用于小鼠默认模式网络纵向多模态电生理记录的大尺寸可重复密封颅窗手术方案

摘要

本方案描述了一种两阶段手术方法，用于在小鼠中创建一个大尺寸、可重复密封且保留硬脑膜的颅窗。该技术能够在数周时间内对分布式的深部脑网络（如默认模式网络）进行长期、多模态的电生理记录。

摘要

默认模式网络（DMN）是一个核心的、大规模脑网络，参与多种认知功能，并与多种神经精神疾病（如重度抑郁障碍，MDD）相关。在动物模型中研究DMN复杂的动态特性，有助于深入理解其在健康和病理状态下的功能。然而，在清醒且自由活动的小鼠中，对DMN多个深部且分布广泛的脑区进行稳定、长期、大规模的电生理记录，仍是一项重大挑战。

本文介绍了一种新颖的两阶段手术方案，用于在小鼠中制备一个大尺寸（4 mm × 7.6 mm）、耐用且可重复密封的颅窗。该手术设计旨在保持硬脑膜的完整性，这对于长期脑部健康和记录稳定性至关重要。

该技术通过结合表层微电皮层图（µECoG）与两个高密度颅内电极探针，实现了对超过1000个电极的同步、重复、纵向记录，前所未有地获取了默认模式网络（DMN）的活动信息。该方法为在数周时间内开展多模态、多尺度的全网络电生理动态研究提供了可靠平台，为探索脑部疾病病理生理机制背后的神经可塑性变化，以及评估新型治疗手段的长期效应开辟了新的途径。

引言

默认模式网络（Default Mode Network, DMN）最初在人类脑成像研究中被发现，表现为一组在需要外部导向和集中注意力的任务中持续受到抑制的脑区¹。目前，该网络被认为是一个支持内部导向认知过程的基本大规模脑网络，这些过程包括自我参照思维、自传体记忆以及对未来事件的规划^2,3。在人类中，典型的DMN由一系列解剖上相互连接的核心脑区组成，包括内侧前额叶皮层（mPFC）、后扣带皮层（PCC）、下顶叶小叶（IPL）以及海马结构⁴。该网络的功能异常是多种神经精神疾病的关键特征。在重度抑郁症（MDD）中，DMN通常表现出过度活跃以及功能连接模式的改变，这些变化被认为构成了MDD核心症状的神经基础，例如反刍思维和负面自我认知^5,6。

为了研究驱动默认模式网络（DMN）功能障碍的细胞与环路机制，可靠的动物模型不可或缺。在啮齿类动物中已可靠地鉴定出同源的默认模式网络（DMN），其包含与人类相似的脑区，如内侧前额叶皮层（mPFC）、扣带皮层和后顶叶皮层（RSP），从而验证了小鼠作为机制研究具有转化相关性的模型^7,8。此外，慢性应激作为抑郁症的关键因素，已被证明会以类似于人类重度抑郁症（MDD）患者的方式改变啮齿类动物DMN的连接性⁹。

理解疾病状态或长期治疗干预所引发的神经可塑性变化，需要对神经活动进行纵向观察，因为单次记录无法捕捉神经回路随时间推移发生的动态适应过程¹⁰。In vivo 电生理技术能够提供毫秒级的时间分辨率，适用于研究局部场电位（LFP）中的神经振荡与同步性。LFP反映的是局部神经元群体同步化突触活动的总和性细胞外信号，是神经网络通信的基本基础^11,12。然而，在清醒小鼠中开展长期、大规模的电生理记录仍面临较高的技术挑战。传统的慢性颅窗最初是为清醒小鼠的光学成像而设计的，至今仍是该用途的标准制备方法，其典型的单半球覆盖范围和透明玻璃盖片结构非常适合相应的光学检测需求¹³。然而，这些颅窗并非为清醒状态下的多部位电生理记录而设计，其操作空间和光学界面限制了对分布式双侧网络节点（如默认模式网络DMN）进行同步高密度记录的能力¹⁴。相比之下，慢性电极植入虽可实现长期记录，但会引发进行性的异物包裹反应及胶质瘢痕形成，导致永久固定电极周围组织反应加剧，随时间推移信号质量逐渐下降^15,16。

