在前庭神经鞘瘤小鼠模型中表征肿瘤诱导性共济失调

摘要

我们建立了一系列行为检测方法，用于研究肿瘤诱导的共济失调，并评估在前庭神经鞘瘤小鼠模型中保护神经功能的治疗方法。

摘要

NF2相关神经鞘瘤病（NF2-SWN）是一种由NF2肿瘤抑制基因种系突变引起的常染色体显性遗传肿瘤易感综合征。该疾病以双侧前庭神经鞘瘤（VSs）的形成为特征，这些肿瘤会进行性增大，导致听力丧失、平衡障碍和共济失调，严重影响患者的生活质量。目前尚无经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物治疗方法。在多种神经系统功能障碍中，共济失调尤为致残，但相关研究仍显不足，这主要由于缺乏可靠的临床前评估模型。在本研究中，我们建立了一套行为学检测方法，用于在与听力丧失和共济失调相关的原位小鼠模型中系统评估肿瘤诱发的共济失调。这些检测方法可对肿瘤负荷引起的平衡障碍和运动协调功能缺陷进行定量测量。该实验平台不仅有助于研究肿瘤诱导的小脑功能障碍机制，也为治疗策略的临床前评估提供了有力工具。通过将行为学评估与肿瘤生物学及听力检测相结合，该方法能够全面表征药物在抑制肿瘤生长和神经保护两方面的治疗效应。最终，这些检测方法构建了一个多功能的研究框架，亦可应用于其他以共济失调为特征的神经系统疾病，从而拓展其在NF2-SWN以外领域的应用价值。

引言

NF2相关神经鞘瘤病（NF2-SWN）是一种罕见的常染色体显性遗传性肿瘤易感综合征，由编码细胞骨架蛋白merlin的NF2抑癌基因突变所致¹。merlin功能丧失会破坏调控细胞增殖、黏附和存活的信号通路，使患者易发生多种神经系统良性肿瘤。NF2-SWN的典型特征是双侧前庭神经鞘瘤（VSs）的形成——起源于前庭蜗神经的非恶性施万细胞肿瘤。这些肿瘤进行性增大，压迫邻近的神经结构，导致感音神经性听力丧失、耳鸣以及面神经功能障碍²。

双侧前庭神经鞘瘤患者常因前庭神经和内耳前庭器官的进行性损伤，导致严重的前庭功能障碍，表现为慢性失衡、共济失调和步态不稳，显著影响活动能力和生活质量³。前庭功能障碍的程度通常与肿瘤负荷及神经受累情况相关。即使在实现肿瘤控制或保留听力的治疗后，这些症状仍常持续存在，提示其神经生物学机制可能超出单纯的机械性压迫^4,5。尽管已有临床工具用于量化前庭功能损害，如眩晕残障量表、步态分析、前庭眼反射（VOR）检测和姿势图分析，但肿瘤所致共济失调的潜在机制仍不明确³。尽管在分子机制认知和靶向治疗（如贝伐珠单抗）方面已取得进展，目前仍无经美国食品药品监督管理局（FDA）批准、可有效同时保留NF2-SWN患者听力与平衡功能的治疗方法。前庭症状的管理仍以对症支持为主，凸显出重大未满足的临床需求。

改善前庭小脑性共济失调临床管理的主要障碍之一是缺乏临床前模型 能够真实再现患者中观察到的前庭功能障碍和运动协调缺陷。目前大多数前庭神经鞘瘤动物模型主要关注肿瘤生长或听力损失，未能模拟典型的平衡与协调功能障碍。此外，在临床前研究中，尚缺乏用于客观评估共济失调和前庭功能障碍的标准化行为学检测方法。这一空白限制了对相关机制的深入研究，也制约了旨在保护前庭功能的候选疗法的评估。

本文报道了一种前庭神经鞘瘤（VS）小鼠模型的建立，该模型表现出可测量的共济失调表型，并配备了一系列专门设计用于量化肿瘤诱导性共济失调的行为学检测方法。该模型为研究与NF2-SWN相关的前庭功能障碍机制，以及评估旨在恢复患者平衡能力、协调性及整体神经功能的治疗干预措施的有效性，提供了亟需的实验平台。

