用于小鼠默认模式网络纵向多模态电生理记录的大尺寸可重复密封颅窗手术方案

摘要

本方案描述了一种两阶段手术方法，用于在小鼠中创建一个大尺寸、可重复密封且保留硬脑膜的颅窗。该技术能够在数周时间内对分布式的深部脑网络（如默认模式网络）进行长期、多模态的电生理记录。

摘要

默认模式网络（DMN）是一个核心的、大规模脑网络，参与多种认知功能，并与多种神经精神疾病（如重度抑郁障碍，MDD）相关。在动物模型中研究DMN复杂的动态特性，有助于深入理解其在健康和病理状态下的功能。然而，在清醒且自由活动的小鼠中，对DMN多个深部且分布广泛的脑区进行稳定、长期、大规模的电生理记录，仍是一项重大挑战。

本文介绍了一种新颖的两阶段手术方案，用于在小鼠中制备一个大尺寸（4 mm × 7.6 mm）、耐用且可重复密封的颅窗。该手术设计旨在保持硬脑膜的完整性，这对于长期脑部健康和记录稳定性至关重要。

该技术通过结合表层微电皮层图（µECoG）与两个高密度颅内电极探针，实现了对超过1000个电极的同步、重复、纵向记录，前所未有地获取了默认模式网络（DMN）的活动信息。该方法为在数周时间内开展多模态、多尺度的全网络电生理动态研究提供了可靠平台，为探索脑部疾病病理生理机制背后的神经可塑性变化，以及评估新型治疗手段的长期效应开辟了新的途径。

引言

默认模式网络（Default Mode Network, DMN）最初在人类脑成像研究中被发现，表现为一组在需要外部导向和集中注意力的任务中持续受到抑制的脑区¹。目前，该网络被认为是一个支持内部导向认知过程的基本大规模脑网络，这些过程包括自我参照思维、自传体记忆以及对未来事件的规划^2,3。在人类中，典型的DMN由一系列解剖上相互连接的核心脑区组成，包括内侧前额叶皮层（mPFC）、后扣带皮层（PCC）、下顶叶小叶（IPL）以及海马结构⁴。该网络的功能异常是多种神经精神疾病的关键特征。在重度抑郁症（MDD）中，DMN通常表现出过度活跃以及功能连接模式的改变，这些变化被认为构成了MDD核心症状的神经基础，例如反刍思维和负面自我认知^5,6。

为了研究驱动默认模式网络（DMN）功能障碍的细胞与环路机制，可靠的动物模型不可或缺。在啮齿类动物中已可靠地鉴定出同源的默认模式网络（DMN），其包含与人类相似的脑区，如内侧前额叶皮层（mPFC）、扣带皮层和后顶叶皮层（RSP），从而验证了小鼠作为机制研究具有转化相关性的模型⁷

方案

所有动物实验均经芬兰国家动物实验委员会批准（许可证号：ESACI/40845/2022），并严格遵循欧洲议会关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63/EU以及芬兰关于实验动物护理和使用的国家指南进行。

注意：所有外科手术均在层流手术罩内进行，该罩已通过紫外线照射（至少15分钟）或彻底的乙醇表面去污预先灭菌。异氟烷废气由安装在罩内的活性炭吸附系统收集。操作者佩戴一次性头罩、外科口罩、长袖实验服以及单层非无菌丁腈检查手套（进入罩前用80%乙醇喷洒）。在罩内放置锐器废弃物容器，用于立即丢弃手术刀片和皮下注射针头。

1. 术前准备与麻醉

1. 使用 C57BL/6JRj 小鼠，年龄至少 10 周，体重超过 20 g。
2. 手术前，在温热的超声波清洗槽中清洁所有器械，冲洗、干燥后，用 70% 乙醇浸泡至少 15 分钟。
3. 或者，在使用前通过玻璃珠或红外灭菌器短暂灭菌器械。不使用无菌手术单。在同一手术批次中连续处理动物之间，应将器械放回乙醇中浸泡至少 2 分钟¹⁹。
4. 使用校准天平单独称量每只小鼠，并计算术前用药的体积。
5. 提前准备无菌 PDMS 膜（每批仅需一次，非急性手术当天进行）。
   1. 根据制造商说明，将弹性体与固化剂按 10:1 比....