本文所述的两阶段外科手术方法直接解决了这些局限性。该方法可制备一个较大且可重复密封的颅窗，在实验间期通过被动的聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜、硅胶密封剂以及一个3D打印的盖帽封闭，从而允许多次非终末性地插入µECoG网格，用于中尺度局部场电位（LFP）记录，同时结合多个高密度颅内电极探针，实现微尺度、层析解析的单神经元及LFP活动记录^17,18。与以往的慢性记录方法相比，该方法具有显著优势：先前的方法要么依赖永久植入的电极阵列，随着时间推移电极周围会逐渐形成胶质包裹，要么需要终末性的急性开颅手术，无法支持纵向研究设计。而本文所述的颅窗技术可保持硬脑膜完整，并避免长期异物接触^15,16,18。此外，在一个验证队列中，颅窗在术后第0、21和22天共三次重新打开但未进行电生理记录，其胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和钙离子结合接头分子1（IBA1）的定量免疫反应性与非手术对照组相比无显著差异，表明在本研究所采用的重复开窗方案下，星形胶质细胞活化和小胶质细胞活化程度较低。该方法特别适用于在清醒、头部固定的实验小鼠中，对包括默认模式网络（DMN）在内的分布式皮层网络进行纵向、多部位记录，同时结合高密度颅内电极探针对深层结构进行层析解析的记录。其主要操作限制在于：需要熟练的显微外科技术以可靠地保留硬脑膜并移除骨瓣，且由于高密度颅内电极探针需要头部固定，因此无法与自由活动记录兼容。

方案

所有动物实验均经芬兰国家动物实验委员会批准（许可证号：ESACI/40845/2022），并严格遵循欧洲议会关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63/EU以及芬兰关于实验动物护理和使用的国家指南进行。

注意：所有外科手术均在层流手术罩内进行，该罩已通过紫外线照射（至少15分钟）或彻底的乙醇表面去污预先灭菌。异氟烷废气由安装在罩内的活性炭吸附系统收集。操作者佩戴一次性头罩、外科口罩、长袖实验服以及单层非无菌丁腈检查手套（进入罩前用80%乙醇喷洒）。在罩内放置锐器废弃物容器，用于立即丢弃手术刀片和皮下注射针头。

1. 术前准备与麻醉

1. 使用 C57BL/6JRj 小鼠，年龄至少 10 周，体重超过 20 g。
2. 手术前，在温热的超声波清洗槽中清洁所有器械，冲洗、干燥后，用 70% 乙醇浸泡至少 15 分钟。
3. 或者，在使用前通过玻璃珠或红外灭菌器短暂灭菌器械。不使用无菌手术单。在同一手术批次中连续处理动物之间，应将器械放回乙醇中浸泡至少 2 分钟¹⁹。
4. 使用校准天平单独称量每只小鼠，并计算术前用药的体积。
5. 提前准备无菌 PDMS 膜（每批仅需一次，非急性手术当天进行）。
   1. 根据制造商说明，将弹性体与固化剂按 10:1 比例混合，制备无菌 PDMS 膜；将未固化的混合物夹在两片平整的硼硅酸盐玻璃板之间，控制厚度约为 500 µm，随后在 60 °C 下固化至少 2 小时。
   2. 将固化后的膜片密封于高压灭菌袋中，通过蒸汽高压灭菌法进行灭菌。在预灭菌的手术罩内，使用无菌 #11 手术刀和小型不锈钢直尺，将每张膜片切割成与颅窗尺寸匹配的矩形膜片。
   3. 将预切好的膜片储存于无菌实验器具中（例如 6 孔细胞培养板的各个孔内），直至使用。
6. 每次记录前执行硬件质量控制。
   注意：不对 µECoG 阵列进行常规阻抗检测：参考导线故障在原始信号轨迹中易于识别，仅在怀疑存在硬件问题时才进行阻抗测试。高密度颅内电极探针内置阻抗和电缆完整性诊断功能，可通过记录软件的图形用户界面访问；当信号质量明显下降时，应运行这些诊断程序。