方案

动物实验是根据马萨诸塞州总医院布里格姆机构动物护理和使用委员会（MGB）批准的方案进行的。

1. 动物模型

1. 接种 Nf2^-/- 细胞（小鼠） Nf2^-/- 表达高丝氨酸蛋白酶报告基因（Gluc）的施万细胞移植到免疫活性C57/FVB小鼠体内。使用立体定位注射装置（图1A)，向每只小鼠右侧半球CPA区域注射1 µL含2,500个肿瘤细胞的悬液^4,6.
2. 使用8至12周龄的雄性和雌性小鼠（性别比1:1），以确保足够的统计学效力，并检测可能存在的性别相关差异。将小鼠每4只一组共同饲养，置于12小时光照/12小时黑暗循环环境中，自由获取食物和水 随意摄取.
   注意：由于神经鞘瘤发生在患者的前庭神经上，我们采用了小脑桥脑角（CPA）模型。该模型可重现前庭神经鞘瘤的颅内微环境。
3. 假手术组：为了评估动物手术和肿瘤细胞植入对共济失调的影响，需设置假手术组，即小鼠接受假手术并在小脑脑桥角区注射生理盐水。
4. 设置一组不荷瘤的小鼠作为对照。
5. 为了监测肿瘤进展，使用 Nf2^-/- 表达高斯荧光素酶报告基因（Gluc）的细胞，并在植入后每3天检测一次血浆中的Gluc水平。
6. 简而言之，采集13 µL血液至EDTA管中以防止凝血。将血液样本转移至96孔板，并按照先前所述方法检测Gluc活性。^6,7,8,9.

