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利用观鲸船只进行环境DNA采样以监测鲸类动物

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DOI：

10.3791/70334

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2026年4月10日

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1University of Iceland's Húsavík Research Center, Húsavík, Iceland, 2Applied Animal Ecology Research Unit, Department of Zoology, University of Innsbruck, 3Politecnico di Milano DICA Civil and Environmental Engineering Department, 4Department of Life and Environmental Science DISVA, Marche Polytechnic University, 5CetaceanWatching Lda, 6Tethys Research Institute, 7WasserCluster Lunz - Biologische Station GmbH

本文内容

摘要

本方案描述了一种从观鲸船只上采集鲸类环境DNA（eDNA）样本的标准化工作流程。该流程优先考虑研究人员和受过培训的公民科学家的可行性，同时其实际应用范围受限于环境条件、过滤时间、水体浊度以及船上的后勤条件。

摘要

环境DNA（eDNA）为监测鲸类动物提供了一种非侵入性方法，但其在实际操作平台上的广泛应用需要标准化且可行的采样 工作流程。本研究描述了一种从观鲸船只上采集鲸类eDNA的实验方案，旨在由研究人员或经培训的公民科学家在特定环境和后勤条件下实施。该方法结合了针对鲸尾浪迹的海水采集、船上使用自保存滤膜进行过滤，以及后续分子分析，以在真实环境中实现可操作的数据生成。该方案于2024年在北大西洋和地中海的三个区域（冰岛、葡萄牙和意大利）开展的协调性野外调查中实施，覆盖多种鲸类分类群。通过一种新开发的特异性定量PCR检测方法评估方案性能，该检测靶向座头鲸（Megaptera novaeangliae）的线粒体DNA，结果表明在不同环境和操作条件下均具有稳定的检出率。本方案提供了野外实施和污染控制方面的实用指导，有助于实现可重复的基于eDNA的鲸类监测，并促进海洋生物多样性研究中的跨区域可比性。

引言

对包括鲸类动物和其他活动范围广泛的物种在内的海洋大型动物进行有效的保护管理，对于生物多样性保护至关重要。作为顶级捕食者和生态系统工程师，鲸类动物在全球各大洋盆中参与营养级调控、养分循环以及增强生态系统的恢复力1。然而，针对这些高度移动的物种获取全面的生态学知识仍然具有挑战性，通常依赖于资源密集型的监测项目2。传统方法如活体组织取样、照片识别、被动声学监测、 卫星遥测和航空调查已为鲸类生态学研究提供了关键信息3,4,5,6,7，但这些方法往往成本高昂、后勤要求高、空间覆盖受限，或具有侵入性，并受到严格的伦理和法规监管8。因此，采样频率、地理覆盖范围以及利益相关方参与的机会通常受限，尤其不利于活动范围广或稀有物种的研究。

环境DNA（eDNA，指生物体释放到其环境中的遗传物质） 采样已发展成为一种强大的非侵入性工具，可用于从水样中检测水生物种9,10针对线粒体DNA片段的物种特异性定量PCR（qPCR）检测方法可实现对海洋生物类群（包括鲸类）的高度敏感和特异性检测11,12,14除了存在/缺失检测外，环境DNA信号的相对强度 以及目标DNA序列提供 与邻近性、相对丰度以及种群水平遗传模式相关的有价值信息15,16,17,18,19此外，在鲸类附近采集的环境样本中经常含有共存类群的DNA，包括猎物物种、共生体和寄生生物，从而支持更广泛的生态关联研究。20,21,22总体而言，这些进展表明，环境DNA（eDNA）技术有望作为传统方法的补充，拓展对海洋生态系统中鲸类动物研究的范围。23,24.

尽管具有这些优势，基于环境DNA（eDNA）的海洋大型动物监测仍面临持续挑战，主要涉及样本的代表性、空间覆盖范围以及方法的可重复性，尤其是在开放海洋系统中，DNA会迅速被稀释25,26，且目标物种分布范围广泛、种群密度较低。解决这些限制因素需要具备可扩展性且在操作上可行的采样框架，能够 在大范围的空间和时间尺度上应用。公民科学项目已被证明在扩大生态数据收集的同时，能够促进公众参与海洋保护，因此成为开展大规模eDNA监测的有前景途径27,28,29,30。观鲸船只是一种尚未被充分利用但极为合适的eDNA采样平台，可定期在不同季节和区域进入鲸类栖息地31,32,33。全球观鲸产业拥有广泛的运营网络34，先前的研究已证明，从其他机会性平台（如商用船只、渡轮35）以及结合照片识别和行为观察的针对性采样中获取鲸类eDNA是可行的36,37。eDNA研究的快速发展推动了大量方法学上的创新，但海洋系统间存在的生物学变异性以及技术进步的速度，使得统一操作规程和确保研究间数据可比性的努力变得复杂。因此，建立标准化且具备适应性的野外方法至关重要，尤其对于大规模跨国监测项目而言尤为如此38。

eDNA 的检测受过滤水体积、过滤策略、滤膜材料和孔径 的影响。通常情况下，过滤更大的水样体积可提高脊椎动物目标（包括鲸类动物）的 eDNA 产量和检出概率39,40,41,42。然而，在生产力较高或浑浊的水体中，由于滤膜迅速堵塞，过滤效率可能受到限制43,44，因此需要在可实现的过滤体积与操作可行性之间进行权衡45,46。从鲸尾拍击水面形成的尾迹（flukeprints）——即鲸尾划水产生的水面扰动——中采样，已被反复证明可增强鲸类 eDNA 的可检出性，因为新近脱落的生物物质在水面附近较为集中24,41,42,47,48。使用封闭式、自带保存功能的滤膜系统可减少操作步骤和污染风险，因此非常适合用于 公民科学项目38,42。此外，设置生物学重复样本以及常规的野外对照，有助于最小化检测失败的可能性，并提高数据的可靠性49,50,51。