2. 第一阶段：动物准备与头固定板植入

1. 动物准备
   1. 使用异氟烷麻醉小鼠（诱导浓度：4%，维持浓度：1.5−2.5%，氧气流速为 0.5 L/min）。通过夹趾反射消失确认麻醉深度。
   2. 剃除头部顶部的毛发，范围大致从眼睛至颈部。
   3. 将动物置于配备内部温度传感器的反馈控制加热垫上，校准以在整个操作过程中维持体温在 37 °C。涂抹卡波姆眼膏以防止角膜干燥。
   4. 使用无损伤耳杆将小鼠固定在立体定位仪中。调整门齿杆，使颅骨保持水平，前囟（bregma）与后囟（lambda）处于相同的背腹高度（平颅位）。通过鼻罩输送异氟烷（1.5–2.5%），氧气流速为 0.5 L/min，维持麻醉状态。
   5. 通过皮下（s.c.）注射给予术前镇痛药和抗炎药物：卡洛芬（5 mg/kg）、丁丙诺啡（0.05 mg/kg）和地塞米松（2 mg/kg）。
   6. 使用聚维酮碘溶液对剃毛区域进行消毒。
   7. 在头皮皮肤下皮下注射利多卡因-肾上腺素溶液作为局部麻醉剂。
2. 暴露颅骨
   1. 在耳线处做一个小的横向切口（约 1 cm）。
   2. 逐步向两侧延伸切口，绕过耳朵并向头部两侧延伸至眼睛附近，但不要超过眼睛位置。再在每侧向中线方向做对角线切口，完成暴露，使整个背侧颅骨表面完全暴露。
3. 清洁颅骨
   1. 使用实验室级丙酮仔细清洁暴露的颅骨。将无菌棉签浸入丙酮中，去除多余溶剂（防止滴落到周围组织），然后涂抹于骨面，直至所有可见的骨膜组织被完全清除。
   2. 使用丙酮以溶解骨表面的脂肪残留物和顽固的膜状残留物，而非作为消毒剂。
      注：彻底清除骨表面的骨膜和脂质残留物，对于头固定板和牙科水泥的牢固粘附至关重要。由于植入物必须承受清醒小鼠产生的机械应力，任何在骨粘合界面残留的骨膜或脂膜都会成为主要的失效点。
   3. 使用钝头显微外科（圆形）刀片清除丙酮清洗未能完全溶解的残留骨膜和结缔组织碎片。将刀片与骨面呈约 45° 角，从前囟–中线交界处向外侧边缘方向，以轻柔的放射状刮擦动作清理颅骨。
   4. 持续操作，直至整个暴露的骨面至少被清理一遍，并呈现均匀洁净、无光泽的外观。
   5. 最后使用棉签蘸取丙酮进行一次短暂的最终清洁。
4. 标记开颅位置
   1. 将生物相容性外科皮肤标记器连接至数字立体定位臂上。
   2. 相对于前囟，在颅骨上标记一个 4 mm × 7.6 mm 的矩形区域。
      1. 将标记笔尖移动至前囟位置，并将数字读数的 X 和 Y 坐标重置为零。
      2. 移动定位臂至计划窗口的四个角点，使该矩形在前囟两侧各向外 2 mm，向前（吻侧）3 mm，向后（尾侧）4.6 mm，并在每个角点标记一个点。
5. 在右侧半球标记两个颅内探针插入位点。
   1. 在前囟前 1.66 mm A/P、外侧 1.95 mm M/L 处标记吻侧探针位点。
   2. 在前囟后 -2.2 mm A/P、外侧 1.9 mm M/L 处标记尾侧探针位点。
      注：这些位点经过调整以靶向默认模式网络（DMN）特异性区域。本方案中可调整插入位点以适应多个不同脑区。
   3. 从立体定位臂上取下标记器。