2. 共济失调测试

1. 以固定顺序进行四项行为学实验，以尽量减少个体间的差异。实验顺序如下：（1）后肢抓握试验，（2）边缘行走试验，（3）步态评估，（4）脊柱后凸评估。每次测试之间，将小鼠放回其饲养笼中，至少休息2-5分钟。在休息期间观察动物状态，仅当其恢复正常的探索行为后才进行下一项测试。若观察到过度应激或疲劳迹象，应立即停止测试。包含测试间休息时间在内，应在约45-60分钟内完成一组10只小鼠的全部四项共济失调评估。
2. 后肢抓握试验
   注：后肢抓握试验用于评估小鼠的神经肌肉协调性、肌张力及姿势控制能力。共济失调小鼠会表现出后肢回缩或向腹部抓握的动作，反映出运动协调性和肌张力调节功能受损⁵。
   1. 用手轻轻抓住小鼠尾根部，确保抓握稳固但力度轻柔，避免造成不适。在提起前可短暂将其身体支撑在笼盖或手掌上，以减少惊吓反应。
   2. 缓慢提起小鼠，使其身体完全伸展并悬空，周围无任何障碍物。保持小鼠离笼子或测试表面至少10 cm的高度。
   3. 维持悬空状态约10秒，期间观察后肢和尾巴的位置，不要旋转或晃动动物。
   4. 按以下标准评估后肢姿势：
      1. 若双侧后肢均向外伸展并远离腹部，则为正常姿势。
      2. 若一侧或双侧后肢向腹部回缩或相互交叉，则为异常姿势，提示存在与共济失调或神经系统损伤相关的后肢抓握现象。
   5. 使用预定义的评分系统记录行为，或拍摄短视频用于后续盲法分析。
      注：每次测试时间应限制在≤10秒，以尽量减少应激。
3. 边缘行走试验
   注：边缘行走试验用于评估小鼠的平衡能力、协调性及精细运动控制。该测试测量动物沿狭窄边缘行走并安全返回饲养笼的能力，过程中不得失去平衡。小脑功能障碍或前庭性共济失调的小鼠在此任务中通常会出现滑倒、跌落或姿势不稳⁵。
   1. 将饲养笼放置在稳定、平坦的台面上，高度约为实验台高度（约1米）。
   2. 将测试笼一端（图1C）与饲养箱（图1D）连接，确保两笼之间无垂直间隙或障碍物，使小鼠能够平稳自然地进入其饲养笼（图1B），无需跳跃或跌落。
   3. 将摄像机安装在三脚架上，以30°–45°角度对准边缘，以便同时捕捉侧向移动和下降过程。
   4. 调整照明条件，减少反光，确保小鼠四肢和尾巴清晰可见。
   5. 用手抓住小鼠尾根部，另一只手支撑其身体，将其放置在边缘中央，使四只脚掌均接触表面。仅当小鼠表现出平衡且警觉的状态时，才松开尾部。
   6. 允许小鼠在边缘上自由行走，无需外界刺激。记录至少10秒，或直至其进入笼中。
   7. 观察其在边缘上行走时是否能保持平衡而不滑倒，以及能否朝向笼子或平台方向行走。
   8. 每只小鼠进行三次独立试验，每次试验间休息约2分钟。每次更换小鼠后，使用70%乙醇清洁边缘表面，以去除气味线索。
   9. 所有测试应在安静环境中进行，保持光照一致，背景噪音和振动最小化。避免在同一天内重复测试过多次数，以免疲劳和学习效应影响测试结果。
4. 步态评估
   注：步态评估用于检测自由活动小鼠的运动协调性、步幅模式及姿势稳定性。共济失调小鼠常表现为步幅缩短、动作不稳及脚掌落点不规则，提示协调性和平衡控制能力存在缺陷⁵。
   1. 在一条笔直、平坦的跑道上铺设白色复印纸（8.5 × 11英寸），并在纸张末端放置饲养笼，以诱导小鼠穿过纸面。
   2. 使用无毒印台，将前肢和后肢分别蘸取两种对比颜色的墨水（例如，前肢用蓝色，后肢用红色）（图1E）。
   3. 将小鼠置于跑道起始端，允许其在无外界刺激的情况下自由穿过纸面。
   4. 观察并测量以下参数：
      步幅长度：同一脚掌连续两次落点之间的距离。
      步宽：左右后脚印之间的横向距离。
   5. 每只小鼠进行2至3次测试，测试间给予适当休息。
      注：使用无毒、快干型墨水，并确保仅脚垫着墨。每次试验后更换纸张，防止墨迹模糊。墨水应少量涂抹，避免脚印模糊，因墨水过多会降低步幅测量的准确性。
5. 脊柱后凸评估
   注：脊柱后凸评估用于检测自然运动过程中脊柱对线情况及姿势异常。神经系统或肌肉功能障碍的小鼠常表现出持续性的背部背侧弯曲或驼背现象⁵。
   1. 将小鼠置于平面上，允许其自由行走或探索数秒。避免惊吓动物，因为突然的动作可能暂时改变其姿势。
   2. 从侧面拍摄短视频，以记录躯干弯曲情况。
   3. 观察小鼠行走时的姿势，重点关注脊柱对线和躯干弯曲情况，具体如下：
      1. 若小鼠保持背部平直或轻微拱起，且身体运动流畅，则为正常姿势。
      2. 若小鼠出现脊柱后凸，表现为异常驼背或弯曲的脊柱、躯干僵硬以及行走时灵活性降低，则为异常姿势。

3. 共济失调测试分析

注意：所有行为学评分应由对实验分组不知情的观察者进行，以尽量减少观察者偏倚。

1. 边缘行走测试评分
   1. 若小鼠沿边缘行走平稳，保持平衡，且无滑落情况下顺利下降进入笼内，则评分为3分。
   2. 若小鼠表现出轻度功能障碍，例如出现短暂犹豫或轻微前爪滑动，但能恢复平衡并安全下降，则评分为2分。
   3. 若小鼠表现出中度功能障碍，包括频繁滑动、蹲伏姿势、过度依赖尾巴维持平衡，或下降延迟，则评分为1分。
   4. 若小鼠表现出严重功能障碍，无法维持平衡、从边缘跌落，或拒绝移动，则评分为0分。
2. 后肢抓握测试评分
   1. 若小鼠后肢持续外展，无任何抓握迹象，则评分为3分。
   2. 若小鼠表现出轻度功能障碍，例如单侧后肢间歇性回缩，则评分为2分。
   3. 若小鼠表现出中度功能障碍，表现为双侧后肢部分回缩并靠近腹部维持，则评分为1分。
   4. 若小鼠表现出严重功能障碍，在大部分观察时间内双侧后肢紧贴腹部强力抓握，则评分为0分。
3. 步态评分
   1. 若小鼠行走时步态稳定、协调，并沿直线移动，则评分为3分。
   2. 若小鼠表现出轻度功能障碍，例如行走缓慢伴有轻微不稳或侧向偏移、单侧跛行，或沿宽大的环形路径移动，则评分为2分。
   3. 若小鼠表现出中度功能障碍，包括明显步态异常、仅使用两或三只脚行走、拖拽身体部分，或沿紧密环形路径移动，则评分为1分。
   4. 若小鼠表现出严重功能障碍，无法有效行走，保持静止不动或出现不受控制的侧向翻滚运动，则评分为0分。
4. 脊柱后凸评分
   1. 若小鼠在静止和行走时背部均保持平坦、笔直，则评分为3分。
   2. 若小鼠表现出轻度功能障碍，静止时背部有轻微弯曲，但在活动时可伸直，则评分为2分。
   3. 若小鼠表现出中度功能障碍，静止时背部呈中度拱起，且在行走时仍保持弯曲状态，则评分为1分。
   4. 若小鼠表现出严重功能障碍，在整个观察期间背部严重拱起，限制了正常活动能力，则评分为0分。