实验方案的开发与验证
eWHALE 项目52 是一项跨国倡议，整合了欧洲范围内的研究人员、观鲸运营商和公民科学家，利用环境DNA（eDNA）对海洋大型动物进行监测。采样工作已覆盖北大西洋和地中海的多种鲸类分类群，采用一套核心方案，并根据各地区的具体环境和操作条件进行了区域性调整。

本文介绍了一种标准化的、从头到尾的鲸类环境DNA（eDNA）采样方案，该方案通过分析2024年在冰岛斯卡加峡湾、葡萄牙亚速尔群岛以及意大利利古里亚海协调开展的野外考察活动中采集的308份海水eDNA样本（每份样本包含两个重复）及21份野外对照样本而优化完善。该方法整合了以鲸尾迹为目标的海水采集、使用自保存eDNA滤膜在船上进行过滤，以及后续的分子分析流程。

本方案旨在由受过培训的研究人员和公民科学家在真实观鲸条件下实施，可在海面平静至中等波浪条件下于船上完成过滤操作，且不会干扰正常的观鲸活动。实施本方案需与参与机构（例如观鲸运营单位、非营利组织、科研机构）协调，以确定采样策略和研究目标。尽管核心参数必须保持固定，以确保可重复性和跨研究的可比性，但在浊度较高、船只晃动明显或时间、空间及人员受限的采样地点，可能需要进行符合本方案原则的调整。此类调整包括滤膜类型、可实现的过滤水体积以及辅助设备的选择。 这些调整必须在每次采样活动中保持一致，并在报告中明确说明。方案步骤和讨论部分提供了详细的运行指导和后勤考量，以支持数据质量、透明度以及区域间的可比性。

qPCR 检测设计
为评估实验方案的性能，从野外采集的样本中扩增了座头鲸（Megaptera novaeangliae）的环境DNA（eDNA）。座头鲸是一种研究较为充分的迁徙性物种， regularly 出现在冰岛斯卡加峡湾（Skjálfandi Bay）53 ，并在亚速尔群岛季节性出现54。DNA裂解、提取及qPCR操作流程通过eWHALE项目四个参与实验室间的实验室间比对测试进行了初步优化，从而提高了不同机构间实验结果的一致性和适用性14。

为可靠检测座头鲸环境DNA（eDNA）的存在，依据既定指南设计并验证了一种针对线粒体ND5区域的物种特异性MGB（小沟结合物）qPCR检测方法55 （表1）使用DNA序列比对与分析软件设计合成了寡核苷酸引物和探针56，旨在最大限度提高物种特异性和扩增效率 （补充文件1-补充图S1）检测特异性通过以下方式评估 体外 使用目标类群和非目标类群（小须鲸，真海豚，抹香鲸，智人）。用于生成qPCR标准曲线的DNA浓度由组织来源的DNA标准品定量得出42,57,58,59,60检测限（LOD）定义为在95%的样本重复中产生阳性扩增的最低浓度，据此确定该检测方法的检测限11,61通过评估每个样本重复在三重qPCR检测中呈阳性的反应比例及信号强度（即循环阈值，Ct值），对野外样本中座头鲸环境DNA的检测结果进行评价，以校正扩增过程中的变异性并提高检测的可靠性57,60,62随后通过双向Sanger测序验证物种检出结果，并经BLAST分析确认。63.

qPCR 数据以均值 ± 标准差（SD）表示。组间统计学显著性通过非参数 Mann-Whitney U 检验和 Welch 两样本 t 检验进行评估。当 p < 0.05 时，认为差异具有统计学意义。所有分析均使用统计分析软件64完成。

方案

伦理与法规合规性
所有鲸类观察活动及后续水样采集必须遵守国家和地区的野生动物管理法规。仅可从持有有效观鲸或科研许可的授权船只上开展采样工作。应保持与目标物种之间的最小接近距离，并避免仅为采样目的而进行的任何机动操作。用于检测验证的鲸类组织样本是在相应地区许可下采集的，并根据国家和机构规定在eWHALE项目合作伙伴之间共享。

注意：在进行任何采样活动之前，请查阅以下文件并准备必要的设备：材料表、环境DNA采样试剂盒（补充文件1-补充图S2）中用于采集环境DNA样本的材料（图1），以及采样步骤和船上过滤流程的概述（图2）。

1. 环境DNA采样的准备

  1. 准备野外记录材料，包括野外数据表和过塑的野外操作规程（补充文件 2 和 补充文件 3）。
  2. 准备备用手套、备用滤膜（每个样本重复使用一片滤膜）、防水记号笔以及专用的废弃物容器（图 1A）。
    注意：使用封闭式自保存 eDNA 滤膜（孔径 1.2 µm），以尽量减少操作和污染风险65,66。
  3. 准备一个或多个刚性采样桶，应适配船只类型和船上配置（补充文件 1-补充图 S3）。
    1. 使用永久性记号笔在采样桶上标记 10 L 刻度。若操作 10 L 容量不切实际，可准备多个较小的采样桶。
    2. 若舷外操作范围受限，应将绳索牢固地系在采样桶上。
      注意：当船体晃动剧烈时，使用带盖的采样桶以尽量减少液体溢出（图 1B）。
    3. 准备一个次级 eDNA 容器用于合并较小体积的样品，并额外准备一个运输箱，以确保采样桶在运输过程中不受污染（图 1C）。
  4. 准备便携式蠕动泵或真空水泵（图 1D）。登船前将泵充满电，并在使用前立即断开电源。
  5. 出发前分配好采样、过滤和数据记录的职责。
    ​警告：操作所有设备时均需佩戴手套，并在不同操作之间更换手套。