结果

成功的手术会在大脑皮层上形成一个清晰透明的观察窗，能够清晰看到血管结构，且炎症或感染迹象极轻微。这种清晰状态可维持超过21天（图1），从而支持长期的纵向研究。该植入装置的稳定性已在为期21天的慢性皮质酮给药实验范式中得到验证，后者是诱导啮齿类动物抑郁样状态的常用模型^10,23,24。这证实了该方法适用于慢性疾病建模研究。

通过慢性窗记录的原始电生理信号在纵向时间线上保持高质量。在图2中，并列展示了来自后部压后皮层网格的代表性宽带µECoG信号，以及来自浅层皮层通道的颅内探针局部场电位信号，分别对应首次记录日（第0天）和21天后（第21天）的数据。第21天的记录显示，与同一只动物第0天的记录相比，信号幅度、频谱内容以及运动和噪声伪影的缺失程度均具有可比性，证实了PDMS膜和硅胶密封.......

讨论

本报告详细描述了一种两阶段、保留硬脑膜的外科手术方案，该方法可可靠且高效地在小鼠中创建一个大尺寸、慢性且可重复密封的颅窗。该技术的重要性不仅在于颅窗的尺寸，其主要优势在于能够对大规模脑网络进行跨时间的同步、多尺度研究。通过结合表面微电皮层脑电图（µECoG）网格（提供中尺度局部场电位数据）与深部高密度颅内电极探针（提供微尺度、层析解析的单神经元及局部场电位数据），研究人员可直接探究特定环路活动（例如默认模式网络深部节点内的活动）如何影响皮层上所观察到的网络层级动态的形成。此外，该方法适用于任何大规模脑网络研究，因其可实现对小鼠大脑大部分区域的访问。