4. 评估评分者间信度

1. 在正式评分前，使用代表性示例视频对观察者进行培训，以标准化评分标准的解读。
2. 为尽量减少观察者偏倚，所有行为学测试应由两名经过培训且对处理分组和实验时间点设盲的观察者独立完成评分。
3. 使用 Cohen's kappa 系数量化每项行为学检测的评分者间信度。kappa 值解释如下：<0.40，一致性较差；0.40–0.60，中等一致性；0.60–0.80，高度一致性；>0.80，接近完全一致。
4. 通过共同复查录制视频解决任何评分差异，并达成共识评分⁵。

结果

CPA 肿瘤生长导致 VS 小鼠模型出现共济失调

为评估肿瘤诱导的共济失调，我们建立了两个实验组。首先，为评估动物手术及肿瘤细胞植入对共济失调的影响，小鼠接受了假手术，并向小脑脑桥角（CPA）区域注射生理盐水。将假手术组小鼠的共济失调症状与未手术对照组小鼠进行比较。在第二组中，将 Nf2^-/- 肿瘤注射至CPA区域，并将这些小鼠的共济失调症状与无肿瘤的正常小鼠进行比较。

为评估共济失调，我们进行了以下检测：i） ledge 实验，ii）后肢抓握实验，iii）步态评估，以及 iv）脊柱后凸评估。这四项检测的评分相加得到总体共济失调评分。无共济失调症状的正常非荷瘤小鼠 consistently 呈现最高共济失调评分12分，证实了该评分系统的可靠性。使用本方案成功检测共济失调的表现为共济失调评分进行性降低，评分越低表明共济失调程度越严重。

在 CPA 模型中，手术操作和假注射均未引起可检测到的共济失调；非...

讨论

本文所述的行为学检测方法为评估前庭神经鞘瘤（VS）及相关前庭功能障碍小鼠模型中的共济失调和运动协调缺陷提供了一个可靠且定量的框架。这些检测方法借鉴了亨廷顿病和脊髓小脑性共济失调等神经退行性疾病模型的成熟方案¹⁰，非常适合用于表征 NF2-SWN 中肿瘤诱导的前庭功能障碍。通过整合多种行为学指标，该方法可对运动协调性、平衡能力、姿势控制和运动功能进行系统评估，而这些功能在双侧前庭神经鞘瘤患者中常受到影响。

每种检测方法均衡量运动功能的不同补充方面。 ledge 检测通过挑战动态平衡和本体感觉，揭示可能由前庭神经损伤引起的细微协调障碍。后肢抓握检测 通过量化肢体回缩行为，快速识别神经肌肉无力或脑干功能障碍。步态检测基于足印模式分析，可对运动协调性和步幅规律性进行简单评估，而脊柱后凸评估则反映随着前庭或小脑功能障碍进展所出现的姿势异常和肌张...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胎牛血清	ThermoFisher	A5670701
GloMax 96 微孔板发光检测仪	Promega	GM3000
McKesson 蓝色手术垫	McKesson	75402
施万细胞生长添加剂	ScienCell	1752