海洋水样采集装置、设备、污染分析技术、过滤系统。
图1：用于采集环境DNA样本的野外工作材料。（A）包含自保存eDNA滤膜、废液容器、装有稀释家用漂白剂（1:10）的挤压瓶、手套、野外数据表和防水笔的工具包；（B）eDNA采样用桶的示例；（C）用于运输和过滤大体积水样的额外eDNA容器，以及用于在船上运输采样桶的容器；（D）用于水样过滤的便携式泵示例。请点击此处查看该图的放大版本。

鲸类水域采样工作流程、过滤过程示意图；装置包括呼吸管、管路和泵。
图 2：在观鲸船上进行环境DNA采样的概念示意图。该图示描述了包括水样采集和船上过滤在内的操作步骤。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 仪器设备清洗

  1. 清洁前请戴上一次性手套。
  2. 通过将家用漂白剂（5-6% 次氯酸钠）与纯化水按 1:10 比例稀释，配制漂白液（每次约需 50 mL）。
  3. 将溶液均匀泼洒至所有桶体、桶盖、容器及泵管表面，确保所有表面与漂白液接触时间不少于 2-5 分钟。
  4. 用自来水彻底冲洗 3 次（图 3）。
  5. 将物品置于安全处自然晾干，并在登船前存放于安全洁净的空间。

沉积物采样过程；示意图展示采样、清洗和储存步骤，并包含设备细节。
图3：设备清洗步骤。（A）使用1:10稀释的家用漂白剂溶液；（B）佩戴无DNA污染的手套均匀涂抹；（C）用自来水彻底冲洗三次；（D）如有需要（例如eDNA样品容器），对其他材料重复上述步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 水样采集

注意：须遵守每艘船舶或平台上的所有安全规定，包括在需要时穿戴救生衣或浮力连体服。

  1. 在乘客到达前将所有材料带上船，并存放在指定的清洁区域。
  2. 与船员协调采样时间和船只位置。
  3. 观察鲸鱼的浮出模式，以预测其下潜行为（图4）。采样前戴上新的手套。
  4. 在鲸鱼下潜后，尽快（不超过10分钟）从尾迹处采集20 L海水，以获得两个10 L的重复样品。
  5. 将采集的水样运送至船上的指定过滤站，使用瓶盖或额外的无菌容器防止洒漏（如需要）。
  6. 在数据表中记录物种名称、GPS坐标、时间及样品重复编号。
  7. 报告完成后立即更换手套。

座头鲸行为；A) 喷水，B) 潜水时尾部下潜，C) 水面活动；海洋生物学研究。
图4：座头鲸浮出水面序列。（A）鲸喷气；（B）下潜前弓背并抬高尾部；（C）鲸下潜后水面留下的尾鳍痕迹。图片来源：Ocean Missions（A、B、C，2024）。 请点击此处查看此图的放大版本。

4. 环境DNA过滤

  1. 打开滤膜袋，并仅通过出口端操作滤膜（补充文件1-补充图S4）。
  2. 将进水口插入 snorkel（呼吸管），并将泵的管路连接至出口端（图5A，B）。
  3. 将 snorkel 浸入水样中，注意不要使滤膜外壳浸入水中（图5C）。
  4. 设置泵（参见材料表中的泵类型）至快速且稳定的流速。
  5. 连续过滤10 L水样，同时监测流速稳定性（检查是否存在气泡、破损、撕裂或密封失效）。
    注意：过滤最长时间不得超过45分钟。
  6. 反转滤膜，运行泵30–60秒以去除残留水分。确认滤膜外壳内无可见湿气残留。
  7. 关闭泵并断开管路连接。
  8. 将 snorkel 丢弃至废物容器中，将滤膜放入其原始包装袋中，并立即标记。
  9. 将滤膜在船上存放于密闭的硬质容器或冷藏箱中（若环境温度 > 20 °C），避免阳光直射和乘客区域。
  10. 更换手套，对第二个重复样品重复过滤操作。

使用注射器滤器进行海洋微塑料过滤，实验装置展示三种不同的采样方法。
图 5：船上过滤装置的设置步骤。（A）将滤器入口（白色部分）连接至采样管（导管）；（B）将泵的管路连接至滤器出口（黄色部分）；以及（C）将采样管的一部分浸入水样中。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 现场阴性对照与数据报告

  1. 每处理五个吸虫印记样本后，过滤一个野外阴性对照样本。
  2. 返回岸边后立即使用无目标DNA的水，并在清洗设备前完成操作。
  3. 每次采样结束后，将所有数据上传至数字eDNA采样电子表格（补充文件4）。

6. 滤膜的保存与运输

  1. 将自保存的环境DNA滤膜存放于阴凉、避光、室温干燥的容器中，或当环境温度超过20 °C时存放于冰箱中，存放时间不得超过3个月，之后应及时寄送。
  2. 寄送前目视检查滤膜袋是否有潮湿现象。
  3. 将滤膜标记后，置于带冰袋的保温容器中，运送至指定实验室。