   4. 将已灭菌的柔性直边工具（例如薄塑料卡片）贴紧颅骨，用标记笔连接四个角点，勾勒出未来开颅窗的连续矩形轮廓。
6. 增加粘附表面积以提高结合强度
   1. 在双目显微镜下完成本节第 4 步之前的所有操作。
   2. 使用 #11 外科刀片在指定窗口区域外的所有暴露骨面上刻划交叉网格，形成深度为 0.2–0.4 mm 的浅但清晰的沟槽，构成约 1 mm × 1 mm 的均匀方格。
      注：此操作可增加有效表面积，从而增强覆盖粘合剂和牙科水泥的机械抓握力。
   3. 将无菌 30 G 针头安装在长颈棉签末端，并将针头弯成 V 形，制成精细的胶水涂布器。
   4. 将氰基丙烯酸酯胶水滴入一次性塑料称量皿中，并将涂布器浸入胶水储备液中。
   5. 将胶水均匀涂布于所有暴露且已刻划的骨面，每个位置仅涂一次，确保覆盖全面但不过量。静置干燥 7 分钟。
7. 植入参考电极插座
   1. 选择左侧小脑上的钻孔位点，避开可见的浅表血管。
   2. 将牙科钻头安装至立体定位臂上的钻头夹持器中。
   3. 使用圆形钢制磨头以 20,000–25,000 RPM 转速，分 5–10 秒间歇进行钻孔，每次间歇后撤回钻头，在双目显微镜下检查钻孔部位。
   4. 持续钻孔，直至孔位变得较透明，呈现淡粉色，并可通过变薄的骨层观察到硬脑膜。
   5. 此时立即停止钻孔，避免穿透硬脑膜。最终孔径约为 0.5 mm，仅略大于参考插座的外径。
   6. 将镀金参考插座插入导孔中，用氰基丙烯酸酯胶水固定，并使用紫外光固化牙科水泥加强连接处。用 405 nm 发光二极管（LED）固化笔照射 1 分钟，使牙科水泥固化。
8. 植入头固定板
   1. 在暴露的吻侧骨面顶端（最靠近鼻部的点）放置少量紫外光固化牙科水泥，作为调平支撑。
   2. 将头固定板放置于颅骨上，使其一端搭在围绕参考插座已固化的牙科水泥支架上（步骤 2.7.6），另一端搭在新施加的吻侧水泥点上。
   3. 调整头固定板，使其长轴与矢状中线对齐，两个固定手柄垂直（90°）于中线轴。在紫外光下固化复合材料，以锁定头固定板位置。
   4. 通过在头固定板基部周围逐层施加约 1 mm 厚的紫外光固化牙科水泥，环绕已刻划的骨面和参考插座，逐层加固结构，直至在未来的开颅窗周围形成连续、密封的封闭结构。
   5. 每次施加后，使用 405 nm LED 固化笔在 1–2 cm 工作距离下分别照射 40 秒，确保完全聚合后再施加下一层。确保最终的水泥壁与头固定板上表面齐平，并完全封闭暴露骨面的边缘，但不覆盖已标记的窗口区域。
9. 让小鼠从麻醉中恢复。将小鼠送回其饲养笼中至少 48 小时。
10. 在进入第 3 节之前，确认动物体重已恢复至术前体重的 95% 以内，且在小鼠面部疼痛评分量表上无疼痛表现²⁰。若任一标准未满足，则延长恢复期直至达标。
    注：本方案采用分阶段设计并设置手术间恢复期至关重要。这允许动物在开颅手术前从初始的生理应激和炎症中恢复，已被证明可提高手术成功率和植入物的长期健康状况；本方案采用至少 48 小时恢复期，已有研究表明，在头固定板固定与开颅手术之间设置多日恢复间隔的分阶段颅内植入可减少围手术期炎症并改善长期准备质量¹⁴。

