利用人源天冬酰胺合成酶的冷冻电镜图谱可视化蛋白质构象动态的工作流程

摘要

本方案概述了如何在CryoSPARC中进行三维变异性分析（3DVA），并在Phenix中进行变异性精修，以分析冷冻电镜数据中的构象异质性。以人源天冬酰胺合成酶为例，本方案详细说明了如何生成变异性图谱、可视化主成分，并对相应的原子模型进行精修。

摘要

本文介绍了一种利用CryoSPARC中的三维变异性分析（3DVA）和Phenix中的变异性精修，对单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）数据中的构象异质性进行系统分析的完整工作流程。该方案描述了如何基于颗粒图像计算主成分方向上的变异性图谱，可视化主要的结构变化模式，并针对各个变异性帧精修相应的原子模型集合。最终输出结果包括一系列三维变异性图谱、代表离散构象状态的精修多模型原子结构，以及适用于比较性结构分析和动画生成的可视化文件。该工作流程广泛适用于分辨率范围通常为~2.0–6.0 Å的冷冻电镜重构数据，在此分辨率下可对主链和侧链水平的构象异质性进行有意义的解释。该方法特别适用于捕捉连续的结构域运动、铰链弯曲运动以及仅靠离散分类难以分辨的协同局部重排。变异性图谱与精修模型集合的联合使用，可实现对构象极端状态的直接结构比较，支持诸如均方根涨落（RMSF） 等定量分析，并为关联动态结构特征与生化或功能假说提供框架。本文以人源天冬酰胺合成酶（ASNS）为例，演示该工作流程的实际应用。

引言

表征大分子结构中的构象异质性在单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）分析中正变得日益重要。本实验方案旨在提供一个实用的工作流程，用于从冷冻电镜数据集中直接提取、可视化并精修主要的结构变异模式，该流程结合了CryoSPARC¹中的三维变异性分析（3DVA）与Phenix²中的变异性精修。本文旨在指导读者判断该计算方法是否适用于其数据，并理解该工作流程所产生的各类输出结果。

传统的实验技术（例如氢-氘交换、核磁共振波谱、质谱）可提供有关蛋白质运动的重要信息^3,4,5，但通常受限于分子大小、样品需求或实验复杂性。冷冻电镜（cryo-EM）技术的进步使得对大尺寸和异质体系进行高分辨率结构解析成为可能，从而能够分析颗粒群体内的构象变异性。CryoSPARC¹ 中实现的三维变异性分析（3D variability analysis, 3DVA）可将冷冻电镜颗粒数据集分解为主成分，以描述结构变异中的主要连续模式。当该方法与 Phenix² 中的变异性精修相结合时，可生成沿每个主成分离散位置对应的原子模型，从而实现基于实验数....

方案

1. 数据准备

1. 生成共识 EM 图谱
   1. 使用单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）测定大分子复合物的共识三维结构。
   2. 将样品在冷冻电镜载网上玻璃化，并使用配备直接电子探测器的高压透射电子显微镜进行成像。
   3. 对采集的电影数据进行处理，校正电子束诱导的运动，估计成像参数，并挑选颗粒图像。
   4. 对颗粒进行迭代分类与精细化，以生成共识 EM 图谱。
   5. 使用 CryoSPARC（v4 或更高版本）¹³ 进行数据处理，因为将实施三维变异性 分析（3DVA）。
2. 生成共识模型
   1. 构建原子模型，并依据共识图谱对其进行精细化。使用标准准则验证精细化后模型的质量
      注：对于 ASNS，结构是通过基于模板的颗粒挑选策略确定的。在 CryoSPARC¹³ 中，使用来源于人源 ASNS 的 X 射线结构（PDB 6GQ3）⁹ 的模板，以高效筛选高质量颗粒。这些颗粒经过多轮迭代的二维分类、Ab initio 重构，以及施加 C2 对称性的非均一和异质精细化，最终获得分辨率为 3.5 Å 的共识图谱。原子模型通过将晶体结构