7. 实验室分析

注意：所有实验操作均应在专用的紫外线灭菌房间内进行，并确保通风良好，PCR 操作需使用独立的工作台，同时佩戴无 DNA 污染的手套和防护服55,67,68。

  1. DNA 裂解
    1. 为每个滤膜标记一个2 mL反应管。
    2. 将滤膜放入一个 200 mL 锥形瓶中，并丢弃橡胶塞图6A).
    3. 使用无DNA污染的镊子，将膜折叠（补充文件1-补充图S5) 折成三角形，转移至2 mL反应管中，管尖朝下（图6B- D).
    4. 加入 380 µL TES 缓冲液和 20 µL 蛋白酶 K（参见 材料表) 加入每个反应管中，最终得到 400 µL 裂解缓冲液（图6E).
    5. 涡旋混匀片刻，在56 °C条件下振荡孵育不少于3小时（图6F).
    6. 离心管，18,626 × g 室温下孵育10分钟。
      注意：澄清至淡色的裂解液表明消化成功。
      注意：如果裂解液保存在 -20 °C，该实验步骤可暂时中止于此阶段。
  2. DNA提取
    1. 在提取前将裂解物于 56 °C 孵育 10 分钟。
    2. 移液提取试剂至洗涤板和洗脱板中，需考虑阴性对照及移液误差69 （参见 补充文件1-补充表S1).
    3. 每块板使用 TES 缓冲液设置一个提取空白对照。
    4. 将300 µL裂解液转移至结合板的每个孔中。向每孔加入300 µL Buffer AL和300 µL异丙醇。若总裂解液体积超过300 µL，可使用多个结合板。涡旋混匀后，向第一个结合板的每孔中加入30 µL用于核酸结合的磁性颗粒材料表).
    5. 用棒状盖板覆盖结合板。
    6. 运行初步DNA吸收程序，针对两块结合板（总裂解液体积为400 μL；参见） 材料表 和 图7）和 基于磁珠的实验室机器人自动化提取方案 
    7. 将提取用化学试剂弃置到指定的废液容器中。
    8. 将洗脱的DNA转移至已标记的1.5 mL离心管中，于−20 °C保存。
      注意：本实验步骤可在此阶段暂时中止。此时可进行额外的抑制剂去除操作。
  3. qPCR
    1. 根据制造商说明，使用组织提取物和基于荧光的高灵敏度双链DNA检测法制备并定量目标物种DNA标准品材料表通过连续稀释（1:10）生成八点标准曲线，起始浓度为 10 ng/µL11,55在qPCR之前分装标准品，以尽量减少冻融循环。
      注意：本实验方案可在该阶段暂时中止。
    2. 使用96孔板，每个qPCR反应设置三个重复。
    3. 每块qPCR板需包含一个无模板对照（分子级水）和一个提取空白对照。
    4. 按照说明制备预混液 补充文件1-补充表S2 和 图8A.
    5. 在DNA加样罩内，将先前配制好的DNA标准品和3 µL DNA提取物加入含有预混液的各孔中图8B).
    6. 用封板膜密封平板（图8C).
    7. 3,500 × 离心 g 10 秒，然后将其加入实时定量 PCR 扩增仪（图8D，E).
    8. 在指定的优化循环条件下运行检测 表2，并使用制造商的软件记录数据（材料表)11.

使用镊子、离心机和培养箱进行实验室样品制备和处理步骤。
图6：DNA裂解工作流程。（A）取下自保存环境DNA滤膜的橡胶帽，并将其放入锥形瓶中；（B）将两对镊子火焰灭菌三次；（C）折叠滤膜；（D）将其插入2 mL离心管中；（E）加入裂解缓冲液和蛋白酶K，以及（F）在56 °C下孵育样品3小时。请点击此处查看该图的放大版本。

DNA提取过程的实验用品；用于样品分析的离心机设置，实验。
图7：DNA提取所用材料与设备。（A）用于提取准备的结合板、洗涤板、洗脱板、耗材及试剂；（B）基于磁珠的实验室自动化机器人，用于样品处理。请点击此处查看此图的放大版本。

DNA 提取和 qPCR 准备；过程包括稀释、离心和数据分析。
图 8：qPCR 工作流程。（A）在先前经紫外线灭菌的房间内（在专用于配制主混合液的生物安全柜中）配制主混合液；（B）按照所示模式，在DNA加样工作站中加载DNA标准品、提取物和对照样本；（C）密封反应板；（D）离心；（E）将反应板放入实时定量PCR扩增仪中。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

2024年，采用该优化方案共采集了154份鲸尾迹水样（308个环境DNA滤膜），其中包括在3月至11月期间于冰岛斯卡法恩迪湾采集的96个滤膜样本（9份野外空白对照和76份座头鲸重复样本）、7月份在葡萄牙亚速尔群岛采集的151个滤膜样本（12份野外空白对照和15份座头鲸重复样本），以及5月至10月期间在意大利利古里亚海采集的61个滤膜样本（4份野外空白对照）。所有样本均使用自保存型环境DNA滤膜采集最多10 L海水（每份鲸尾迹样本设两个重复）（表3）。野外工作期间共收集了两类阴性对照：一类为设备经漂白剂清洗后过滤的纯化水，另一类为返回港口后采集的海水42。后者在漂白剂清洗前进行过滤，旨在评估采样过程中可能发生的鲸类环境DNA交叉污染。所有样本分两批从各采样点运送至奥地利因斯布鲁克大学动物学系应用动物生态学研究组，用于实验室分析。

检测与对照性能
对44个滤膜样本（包括来自冰岛斯卡夫塔湾的30个重复样本及2个野外对照，以及来自葡萄牙亚速尔群岛法亚尔岛和皮库岛周边海域的14个滤膜样本及1个野外对照）进行了座头鲸环境DNA的检测分析（图9）。信号通过三重qPCR反应进行测量。若三个qPCR重复中至少有一个出现扩增，则判定该样本（即eDNA滤膜）为阳性。本研究中该检测方法的检出限（LOD）为0.0001 ng/µL（LOD的平均Ct值 = 35.8）。在分析的41个滤膜中，20个（49%）检测到扩增信号，而24个（58%）未检测到扩增。未检出结果（无Ct值）很可能反映目标DNA的缺失或浓度极低。未检出样本包括来自亚速尔群岛的5个滤膜（占13个中的38%）和来自冰岛的19个滤膜（占28个中的68%）。使用MarVer3检测法对提取空白样本进行海洋脊椎动物DNA的筛查70 ，未发现可检测的扩增信号，表明DNA提取过程中未发生交叉污染。野外对照（NC）和qPCR对照（NT）均未出现扩增，证实野外采样及qPCR筛查过程中无污染发生（表4）。