3. 第二阶段：慢性颅窗制备

1. 术前准备
   1. 按照第1节所述准备手术区域和器械。
   2. 使用异氟烷对小鼠重新进行麻醉（诱导浓度4%，维持浓度1.5–2.5%）。
   3. 按照步骤2.1.4所述，将小鼠固定于立体定位仪中。
   4. 按照步骤2.1所述剂量给予术前药物，但无需使用利多卡因-肾上腺素局部麻醉剂（在A阶段已去除头皮皮肤，因此不再适用）。
2. 钻窗
   1. 使用牙科钻头沿第1阶段（步骤2.4）标记的矩形轮廓开始磨薄颅骨。起始转速为25,000 RPM，钻头装置垂直（≈ 90 °）于骨面，沿矩形边缘进行一至两次略深的划过，以形成初始切割沟槽。
      注意：起始钻速可根据操作者的熟练程度进行调整。
   2. 在颅窗两侧探针插入坐标点（步骤2.5标记处）附近的颅骨和牙科水泥上钻出沟槽（深度约0.2–0.3 mm）。
      注意：这些沟槽作为持久的视觉标志，在骨瓣移除后仍可见，用于在后续电生理实验中可重复地准确定位颅内探针。
   3. 在整个钻孔过程中定期滴加冰冻无菌人工脑脊液（ACSF；按Goldey等¹⁴所述含头孢唑林的配方配制），以防止下方皮层的热损伤并减少出血¹⁴。
   4. 随着骨层变薄，逐步将钻速降低至20,000 RPM，并将手柄倾斜至≈ 45°，使操作者可用手稳定钻头，过渡到更轻柔、更可控的操作手法。
3. 移除骨瓣（关键步骤）
   1. 沿矩形轮廓继续钻孔，直至轮廓内骨层约90%被磨薄。切勿完全钻透颅骨。
   2. 通过以下两种互补方法确认剩余骨层厚度：
      1. 在双目显微镜下，用钝器轻轻敲击磨薄骨架的边缘。轻敲引起的变形幅度可直接反映残余骨层厚度。
      2. 将冰冻ACSF滴加至钻孔区域，立即通过双目镜观察：在ACSF渗透骨层前的最初20–30秒内，液层显著增强视觉对比度，使骨层接近硬脑膜处的下方皮层毛细血管清晰可见，而骨层较厚区域在液体下仍相对不透明。当骨瓣整体呈现均匀半透明且明显可活动时，进入步骤3.3.3。
   3. 更换为末端呈90°弯曲的精细弧形硬脑膜钩。以约15°角极其谨慎地将钩尖插入磨薄骨边缘下方，沿窗周滑动钩子，小心地将骨瓣从周围颅骨和下方组织分离。
   4. 从两侧的侧缘开始，依次从一个角推进至另一角，最后从各角向矩形中心推进，直至整个周缘与下方硬脑膜完全分离。
   5. 滑动过程中切勿对硬脑膜钩施加向下的压力，避免接触脑组织。
      注意：以浅角度交替操作对角的角点，可使机械应力在骨瓣周围均匀分布。该策略可防止硬脑膜撕裂，并保护下方脑组织的长期健康。
   6. 若钩子在任一角点遇到局部阻力，切勿强行推进。应先降低骨瓣，返回步骤3.4进一步磨薄粘连区域。
      1. 若发生硬脑膜撕裂，应终止该动物的手术操作（表现为突然的局部隆起、粉红色液体渗出，或在用冰冻ACSF冲洗头帽腔室三次、每次停留30秒后仍不消退的鲜红色动脉出血）。
         ​注意：成功分离的标志是骨瓣在整个周缘均匀活动，无明显硬脑膜隆起，仅伴有轻微毛细血管出血。
   7. 用硬脑膜钩将已成功分离的骨瓣小心地以从后向前的方向抬起，抬高至颅骨表面约35°。
   8. 用镊子夹住抬起的边缘，轻轻左右摇晃，直至骨板完全脱离。若任一角点存在阻力，应将骨瓣放回原位，返回步骤3.3.4进一步磨薄粘连区域后再尝试移除；此类阻力提示局部骨层磨薄不足。
   9. 用反复滴加冰冻ACSF的方法，轻柔清除暴露区域的凝血块。
   10. 继续操作前，确认硬脑膜完整且透明。
       注意：从后缘缓慢、逐步抬起至关重要，以最大限度降低对下方上矢状窦、横窦及皮层表面的损伤风险。
4. 封闭颅窗
   1. 待出血停止后，将一片无菌预制的PDMS膜（按第1节制备）直接放置于硬脑膜表面。若尺寸合适，膜将精确覆盖颅窗，并被动贴附于硬脑膜，使其平整贴合脑组织。
   2. 用无纤维擦拭纸吸除颅窗边缘残留的ACSF。
      注意：擦拭纸绝不可接触暴露的硬脑膜，且必须全程保持严格的无菌操作（无菌操作者、工具和术区），因为颅窗将在后续实验中反复打开，此步骤引入的任何污染都将影响后续的纵向记录。
   3. 按照制造商说明配制双组分硅橡胶弹性密封剂，并在混合后30秒内涂抹，填充牙科水泥围挡与头帽内缘之间的所有缝隙，完全包围并覆盖PDMS膜边缘。
   4. 让弹性密封剂固化约2分钟（或按制造商指定时间）。确保固化后的密封层连续、不透液体，但在每次记录开始时仍可机械移除。
   5. 用少量氰基丙烯酸酯胶水将定制的3D打印保护帽固定于头帽上，以保护记录间期的颅窗。
   6. 让小鼠从麻醉中恢复，并将其放回单独饲养的笼中，防止植入物受损。

