读者判断这种计算方法是否适合其数据，并理解工作流程产生的输出类型。

传统实验技术（如氢氘交换、核磁共振光谱、质谱）提供了关于蛋白质运动^3、4、5 的宝贵信息，但通常受限于分子尺寸、样品需求或实验复杂性。冷冻电磁技术的进步使得对大型和异质系统的结构测定实现了高分辨率，从而能够分析粒子群体内的构象变异性。三维变异分析（3DVA）在CryoSPARC¹中实现，将低温电磁粒子数据集分解为描述主导、连续结构变异模式的主成分。结合Phenix²的变异细化，该方法可生成对应各主成分离散位置的原子模型，从而实现基于实验数据的替代构象的可视化与比较。

该协议最适合以近原子至中等分辨率（通常为~2-6 Å）重建的低温电磁数据集。在更高分辨率下，工作流程可以捕捉主链重排和有限的侧链变异⁶，而在较低分辨率下，更适合识别域级或二级结构的移动 ^2,7。该方法适合捕捉数据集中广泛存在的主导、连续运动模式，如铰链运动、区域呼吸或区域或子单元间的协调重排。足够的粒子数和角度覆盖至关重要，在侧链位置模糊的灵活或弱分辨率区域，解释可能受到限制。与聚焦分类⁸或广泛子分类策略相比，三维变异性细化工作流程将构象异质性表现为连续轨迹，而非离散类别。这使得该方法在对酶、分子机器和多域复合物的探索性分析中尤为有用，这些分析通常需要采样多种构象。

以人类天冬酰胺合成酶（ASNS）作为示例，展示该方案的实施情况。ASNS是一种谷氨酰胺依赖性氨转移酶，由两个功能结构域通过分子内氨隧道^9,10连接组成。以往研究表明，涉及Arg-142等残基的构象变化有助于该隧道⁶的调制。在本文中，ASNS仅作为一个代表性系统，展示3DVA和变异细化如何生成变异图、精细化原子模型系综和可视化。详细的机制解释则留待结果和讨论部分进行。尽管分子动力学（MD）模拟常作为探索构象景观的补充方法（^11,12），但本方案并非强制要求MD。与MD模拟的比较可以作为可选的下游分析进行，但此处描述的工作流程（图1）专注于从冷冻电磁数据中提取和可视化构象异质性。

图1。工作流程概述。 从单粒子数据重建共识冷冻电磁图谱，并进行三维变异分析（3DVA）以生成主成分分布的变异图。变异细化（Phenix.varref）利用共识原子模型生成相应的原子模型，用于可视化和比较。 请点击此处查看该图的放大版本。

Protocol

1. 数据准备

1. 共识EM映射的生成
   1. 使用单粒子低温电子显微镜（cryo-EM）来确定大分子复合物的共识三维结构。
   2. 在低温网格上进行玻璃化样品，并使用配备直接电子探测器的高压透射电子显微镜进行成像。
   3. 处理收集到的影片以修正光束引起的运动，估算成像参数，并选择粒子图像。
   4. 对粒子进行迭代分类和细化，生成共识电磁图谱。
   5. 使用CryoSPARC（v4或更高版本）进行数据处理¹³，因为将实现三维变异分析（3DVA）。
2. 生成共识模型
   1. 建立一个原子模型，并根据共识地图进行细化。使用标准验证精炼模型质量
      注意：对于ASNS，结构是通过基于模板的粒子选择策略确定的。使用了来自DON修饰人类ASNS（PDB 6GQ3）⁹的X射线结构模板，高效地在CryoSPARC¹³中筛选高质量颗粒。这些粒子经历了迭代的二维分类、 从头重建 以及异质且非均匀的细化，并施加了C2对称性，最终得到一个3.5 Å的共识映射。原子模型通过将晶体结构⁹ 导入电磁图谱生成，随后在Phenix^14、15 中进行实空间细化，在Coot¹⁶中手动调整，最终^生成了如6所述的共识ASNS结构。

2. 执行三维变异分析（3DVA）

1. 用粒子堆栈和遮罩（不是最终精炼的贴图）来做最终精炼
   注意：通常，非均匀细化作业的结果会用于3DVA。
2. 在CryoSPARC中创建一个3D变异性工作。输入粒子栈和非均匀细化作业的遮罩。
3. 设置 需求解的模式数量：主成分（PC）数量为5。
   注意：由于大分子结构存在于三维空间中，通常至少需要三个PC来描述它们的主要空间运动模式。为确保不被忽视额外、可能较小但功能相关的构象变异，又纳入了两具PC模型。
4. 将 滤波器分辨率 设置为4.0 Å， 高通分辨率 设置为20。其他参数保持默认。开始工作吧。
   注意：“滤波器分辨率”为4.0 Å，旨在匹配数据集整体质量，同时避免对高频噪声过拟合。由于最终共识图确定分辨率为3.5 Å，应用略低滤波器分辨率（4.0 Å）确保变异分析聚焦于真实结构运动，而非分辨率极限附近的噪声。
5. 输出为一组变异体积（图2A）