在20个阳性滤膜中，有9个（22%）的Ct值至少有一个低于检测方法的检出限（LOD；0.0001 ng/µL），因此被归类为可靠检出。其中包括亚速尔群岛8个滤膜中的4个（50%）和冰岛12个滤膜中的5个（42%）。另有11个滤膜（27%）产生了一个或多个高于检出限的Ct值，包括亚速尔群岛4个滤膜（50%）和冰岛7个滤膜（58%），表明可能存在合理检出（图10）。比较分析显示，亚速尔群岛滤膜的平均循环阈值（Ct）略低于冰岛滤膜（亚速尔：34.7 ± 3.60；n = 8；冰岛：36.9 ± 3.60；n = 10）。Mann-Whitney U 检验表明，该差异无统计学显著性（U = 199.0，p = 0.204）。鉴于Ct值与DNA信号强度呈反比关系，结果提示亚速尔群岛滤膜中目标座头鲸环境DNA的浓度略高（图11）。

可行性限制
每次考察所采集的吸虫印记样本数量因考察持续时间和天气条件而异。在亚速尔群岛，3小时的考察中大约采集2至3个样本（最多可获得6个eDNA滤膜）；在意大利，约8小时的考察中采集2至4个样本（最多可获得8个滤膜）；在冰岛，3.2小时的考察中采集1至2个样本（最多可获得4个滤膜）。在亚速尔群岛和意大利，过滤性能总体较高。在亚速尔群岛，10 L海水通常在10至15分钟内完成过滤；而在意大利，相同体积的过滤时间约为10分钟。在冰岛，过滤体积介于4.5至10 L之间（平均值 = 8.5 L），平均过滤时间约为40分钟，这主要是由于滤膜频繁堵塞所致，可能与研究区域海水中颗粒物含量较高有关。具体而言，在98个滤膜中，有46个（47%）成功过滤了10 L水样，31个滤膜（32%）获得7 L至10 L之间的体积，21个滤膜（21%）获得4 L至7 L之间的体积（补充文件1-补充表S3）。

该方案建议每采集五个吸虫印记样本后，进行一次现场阴性对照过滤。然而，在所述案例研究中，由于存在包括滤膜供应有限、时间限制以及运输延误等后勤制约因素，在实际观鲸作业条件下无法完全满足此要求。这使得可实现的对照与样本比例降低至：冰岛1:10.7（9/96），亚速尔群岛1:12.6（12/151），意大利1:15.3（4/61）。尽管存在这些偏差，所有现场和实验室阴性对照均未出现扩增信号。

冰岛和亚速尔群岛地图，附详细插图显示斯卡加峡湾及法亚尔岛、皮科岛。
图9：样本采集地点概览。 地图上的黑点表示在冰岛斯卡加峡湾和亚速尔群岛从座头鲸尾鳍印记中采集样本的地点。eDNA滤膜的名称标注在相应的采样区域附近。 请点击此处查看该图的放大版本。

DNA信号条形图，亚速尔群岛与冰岛，显示Ct平均值、PCR结果比较。
图10：来自亚速尔群岛和冰岛部分eDNA滤膜的检测结果。 亚速尔群岛和冰岛阳性检测（至少一个PCR重复呈阳性）的qPCR平均Ct值及DNA信号强度，包含标准差（SD）和检出限（LOD）。条形颜色根据相对于LOD的信号强度着色：深蓝色 = 强信号（Ct ≤ 35.8），表示可靠检测；浅蓝色 = 弱信号（Ct > 35.8），表示可能存在的检测。SD误差线表示PCR重复之间的变异程度。红色虚线表示LOD（Ct = 35.8）。每个条形上方显示平均Ct值。缩写：Ct = 循环阈值；SD = 标准差；LOD = 检出限。 请点击此处查看此图的放大版本。

PCR分析中亚速尔和冰岛Ct值的箱线图比较；统计结果图。
图11：亚速尔和冰岛长须鲸DNA检测的平均循环阈值（Ct值）。箱线图中的黑线表示中位数，红色方块表示平均Ct值（标准差，SD），须线表示亚速尔和冰岛的最小值和最大值。Mann-Whitney U 检验显示，该差异无统计学显著性（U = 199.0，p = 0.204）。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：针对ND5的qPCR检测的引物和探针序列。这些序列包括正向和反向引物、MGB探针序列（5′-3′）、最佳退火温度以及检测的最低检出限（LOD）。(*) LOD定义为目标物种DNA的最低DNA浓度（ng/µL），在此浓度下，≥95%的PCR重复样本产生阳性扩增结果。请点击此处下载该表格。

表2：座头鲸环境DNA qPCR检测的优化循环条件。这些优化的qPCR设置包括：95°C 预变性10分钟（酶活化），随后进行40个循环，每个循环为95°C 变性15秒和60°C 退火/延伸90秒。请点击此处下载该表格。

表3：野外采样配置概述。 亚速尔群岛、冰岛和意大利的采样区域、野外合作单位、船只类型、目标物种、采样时段及样本重复次数的概览。请点击此处下载该表格。

表4：环境样本及对照的qPCR检测结果汇总。 阳性检测结果（以黄色高亮显示）、qPCR重复孔的Ct值及检测结果均已列出；当至少一个qPCR重复孔出现扩增时，样本被判定为阳性。“无Ct值”表示未检测到扩增，阴性对照未出现扩增，用于评估检测性能和确定检出限（LOD）的M. novaeangliae标准稀释系列列于表格底部。请点击此处下载该表格。