4. 术后护理与适应

1. 术后至少密切监测小鼠健康状况2天。若根据小鼠面部表情评分量表²⁰判断小鼠出现疼痛迹象，应于术后2天内追加皮下注射镇痛剂。
2. 术后至少让小鼠不受干扰地恢复4天。随后开始为期5天的习惯化训练，逐步延长适应时间：第1天5分钟，第2、3、4、5天分别为15、30、45和60分钟，以使小鼠适应操作及头部固定记录平台。
   注意：已知开颅术后组织水肿和局部炎症可持续长达两周²¹。若实验时间允许，建议在首次记录前延长恢复期。在首次记录前，应通过双目显微镜确认颅窗清晰透明，无浑浊或纤维组织形成，且动物体重与行为正常。

5. 纵向电生理记录的操作步骤

1. 将动物放置于记录平台
   1. 将小鼠置于记录平台上，并引导小鼠头部固定夹。确保夹具高度已预先调整，以在头部固定期间保持动物自然站立姿势。
      注意：若小鼠持续抗拒头部固定，切勿强行操作。应将动物放回其饲养笼，并在重新尝试固定前延长适应期（第4节）一至两个额外训练阶段。
   2. 拧紧夹具的锁紧螺丝。
   3. 使用前立即将钝头显微外科环形刀片浸入80%乙醇中。
   4. 将刀片插入3D打印保护帽与头板上表面之间，保持刀片几乎与头板表面平行。为避免接触脑组织，切勿将刀片推进至头板开孔内缘之外。
      注意：保护帽采用透明树脂打印，以便全程观察刀片插入深度。
   5. 通过轻柔的左右晃动动作沿保护帽边缘逐步分离粘合层。
   6. 使用精细解剖镊子从尾侧向头侧缓慢抬起并移除保护帽。
   7. 握住硅胶弹性密封圈的外缘，从尾侧向头侧缓慢提起。弹性密封圈与下方的PDMS膜将作为一个整体完整剥离，暴露出完整的硬脑膜。
   8. 通过滴加数滴人工脑脊液（ACSF）保持脑组织湿润。
2. 放置记录装置
   1. 将µECoG阵列安装至带磁性底座的万向臂上；根据操作者经验调节万向臂的摩擦旋钮，经验丰富的操作者通常选择低摩擦设置，以便在定位过程中保持精细的运动控制。
   2. 引导阵列使其电极面垂直（90°）落于颅窗右侧边缘的皮层表面；定位满意后，拧紧摩擦旋钮以固定万向臂。
   3. 使用尖头硅胶压接工具轻敲阵列的扁平带状电缆，使其向下贴合至头板上表面，使电缆卡入头板轮廓，同时阵列本身平整贴附于硬脑膜，残余ACSF提供被动粘附。由于颅窗尺寸设计为仅允许双子阵列以单一方向置入，粗略对齐可直观判断。
   4. 使用硅胶工具进行最终微调，横向轻推阵列直至矢状中线清晰位于半透明阵列中央。
      注意：半透明µECoG网格可透显矢状窦，作为明确的解剖学对齐标志，使纵向多次记录中可重复实现相同的横向偏移量。阵列定位覆盖前扣带皮层（ACC）双侧前半部分及后压部皮层（RSP）双侧后半部分，涵盖本研究靶向的默认模式网络（DMN）节点。开源分析工具包（ephy_spatial_fidelity-toolkit，获取地址：https://github.com/RazBalin/ephy_spatial_fidelity-toolkit）可量化多次记录间网格放置的偏移。
   5. 将µECoG参考导线连接至第2.7步植入的镀金参考插座。
      注意：作为可选的记录前质量控制检查，可将探头与阵列浸入50 mL锥形管的ACSF中进行短暂记录，以确认法拉第笼在开始in vivo记录前能有效屏蔽环境电磁干扰。