3. 执行三维变异显示

1. 在CryoSPARC中创建一个3D变异显示任务，以可视化3DVA识别的连续构象变化。
2. 输入粒子堆栈和3DVA作业生成的变量体积。
3. 选择 “简单” 作为输出模式（见下文）。
4. 将 滤波器分辨率 设为4.0，高 通分辨率 设为20。其他参数保持默认值。开始工作吧。
5. 获得20个变异图作为结果（帧0到19），对应5个主成分（PC），范围从0到4（图2B）
   注意：3D 变异显示程序中的“简单模式”提供了沿每个主要组分构象变化的直观可视化。该模式在3DVA识别的极端态之间生成线性轨迹，从而能够清晰、直接地解释粒子群体中的运动。

4. 电影数据准备与Phenix三维变量细化

1. 下载3DVA变异图：从CryoSPARC下载包含PC0-4变异图的压缩包（共五个压缩包）。
2. 组织目录：创建一个父文件夹（例如 3DVA/）。在里面，为每个主要组件（comp0， comp1， comp2， comp3， comp4）创建一个子文件夹。
3. 把每个压缩包移到对应的文件夹里，然后解压内容。
4. 确认每个文件夹包含20个变异映射（帧0-19），并对comp1-comp4重复此过程。
   注意：为每个主要组件维护独立文件夹，以防止PC间帧混淆。

5. 在UCSF Chimera（可选）17中准备快速电影

1. 打开卷系列工具：启动 Chimera，然后导航到卷→卷数据→卷系列工具。新的 卷系列 窗口将开启。
2. 加载映射：点击打开，选择对应一个主成分（例如comp0）的20个映射。
3. 调整可视化参数：打开体积查看器，设置合适的密度阈值，并为地图分配颜色。
   注意：本例中使用了 天空蓝 （见图3）。
4. 预览动作：在 卷系列 窗口中，将播放方向设置为振荡，然后点击播放以显示从第0帧→第19帧→0的连续过渡。
5. 对其他组成部分重复：根据需要重复步骤5.2-5.4。
6. 使用命令行输入生成电影文件：通过打开Chimera命令行并运行 补充编码文件1导出电影。
   注意：每个组件的20帧MRC系列（例如compX_frame000-019.mrc）是Phenix 3D变量细化的输入。保持组件文件夹分开（comp0-comp4），以避免在PC间混淆帧。

6. 通过变异细化在Phenix中生成模型

注意：只要指定完整路径到输入映射和模型，Phenix.varref 可以从任意目录执行。不过，为了组织清晰，建议在每台电脑的专用子目录中进行精炼。

1. 将最终精炼后的共识模型文件复制到对应每台电脑的子目录中。
2. 在每个子目录中，使用以下语法从命令行运行 Phenix.varref：
   phenix.varref consensus_model.pdb *frame_*.mrc resolution=4 nproc=20 models_per_map=50
3. 将 分辨率 设置为4.0 Å，以匹配3DVA地图的有效分辨率
4. 将 nproc 设置为可用处理器数量（本例为20个，但根据可用计算资源不同）
5. 将 models_per_map 设为50个模型（默认）。
   注：每张地图生成50个模型，约束调整以适应3DVA数据分辨率。每张地图最合适的模型会自动保留。最终输出文件包含20个精细模型，对应这20个变异映射。输出包括一个包含20个精炼模型的PDB捆包，以及单独的地图文件。
6. 在变异性细化过程中不要额外加地图锐化。直接使用CryoSPARC生成的变异映射（滤波为4.0 Å）作为phenix.varref的输入。

7. 可视化

1. 在 ChimeraX¹⁸ 中打开 PDB 捆绑包，可以同时加载所有 20 个精炼模型。
2. 使用模型面板，选择性地显示单个帧或感兴趣的特定模型，以便比较和分析（见图4）。或者，每个精炼模型也可以单独在 ChimeraX 或 Chimera 中打开。

8. 分析数据准备

注意：运行上述语法会生成包含20个变量模型和每个独立映射的PDB捆绑包。对于大多数分析，只需两个模型——对应于第0帧和第19帧——，因为它们代表了沿选定主成分（PC）的两个极端构象状态。