该方案的成功依赖于两个关键方面。首先，将手术分为两个阶段，并以48小时的恢复期相隔，是一项至关重要的设计选择。这一策略可最大限度地减少动物所承受的累积生理应激，降低急性炎症反应，并在更具侵入性的开颅手术之前允许组织初步愈合。经验表明，这种分阶段的设计能够提高长期植入物健康存活的可靠性，与已发表的小鼠分阶段颅骨植入方案一致¹⁴。其次，保留硬脑膜的开颅技术是整个操作中最关键的一步。通过将颅骨磨.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
µECoG 阵列 — 512通道定制（2 × 256 ch	NeuroNexus	E256-200-30-80	包装：IH256。两件16×16 个子网格（每个 3.3 mm） × 3.5 毫米；200 μm 螺距；80 μm电极直径。表面水平DMN记录。
三轴左手显微操作臂	世界精密仪器公司（WPI）	504926	10 μ微米级分辨率；数字显示；用于手术过程中头板/探针的定位
3D打印防护帽	自研（Anycubic Photon Mono 4K）	N/A	定制设计；使用 Anycubic High Clear UV 树脂打印；STL 文件可从 https://github.com/RazBalin/ProtectiveDMN_Cap 获取
丙酮（分析纯）	Sigma-Aldrich	179973	粘合剂涂覆前的颅骨表面脱脂与骨膜去除
Adson 硬脑膜钩（5 mm，精细硬脑膜钩）	gSource	gS 25.2570	用于沿边缘将骨板从硬脑膜剥离；由细钨丝或类似材料制成
Anycubic 高透UV树脂	Anycubic	STMGCL-102B	使用 Anycubic Photon Mono 4K 打印机制作 3D 打印防护帽所用的光聚合物树脂
Anycubic Photon Mono 4K 光固化3D树脂打印机	Anycubic	PHOTON-MONO-4K	用于使用 Anycubic 高透树脂打印防护窗帽
Anycubic UV 树脂清洗液 & Cure Machine 2.0	Anycubic	285-550	3D打印帽状物的打印后清洗与紫外线固化
带磁性底座的关节臂×2)	哈斯工装	09-0535	用于固定 µ记录期间置于皮层表面的ECoG子网格
人工脑脊液（aCSF）	内部制备	N/A（内部）	aCSF 配方：124 mM NaCl，3 mM KCl，26 mM NaHCO₃3，2 mM CaCl2，1 mM MgSO₄4，1.25 mM KH2PO4，10 mM D-葡萄糖；用95% O₂供氧2 / 5% CO₂2 制备后立即使用。目录编号单独列出。
钝头显微手术刀（环形手术刀）	Iogen	374769	用于颅骨表面刮除和帽状腱膜去除
布托啡诺（Temgesic）	Indivior	BE-112515	阿片类镇痛药；术前皮下注射 0.05 mg/kg
C57BL/6JRj 小鼠	Janvier Labs		雄性或雌性；至少10周龄 >手术时体重20 g
二水合氯化钙（CaCl₂）2·2H2O	Sigma-Aldrich	C-7902	2 mM；分子量 147.02；0.29 g/L。以 Ca 形式配制 ×100倍浓缩液。自制aCSF的组分。
卡洛芬（Rimadyl）	硕腾动物保健	RXRIM-INJ	非甾体抗炎镇痛药；术前皮下注射 5 mg/kg
皮质酮	Sigma-Aldrich	C2505	溶于饮水中用于21天慢性应激/抑郁症模型
棉签	Fisherbrand	22-363-157	作为30 G硬膜穿刺装置的手柄，并用于丙酮脱脂颅骨表面
氰基丙烯酸酯胶水 — Loctite 401	亨克尔粘合剂	Loctite 401	低黏度氰基丙烯酸酯；用于颅骨表面预处理、头固定板和帽固定
牙科钻头 — Foredom K.1070	Foredom	K.1070	柔性轴旋转钻；用于开颅减薄和导孔钻孔
地塞米松	Dopharma	1DEX004	皮质类固醇抗炎；术前皮下注射 2 mg/kg
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G-7021	10 mM；分子量 180.20；1.80 g/L。以葡萄糖配制 ×100倍浓缩液。自制aCSF的组分。
钻头 钢制圆钻 1/007W	Hager &和 Meisinger	18089	用于参考位点和颅窗
80% 乙醇（v/v）- A12t Dilutus	Berner	13221132	手术器械及手术层流罩术前浸泡消毒
气体抽排装置	RWD生命科学	R546W	清除手术区域的废气麻醉气体
镀金参考电极插座	DigiKey	310-13-102-41-001000	植入左侧小脑；用作皮层脑电图（ECoG）的接地/参考电极
GRANT 超声波清洗机 — Model 17002A	GRANT Instruments	17002A	EAN: 4064343191654。热水超声波清洗机；与 TICKOPUR TR 3 配合用于器械清洗
加热垫 — Supertech TMP-5B	Supertech	TMP-5B	保持体温在37 °麻醉期间持续监测 C
异氟烷	Piramal Healthcare	66794-017-25	吸入麻醉剂；诱导 4%，维持 1.5%–2.5%
Kimtech Science 精密擦拭纸（无纤维组织）	金伯利·克拉克	7552	使用尖头工具吸干残留的ACSF，并辅助PDMS膜与硬脑膜粘附
Kwik-Cast 无菌弹性密封剂	世界精密仪器公司（WPI）	KWIK-CAST-s	型号：KWIK-CAST-S。生物相容性硅胶；用于在PDMS膜周围形成可移除的密封。
LED 紫外固化笔 405 nm	CureUV	514424-405	用于种植过程中固化紫外激活的牙科粘接剂（Total C-Ram）
利多卡因-肾上腺素溶液	Orion Pharma	05 10 31	局部麻醉；皮下注射至头皮皮肤下方