结果

本节展示了由三维变异性分析（3DVA）和变异性优化流程生成的代表性结果，并提供了相应的解读指导。以人源天冬酰胺合成酶（ASNS）作为示例数据集，用于展示该方案所能实现的成功结果、常见伪影以及可进行的比较分析。由ASNS数据集生成的全套3DVA变异性图谱及相应的优化后模型均已存入Zenodo公共数据库。详细的访问信息见补充表1。

3DVA 变异性图谱与变异性动画。
3DVA 的主要输出结果是一组描述结构变异主要模式的变异性图谱¹，以沿各个主成分（PC）排序的图谱序列形式呈现。针对 ASNS 数据集，分别对野生型（WT）和 R142I 变体数据集生成了对应于主成分 0（PC0）的图谱序列（补充视频 1 和 2）。这些动画直观展示了粒子群体中存在的结构域运动及协调性的结构重排。应将这些动画理解为对主要连续变异模式的表征，而非时间分辨的动态轨迹。

不同数据集之间（例如，野生型与突.......

讨论

关键实验步骤与决策要点
本实验方案的有效实施依赖于流程中的若干关键步骤。用于最终冷冻电镜（cryo-EM）精修的颗粒堆栈（particle stack）和掩模（mask）的质量至关重要，因为三维变异性分析（3DVA）直接作用于这些输入数据，而非后处理后的密度图。主成分（PCs）数量的选择应反映数据集的大小和预期的复杂性；成分过少可能无法充分表征变异性，而过多则可能引入以噪声为主的模式。在3DVA和变异性精修中使用的分辨率参数应与数据的实际分辨率相匹配。下游分析中的选择，例如需要可视化或比较的帧，应根据感兴趣的结构特征进行判断。

故障排除与常见陷阱
多种问题可能会影响对变异性结果的解释。明显的运动可能源于密度较弱或分辨率不足，而非真实的构象变化。通过检查局部密度图质量并比较多个主成分（PC），有助于区分信号与噪声。粒子数量有限、优势取向或角度覆盖不均可能导致变异性模式定义不清。尽管可以使用标准的 Phenix 验证工具手动生成每个变异性密度图-模型对的验证统计量，但这些指标本身并不充分。仔细的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CryoSPARC v4.4+	Structura Biotechnology	https://cryosparc.com	冷冻电镜数据处理软件
Phenix v1.24+	Phenix Consortium	https://phenix-online.org	变异性精修软件
UCSF Chimera	生物计算、可视化与信息学资源中心，加州大学旧金山分校（UCSF）	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/	分子可视化软件
UCSF ChimeraX	生物计算、可视化与信息学资源中心，加州大学旧金山分校（UCSF）	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	分子可视化软件
CPPTRAJ	AMBER 分子动力学软件套件	https://amberhub.chpc.utah.edu/cpptraj/	用于 RMSF 计算的 Python 工具
Linux 工作站（内部组装的基于 GPU 的系统）
工作站机箱	Supermicro	https://www.supermicro.com	工作站机箱：Supermicro CSE-743TQ-1200B-SQ 1200W 4U 服务器超级机箱
CPU	Intel	https://www.intel.com	CPU：XEON E5-2690V3 ×2
主板	Supermicro	https://www.supermicro.com	主板：Supermicro Extended ATX DDR4 LGA 2011 主板 X10DAI-O
内存	Crucial	https://www.crucial.com	内存：Crucial 64GB 套件（16GB×4）DDR4 2133（PC4-2133）DR x4 ECC Registered，288 针服务器内存 CT4K16G4RFD4213 / CT4C16G4RFD4213 ×2
硬盘	Western Digital	https://www.westerndigital.com	硬盘：WD RE 4TB 企业级硬盘
RAID 控制器	LSI Logic	https://www.broadcom.com	RAID 控制器：LSI LOGIC MegaRAID SAS 9271-8i 套件
GPU	NVIDIA	https://www.nvidia.com	Quadro M6000 显卡，配备 24 GB GDDR5 显存