1. 在 ChimeraX 中打开 PDB 捆绑包，选择模型 1.1（帧 0）和模型 1.20（帧 19），并将每个模型保存为独立的 PDB 文件（见图 4）。
2. 编辑生成的PDB文件以分离感兴趣的残基。这可以手动完成，也可以使用 Phenix.pdb.tools 完成。
3. 比较两个修改后的PDB文件，以识别主链或侧链的构象变化。
4. 要比较两个PDB模型，使用Chimera中的 MatchMaker 函数叠加修改后的结构。
   注意：为了确保可靠的对齐， MatchMaker 通常要求至少有 10-15 个重叠的残留物。在我们的案例中，仅分析了6个残基;然而，成功叠加是利用ASNS的同调二聚体特性实现的——虽然链A中仅剩6个残基，链B则完好无损，作为比对的参考。

Results

本节展示了由三维变异分析（3DVA）和变异细化工作流程生成的代表性输出，并提供其解释的指导。人类天冬氨酸合成酶（ASNS）被用作示例数据集，展示该方案所支持的成功结果、常见伪证及比较分析。完整的3DVA衍生变异图及ASNS数据集生成的相应细化模型已存放在Zenodo公共仓库中。详细的访问信息见 补充表1。

3DVA变异图和变异电影。
3DVA的主要输出是一组描述结构变异¹的主导模式的变异图，以沿每个主分量（PC）的有序图列形式可视化。对于ASNS数据集，野生型（WT）和R142I变异数据集（补充视频1和2）均生成了主成分0（PC0）对应的地图系列。这些影片提供了粒子群体中域运动和协调结构重排的定性视角。这些电影应被解读为主导的连续变异性，而非时间确定的轨迹。

在数据集间（例如，WT与突变体）之间比较可视化影片时，假设数据质量、粒子数和处理参数相当。但需要注意的是，3DVA衍...

Discussion

关键协议步骤与决策点
该协议的有效使用依赖于工作流程中的几个关键步骤。用于最终冷冻电磁细化的粒子堆栈和掩膜质量至关重要，因为三维变异分析（3DVA）直接基于这些输入而非后处理地图。主成分（PC）数量的选择应反映数据集规模和预期复杂度;分量过少可能低估变异性，而分量过多则可能引入噪声主导的模式。3DVA和变异细化中使用的分辨率参数应与数据的有效分辨率相匹配。后续选择，如要可视化或比较哪些帧，应以感兴趣的结构特征为指导。

故障排查与常见问题
若干问题会使变异性结果的解读变得复杂。表观运动可能源于密度较弱或分辨率不佳，而非有意义的构象变异。检查本地地图质量并在多台电脑间进行比较有助于区分信号与噪声。粒子数量有限、偏好方向或角度覆盖不均可能导致变异模式定义不清。虽然可以使用标准的Phenix验证工具手动生成每对变异地图-模型的验证统计数据，但仅凭这些指标是不够的。仔细的人工检查仍然至关重要，以确保解读的运动由良好分辨的密度支持，并且结构上可信。...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC v4.4+	Structura生物技术	https://cryosparc.com	用于低温电磁处理的软件
Phenix v1.24+	Phenix联盟	https://phenix-online.org	变异细化软件
加州大学旧金山分校奇美拉	生物计算、可视化与信息学资源，UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/	分子可视化软件
加州大学旧金山分校奇美拉X	生物计算、可视化与信息学资源，UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	分子可视化软件
CPPTRAJ	AMBER 分子动力学软件套件	https://amberhub.chpc.utah.edu/cpptraj/	用于RMSF计算的Python工具
Linux 工作站（内部组装的基于GPU的系统）
工作站箱	超级微型	https://www.supermicro.com	工作站机箱：Supermicro CSE-743TQ-1200B-SQ 1200W 4U 服务器 超级机箱
中央处理器	英特尔	https://www.intel.com	CPU：XEON E5-2690V3 x2
母板	超级微型	https://www.supermicro.com	主板：Supermicro Extended ATX DDR4 LGA 2011 主板 X10DAI-O
记忆	关键	https://www.crucial.com	内存：Crucial 64GB 套件（16GBx4）DDR4 2133（PC4-2133）DR x4 ECC 已注册。288针服务器内存CT4K16G4RFD4213 / CT4C16G4RFD4213 x2
硬盘	西部数据	https://www.westerndigital.com	硬盘：WD RE 4TB 企业级硬盘
RAID 控制器	LSI 逻辑	https://www.broadcom.com	RAID控制器：LSI LOGIC MegaRAID SAS 9271-8i 套件
GPU	NVIDIA	https://www.nvidia.com	Quadro M6000 显卡，配备 24 GB GDDR5 内存