补充文件 1：包含补充图和表，提供有关本方案应用的额外信息，包括引物设计、环境 DNA 采样工具包、观鲸船只类型、自保存环境 DNA 滤膜特性、DNA 提取和定量 PCR 反应所用试剂体积，以及不同采样区域间过滤速率的变化。 请点击此处下载该文件。

补充文件2：鲸类eDNA采样期间使用的野外数据表。用于记录航次元数据、鲸类观测信息以及样品和滤膜信息的标准化表格。请点击此处下载该文件。

补充文件3：鲸类环境DNA采样的分步野外操作规程，适用于观鲸船只，内容包括设备清洁、海水采集与船上过滤、样品记录及储存。请点击此处下载该文件。

补充文件4：鲸类环境DNA采样电子表格模板。 样品采集及船上过滤后记录采样信息的标准化表格。请点击此处下载该文件。

讨论

操作可行性与实地应用
本文所述的方案提供了一种标准化的环境DNA（eDNA）工作流程，在检测灵敏度与实际应用限制之间实现了平衡。通过整合大体积、针对虫卵特征的采样、使用自保存封闭滤器的船上过滤，以及标准化的污染控制措施，该方案提供了一个可重复的框架，适用于不同区域和多次采样活动。这一方法与当前对eDNA作为传统海洋监测技术的一种经济高效且可扩展的补充手段的日益认可相一致9,10,22。

以往的鲸类环境DNA研究主要依赖于从大型研究船进行的样线式海水采样，或在鲸类目击点附近 opportunistically 采集小体积水样。样线式方法能够实现较广的空间覆盖，但通常捕获到的是被稀释且在时间上脱节的DNA信号，即使在表层海水采样时，也限制了对稀有或短暂出现物种的检测71，并且通常需要专门的船舶和基础设施25,37,72。相反，在浮出水面的鲸鱼附近采集小体积水样可提高与目标物种相遇的特异性，但由于采样体积有限以及过滤操作不一致，仍容易出现假阴性结果72,73。通过有针对性地采集尾鳍拍击后形成的水面痕迹（flukeprints）并在船上过滤大体积水样，本文所展示的工作流程在符合观鲸作业典型的时间和空间限制条件下，提高了捕获低浓度鲸类eDNA的概率。使用封闭式、可自我保存的滤膜进一步降低了样本处理和污染风险，无需在野外添加保存缓冲液，从而在有限的船上条件下简化了操作流程42,66。

为确保跨研究的可比性，在一次采样活动中，以下参数必须保持固定：直接从可见的鲸类尾鳍痕迹中采集海水；每个尾鳍痕迹采集两个10 L的生物学重复样本；使用自保存的环境DNA滤膜，并在标准化的污染控制措施下立即进行船上过滤，包括以规定的最低频率定期设置野外阴性对照；以及采用特异性qPCR进行三重重复检测 ，并设置适当的对照。其他参数可在不破坏方法学框架的前提下有所变动，但需保持一致并透明报告，包括采水设备及操作方式、滤膜孔径、泵的类型和管路配置、过滤持续时间以及在堵塞条件下可实现的过滤体积、船上样品物流管理，以及运输前的短期储存条件。由于环境DNA研究中的许多处理步骤仍存在可变性，因此强烈建议对所有采样和分析步骤进行严格详尽的报告。

在海况平静至中等（≤蒲福风级3级）、水体浊度较低至中等，且船上时间和空间允许对每个鲸尾迹处理两个eDNA滤膜、每个滤膜过滤10 L水样的情况下，本方案的可行性最高。实际操作中，经过培训的科研人员可在最高蒲福风级3级的海况下采样，但由于船只晃动和水体扰动，公民科学家仅应在平静海况（蒲福风级1–2级）下作业，尽管观鲸旅游有时在蒲福风级3级海况下仍可进行。为尽量减少DNA降解，应在采集水样后尽快开始过滤47,74。采用可最大限度减少螺旋桨引起表层eDNA稀释的采样策略（例如从船只背风侧和较低位置采样），有助于提高靶向准确性和检测可靠性47。避免倒车操作，并防止连接水桶的绳索接触海水样本，可进一步降低污染风险，这符合水生eDNA研究的最佳实践标准38。根据船只配置和实际操作条件（如船体高度、晃动程度和船上可用空间），若能保持操作一致性，则可采用以下两种采样策略之一：（i）使用两个独立水桶分别采集并过滤两个10 L的重复样本，或（ii）采集一个20 L的水样，转移至密封无菌容器中安全运送上船，随后将其均分为两个10 L的重复样本进行过滤。在观鲸条件下，每个滤膜过滤10 L水样是在检测概率与过滤工作量之间达成的实际折中方案。

较大的水样体积可提高捕获稀有或低浓度环境DNA（eDNA）的可能性，并减少鲸类研究中常见的假阴性结果39,40,75，同时在使用自保存滤膜和较大孔径滤膜时仍具备操作可行性42。然而，较高的颗粒物负荷、船只运动、甲板空间有限或时间限制可能会降低过滤效率和可实现的采样体积，从而限制本方案的适用性。在此类情况下，可能需要采用与方案一致的调整措施，例如减少采水量或使用其他孔径的滤膜 ，且应在整个采样活动中保持一致，以确保数据的可比性。航程时长、鲸类相遇的时间以及过滤能力共同决定了可获得的样本数量。在标准的3小时观鲸旅游中，通常可在不影响正常运营或公众科学体验的前提下完成1至2个尾迹水样采集（偶尔可达3个）。在较长的科考航次中，采样能力随每日观鲸活动强度增加而提升（例如，在我们的意大利案例研究中约为每天8小时）。实际操作中，在旅游高峰期可于全部三个地点实施eDNA采样。

eDNA 扩增成功率与污染控制
环境样本，尤其是从营养丰富的水体中采集的样本，可能含有能够抑制扩增反应并导致假阴性结果的 PCR 抑制剂76。尽管在同一项目的冰岛样本先前分析中未检测到抑制现象42，但加入抑制物去除步骤可确保扩增成功率的一致性（见材料表），并符合水生 eDNA 实验流程的最佳实践建议14,55。