   6. 将尾侧高密度颅内电极探针置于垂直（≈90°）于脑表面的微操纵臂上，头侧高密度颅内电极探针置于第二臂上并倾斜50°。
   7. 在双目显微镜下，将每个探针推进至硬脑膜上方约1 mm处，并将每个探针的Y轴与第3.2.4步铣削的刻痕导槽对齐。
   8. 通过双目镜观察并以书面记录或拍照方式，记录µECoG电极网格紧邻各探针预定穿刺点的位置。
      注意：当手术操作正确且无皮层水肿时，骨缘与µECoG阵列间距极小，使穿刺点选择明确无误。为实现纵向多次记录的最大空间精度，应在阵列就位后拍摄暴露皮层照片，并在骨缘与µECoG阵列之间的狭窄区域识别一条特征性软脑膜血管。该图像标注参考血管及其相对于µECoG电极垫的位置，可作为后续记录日重复穿刺点的会话间参考图谱。
   9. 记录探针-电极垫对应关系后，将各探针向上回撤约15 mm，以在硬脑膜穿刺过程中保护脆弱的电极杆。
   10. 通过将无菌30 G皮下注射针固定于棉签 applicator 尖端，并用无齿精细镊子将针尖弯成90°，制备硬脑膜穿刺工具。
   11. 缓慢引导穿刺工具越过头板。通过双目镜观察，计数µECoG电极垫以对齐工具与记录的穿刺坐标。将弯曲针尖降至硬脑膜表面，使切割端以90°接近硬脑膜，同时保持工具杆部与小鼠背部长轴平行。
   12. 将针尖推进至硬脑膜平面下约1 mm后回撤。穿刺处可能出现轻微短暂出血；用非纤维擦拭纸的卷角吸干。
   13. 穿刺后立即在持续双目镜观察下，将每个高密度颅内电极探针降至硬脑膜表面。若穿刺位置精确，探针将无偏转地顺利通过穿刺孔。
   14. 以约0.1 mm/s或更慢的受控速度，逐步将每个探针下降至硬脑膜下5 mm的目标深度²²。
   15. 开始数据采集前，让探针机械稳定10分钟。
       ​注意：30 G针头造成的微小硬脑膜穿孔数分钟内可自行闭合；因此，探针插入必须紧随穿刺立即进行。
3. 数据采集
   1. 开始数据采集。
      注意：µECoG信号由四个128通道数字头戴放大器通过SPI接口电缆连接至开源采集板进行放大，而两个高密度颅内电极探针则通过专用高密度探针采集模块获取，该模块与多功能输入/输出及数据采集模块共同置于模块化仪器机箱中用于同步与数字信号传输。开源µECoG采集板生成公共TTL主时钟，并通过多功能I/O模块作为硬件同步线分发至探针采集机箱，使两个采集流共享采样对齐的时间基准。所有数据流均通过采集系统图形用户界面同步记录；完整硬件型号与目录编号列于材料表中。
   2. 记录会话结束时，向µECoG网格滴加0.5 mL ACSF，随后以插入时相同速度（≈6 mm/min）回撤各高密度颅内电极探针，并轻柔移除µECoG阵列。
   3. 将探针与阵列浸入新配制的1%（w/v）酶性洗涤剂溶液中45分钟进行清洗。
   4. 酶性洗涤剂浸泡后，使用反渗透纯化水连续浸洗三次，每次使用新试管。
   5. 按第3.4.1步操作，更换为新的无菌PDMS膜。
   6. 重新涂抹弹性密封剂（第3.4.3–3.4.4步），并固定新的3D打印保护帽（第3.4.5步）。
   7. 将重新密封的组件在空气中干燥5分钟后，将小鼠放回其饲养笼。该操作可在数周内重复进行多次记录会话。