七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）4·7H2O	Sigma-Aldrich	M-7774	1 mM；分子量 246.48；0.25 g/L。以 Mg 形式配制 ×100倍浓缩液。自制aCSF的组分。
金属头板 — Neurotar Model 13	Neurotar	模型 13	钛合金头颅固定板；圆形开口，直径11 mm；使用氰基丙烯酸酯和牙科水泥固定于颅骨
NeuroNexus 头戴式适配器	NeuroNexus	定制 IH256 64×4 Molex	定制适配器板；夹层式结构 µ两个Intan RHD 128通道头戴装置之间的ECoG子网格
Neuropixels 1.0 探针配金属帽（×2)	IMEC	PRB_1_4_0480_1_C	960 个记录位点；10 mm 探针柄。一个探针靶向海马-丘脑-视觉皮层柱，另一个靶向内侧前额叶皮层（mPFC）柱
NI PXIe-1083 机箱	国家仪器公司	PXIe-1083	9槽PXI Express机箱，用于容纳Neuropixels模块和NI DAQ数据采集卡
NI PXIe-3839 多功能 I/O 模块	国家仪器公司	PXIe-3839	安装于NI PXIe-1083机箱中；用于同步和辅助I/O
NI PXIe-6363 多功能数据采集设备	国家仪器公司	PXIe-6363	安装于 NI PXIe-1083 机箱；用于同步的模拟和数字 I/O
Nova 微型焚烧炉  红外线灭菌器	Argos Tech	S3022	用于可能接触暴露脑组织的任何器械的快速灭菌
奥林巴斯SZ51体视双目显微镜	Olympus	SZ51	手术可视化；贯穿开颅和植入步骤使用
Open Ephys 采集板（One Box，第一代）	Open Ephys	OEPS-9029	接收 µ通过 SPI 传输的 ECoG 数据流；开源硬件。参见 open-ephys.org
Open Ephys GUI	Open Ephys	N/A（开源）	免费、开源的电生理数据采集软件。可访问：open-ephys.org
氯化钾（KCl）	Sigma-Aldrich	P-5405	3 mM；分子量 74.55；0.22 g/L。自制 aCSF 的组分。
磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)	Sigma-Aldrich	P-5655	1.25 mM；分子量 136.09；0.17 g/L。自制 aCSF 成分（Klebs ×10 倍浓缩储备液。
聚维酮碘溶液（BETADINE）	武田	45 70 28	用于手术区域准备的局部消毒剂
PXIe 采集模块	Neuropixels	PXIE_1000	用于Neuropixels 1.0数据采集的PXI格式模块；安装于NI PXIe-1083机箱
参考插座连接器	DigiKey	342-10-102-00-591000	与上述参考插座配套的配对连接器；请与 DigiKey 确认部件号
RHD 128通道头戴式装置（×4)	Intan Technologies	RHD 128	每两个头级 µECoG 子网格；确认型号（例如 RHD2132 或 RHD2164）
RHD SPI 接口电缆，0.9 m	Intan Technologies / Open Ephys	C3203	标准SPI电缆，用于连接RHD前置放大器与Open Ephys数据采集盒
RWD 空气泵	RWD生命科学	R510-29	为麻醉回路提供气流
RWD 动物麻醉蒸发器	RWD生命科学	R5835	用于麻醉诱导与维持的精密异氟烷蒸发器
11号手术刀片	Swann Morton	SM0103	用于在颅骨表面雕刻交叉纹路，以增强粘附力
小型动物毛发修剪器 - GT416	Aesculap Schermaschinen GmbH	D-98528H	用于手术前修剪动物头皮
碳酸氢钠（NaHCO₃）3)	Sigma-Aldrich	S-5761	26 mM；分子量 84.01；2.18 g/L。自制 aCSF 的组分。
氯化钠（NaCl）	Sigma-Aldrich	S-5886	124 mM；分子量 58.44；7.25 g/L。自制 aCSF 的组分。
SOL-M（无菌皮下注射针头 30 G）	Sol-Millennium Europe	113005	弯曲 90° 在尖端固定于棉签上，以制备硬脑膜穿刺装置
标准操作臂，三轴左侧（Stoelting）	斯托尔廷公司	51604	用于记录过程中插入 Neuropixels 探针
标准操作臂，三轴右侧（Stoelting）	斯托尔廷公司	51606	用于记录过程中插入 Neuropixels 探针
立体定向架 — RWD F67001	RWD生命科学	F67001	标准立体定位仪；用于头部固定和基于坐标参考的植入物放置
带尺规的外科标记皮肤笔（紫色墨水）	Fannin	SM0372	基于龙胆紫的生物相容性外科皮肤标记剂，用于在骨面上标出计划开颅区域及植入物轮廓。该标记剂耐受氰基丙烯酸酯底涂剂（Loctite 401）处理，在颅骨脱脂和头固定板安装过程中仍保持清晰可见，可实现立体定位坐标的可靠转移至骨表面。
SYLGARD 184 硅弹性体试剂盒（PDMS）	陶氏（德国）	1673921	聚二甲基硅氧烷；浇铸成薄层（<1 mm）膜；置于硬脑膜表面以保护大脑
Tergazyme 酶清洁剂	Alconox	1304-1	使用1%（w/v）蛋白酶清洁剂溶于温热的反渗透水中，用于实验后电极清洗（浸泡45分钟，随后用纯化水冲洗三次）。
Total C-Ram Automix UV 牙科粘固剂（白色）	Itena	R301950	模型：TTCRAM-BLC；紫外光固化牙科树脂；用于头固定板加固和套管固定
超声波清洗液（TICKOPUR TR 3）	Dr. H. Stamm GmbH	TR-3-913	柠檬酸基浓缩液；用于超声波清洗机中术后器械的清洗
维适泰滴眼凝胶 2 mg/g	爱尔康	503849	基于卡波姆的润滑性眼膏；麻醉期间用于角膜以防止干燥
蔡司 KL1500 LCD 冷光源	卡尔·蔡司	KL1500 LCD	用于手术区域的光纤冷光源照明；可防止热损伤