不同区域间稳定的qPCR检测性能表明，该方案能够在多种环境条件下可靠地检测到鲸豚类环境DNA（eDNA）。Ct值的微小差异可能反映了各区域在温度、浊度和生产力方面的差异，这些因素会影响eDNA的释放、降解和扩散。75,76该检测方法的检出限（0.0001 ng/µL）处于eWHALE项目中其他已验证的鲸类检测方法所报告的灵敏度范围内14,11,42检测率与先前基于flukeprint的研究结果一致，凸显了物种行为和浮出水面频率对检测成功率的影响41,42,47使用组织来源的DNA标准品进行qPCR定量，这反映了海洋环境DNA研究中的常见做法57,72,77,78,79. 尽管这种方法可能在绝对定量中引入变异11,61,80,81,82,83，特别是对于低浓度和异质性的环境样品84,85，它反映了真实世界样本的复杂性55,86使用合成标准品可能提高定量结果的可重复性及不同研究间的可比性，建议在今后的应用中采用11,87.

潜在的污染源包括样本间的交叉转移，以及在操作过程中引入的人源或非目标环境DNA，这些都可能导致假阳性检测结果88。在整个野外和实验室处理过程中，严格的污染控制至关重要，尤其是在公民科学项目通常面临的受限条件下。常规更换手套、使用无DNA污染的设备、封闭式过滤系统、标准化培训、常规设置野外和实验室阴性对照、记录潜在污染事件，以及依据既定框架进行检测方法验证，对于确保数据的可靠性和物种检出的准确性具有关键作用11,31,49,51,55,89。尽管基于野外的分子采样不可避免地会使用塑料制品，但已在可能的情况下尽量减少其使用，并采用了部分可生物降解的过滤材料66。

局限性、可扩展性及未来意义
在浑浊或生物量较高的环境中（例如冰岛的斯卡夫塔湾），滤膜堵塞仍然是一个主要限制因素，悬浮有机物和浮游生物的密度可能会降低过滤效率43,90。记录过滤持续时间、滤膜堵塞的指标（如流速降低、滤膜中可见气泡或泵的负荷增加），并将每次重复的过滤时间限制在约45分钟内，有助于后续的数据解释与比较。使用经灭菌的漂浮装置来悬挂滤膜或采用重力驱动的过滤袋，可能减少过滤过程中的操作时间，但后者可能不适用于自保存的环境DNA滤膜以及大体积样本（≥1 L）91。使用更大孔径的滤膜（≥ 5 µm）可能进一步提高过滤速率，但在针对鲸类环境DNA的初步采样中，应评估其对特定分类单元的检测效率45,92。

在开展大规模采样之前，需考虑的关键因素包括：优先在船上进行过滤处理，而非延迟至后续处理；保持水样体积和滤膜配置的一致性；开展试点采样以在本地条件下优化过滤流程；以及根据船只承载能力和航程时长合理规划采样工作量。建议在今后的应用中采用能够支持公众科学家在野外进行结构化数据记录的数字化数据录入工具93。

该端到端工作流程的成功应用表明，其在操作限制条件下具有良好的稳健性，同时也凸显了公民科学背景下固有的空间、时间、天气及污染风险等方面的局限性10,94。尽管存在这些限制，只要提供标准化的培训与监督，观鲸船只仍可成为鲸类环境DNA监测的一种强大且尚未充分利用的平台31,32,42,95。将该工作流程与已有的鲸类监测工具（如照片识别、被动声学监测和活体组织取样）相结合，可将基因检测结果与行为学和种群统计学数据相互关联。虽然本研究聚焦于基于qPCR的物种特异性检测，但未来应用可整合DNA宏条形码技术或种群遗传学分析，进一步提升鲸类环境DNA监测在生态学与保护生物学中的价值。

随着环境DNA（eDNA）技术的不断发展，该工作流程为将遗传监测整合到现有的海洋观测和保护项目中提供了可扩展的基础，特别是在鲸类动物热点区域和敏感生态系统中。

披露

Belén García Ovide 是“海洋使命”（Ocean Missions）的创始人兼执行主任，该非营利组织致力于海洋保护，总部位于冰岛东北部的胡萨维克（Húsavík）。“海洋使命”负责协调来自冰岛观鲸船只以及北极探险船只的样本采集工作。她还在 eWHALE 项目中担任胡萨维克观鲸公司 North Sailing 的代表。上述隶属关系未对本研究的设计、数据收集、分析或结果解释产生影响。

致谢

我们谨向所有参与野外工作和实验室工作的人员致以诚挚的感谢，具体包括：

i) Aidan Mabey、Matteo Tosato、Anouk Adolph、Jeanne Laporte、Romi Neerot 和 Isabell Österle，参与了在冰岛斯卡加峡湾采集样本的工作；ii) Dania Tesei、Michael Costa、Rita Norberto、Marlene Schwandt、Rita Leitão、Ricardo Ventura、Martijn Schouten、Giada Viscontini、Katharina Leeb、Anthony Le Floch、Francisco Nunes、Renato Cardoso、Faustine Darius、Monique Schouten、Laura Biet 在亚速尔群岛（葡萄牙）；iii) Sandra Schallhart、Jana Robertson 在奥地利；以及 iv) Sabina Airoldi、Mario Gabualdi、Marina Costa、Morgana Vighi、Nino Pierantonio、Roberto Raineri 在佩拉戈斯海洋保护区（意大利）进行数据收集工作。

本研究由Biodiversa+（欧洲生物多样性合作伙伴关系）在2021-2022年BiodivProtect研究提案联合征集项目下资助，该项目由欧盟委员会（资助协议编号：101052342）共同资助，并得到以下资助机构的支持：1）冰岛研究基金会（RANNÍS）（资助编号：229030）；2）意大利大学与研究部（MUR），来自FIRST和IGRUE特别账户，涉及欧洲合作伙伴关系Biodiversa+ 2021年征集项目eWHALE；3）奥地利科学基金（FWF）[doi: 10.55776/I6389]以及因斯布鲁克大学出版基金。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
替代性 eDNA 滤膜：Sterivex™ / Waterra默克密理博/沃特拉泵业有限公司SVHVL10RC/NA0.45 µm 孔径。需要 eDNA 保存缓冲液 
AW1、AW2、AE缓冲液Qiagen  19081, 19072, 19077DNA提取过程中用于DNA纯化的缓冲溶液
次氯酸钠溶液（1:10）DM - 动脑筋，卫生清洁剂定制化表面去污染。实验室操作的所有步骤
水桶船用商店、渔具、亚马逊刚性。橡胶或硬质塑料（≥ 10 L）。根据采样设置和船上后勤情况，可采集一个或多个样本
清除试剂，Express PCR ExoSAP-IT75001.1.EASanger测序用PCR产物的制备
冷藏箱外壳绝缘硬质容器或冷藏袋
一次性手套，大号（L）和中号（M）
无粉		Kimberly-Clark43431, 55090一次性丁腈或乳胶手套，每盒100副。所需数量：每10至15次航程需1盒
DNA标准品（3 μL) NA定制化DNA组织来源的系列稀释（8个点，10 ng/µL）来自座头鲸。qPCR 中的校准
DNA安全实验室服装Falano, PP-总体081-2900实验室流程中的所有步骤
环境DNA样本容器房屋或五金商店NA带盖、耐用、透明（≥ 10 L 
洗脱板，棒盖，洗涤板，结合板Qiagen19581, 997004, 1031656, 302570用于DNA提取的塑料制品 
乙醇（8:10）Endure，ACS ISO Rang多种台面灭菌。所有实验室操作步骤
野外数据记录表
基于荧光的高灵敏度检测方法Thermo Fisher ScientificQ32851Qubit dsDNA 高灵敏度检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）
高速离心机（24,000 rpm）Hettich Zentrifugen 分离含DNA的上清液与碎片。DNA裂解
冰袋Housing stores运输容器内样品的冷却
IPC 正向和反向引物Integrated DNA TechnologiesNA用于目标物种 DNA 扩增的定制产品
IPC PrimeTime qPCR 探针Integrated DNA TechnologiesNA用于目标物种 DNA 扩增的定制产品
层流罩 Kendro Laboratory ProductsVFS1206qPCR 制备中试剂配制的无菌环境
层压式图解野外操作规程 定制化
裂解缓冲液Qiagen79216DNeasy 裂解缓冲液 AL。替代 TES 缓冲液 + 蛋白酶 K
磁珠–基于DNA的机器人KingFisher Apex 96 PCR 头部模块5400910软件：BindIx PC 
用于核酸结合的磁性颗粒（30 µL)Qiagen67563MagAttract 磁珠。在DNA提取过程中促进DNA与磁珠的结合
预混液（5 μL)EMM，Life Technologies4396838TaqMan Environmental Master Mix (2.0)
微型板式旋转离心机 LabnetC1000离心去除PCR管和微孔板中的液体液滴和冷凝水
OneStep-96 PCR 抑制物去除试剂盒ZYMO ResearchD6035eDNA提取物的纯化与污染物去除 
PCR板Bio-RadHSP9601硬壳96孔板
移液器 + 无菌过滤吸头移液器：BIOHIT，滤芯吸头：Biozym Safe  海豹小贴士  专业多种可使用手动或电子移液器，其最大体积因型号而异
平板旋转离心机 NANA在qPCR前去除气泡 
蛋白酶KAvantor VWRA4392.0010消化蛋白质，有助于在裂解过程中释放DNA
纯化水MilliQNARNase-free水，用于阴性对照和清洗溶液 
反应管（2 mL）Eppendorf30120094DNA 裂解
实时定量PCR热循环仪AnalytikjenaNAQTower 3G 平台。实时扩增并定量 DNA
绳索乘船、五金商店、渔港NA结实的材料（如聚乙烯或编织绳），长度至少为船只高度的两倍
密封膜，粘性，光学级Bio-RadMSB1001Microseal 'B'。PCR 前密封 PRC 板
自保存环境DNA滤膜Smith-Root 11579-251.2 µm 孔径。每次采样活动所需数量：根据需要
集装箱实验室、药店、亚马逊多种聚苯乙烯泡沫隔热
用于生物序列比对与分析的软件生物编辑版本 7适用于 Windows 95/98/NT 的用户友好型生物序列比对编辑与分析程序
挤压瓶实验室，药房多种用家用漂白剂（1:10）充满
统计分析软件R Studio 团队. (2023)版本 4.2.1
无DNA无菌手套Sempercare  版本79712实验室流程中的所有步骤 
TES缓冲液定制产品，相当于 DNeasy 裂解缓冲液
有毒废物容器危险废物的安全处置。所有步骤
紫外灯 SterilAIRqPCR 准备过程中的罩子灭菌
Vortex-genie 2 旋涡混合器 Thermo Fisher Scientific50728002均质并混匀试剂。DNA裂解、提取
废液容器Housing stores小型刚性容器
水泵（蠕动泵/真空泵）Eijkelkamp；Solinst/Smith-Root 12.34.SB；410/12099便携式泵
防水记号笔多种

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DNA PCR DNA
利用观鲸船只进行环境DNA采样以监测鲸类动物
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