结果

成功的手术会在大脑皮层上形成一个清晰透明的观察窗，能够清晰看到血管结构，且炎症或感染迹象极轻微。这种清晰状态可维持超过21天（图1），从而支持长期的纵向研究。该植入装置的稳定性已在为期21天的慢性皮质酮给药实验范式中得到验证，后者是诱导啮齿类动物抑郁样状态的常用模型^10,23,24。这证实了该方法适用于慢性疾病建模研究。

通过慢性窗记录的原始电生理信号在纵向时间线上保持高质量。在图2中，并列展示了来自后部压后皮层网格的代表性宽带µECoG信号，以及来自浅层皮层通道的颅内探针局部场电位信号，分别对应首次记录日（第0天）和21天后（第21天）的数据。第21天的记录显示，与同一只动物第0天的记录相比，信号幅度、频谱内容以及运动和噪声伪影的缺失程度均具有可比性，证实了PDMS膜和硅胶密封...

讨论

本报告详细描述了一种两阶段、保留硬脑膜的外科手术方案，该方法可可靠且高效地在小鼠中创建一个大尺寸、慢性且可重复密封的颅窗。该技术的重要性不仅在于颅窗的尺寸，其主要优势在于能够对大规模脑网络进行跨时间的同步、多尺度研究。通过结合表面微电皮层脑电图（µECoG）网格（提供中尺度局部场电位数据）与深部高密度颅内电极探针（提供微尺度、层析解析的单神经元及局部场电位数据），研究人员可直接探究特定环路活动（例如默认模式网络深部节点内的活动）如何影响皮层上所观察到的网络层级动态的形成。此外，该方法适用于任何大规模脑网络研究，因其可实现对小鼠大脑大部分区域的访问。

该方案的成功依赖于两个关键方面。首先，将手术分为两个阶段，并以48小时的恢复期相隔，是一项至关重要的设计选择。这一策略可最大限度地减少动物所承受的累积生理应激，降低急性炎症反应，并在更具侵入性的开颅手术之前允许组织初步愈合。经验表明，这种分阶段的设计能够提高长期植入物健康存活的可靠性，与已发表的小鼠分阶段颅骨植入方案一致¹⁴。其次，保留硬脑膜的开颅技术是整个操作中最关键的一步。通过将颅骨磨...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
µECoG 阵列 — 512通道定制（2 × 256 ch	NeuroNexus	E256-200-30-80	包装：IH256。两件16×16 个子网格（每个 3.3 mm） × 3.5 毫米；200 μm 螺距；80 μm电极直径。表面水平DMN记录。
三轴左手显微操作臂	世界精密仪器公司（WPI）	504926	10 μ微米级分辨率；数字显示；用于手术过程中头板/探针的定位
3D打印防护帽	自研（Anycubic Photon Mono 4K）	N/A	定制设计；使用 Anycubic High Clear UV 树脂打印；STL 文件可从 https://github.com/RazBalin/ProtectiveDMN_Cap 获取
丙酮（分析纯）	Sigma-Aldrich	179973	粘合剂涂覆前的颅骨表面脱脂与骨膜去除
Adson 硬脑膜钩（5 mm，精细硬脑膜钩）	gSource	gS 25.2570	用于沿边缘将骨板从硬脑膜剥离；由细钨丝或类似材料制成
Anycubic 高透UV树脂	Anycubic	STMGCL-102B	使用 Anycubic Photon Mono 4K 打印机制作 3D 打印防护帽所用的光聚合物树脂
Anycubic Photon Mono 4K 光固化3D树脂打印机	Anycubic	PHOTON-MONO-4K	用于使用 Anycubic 高透树脂打印防护窗帽
Anycubic UV 树脂清洗液 & Cure Machine 2.0	Anycubic	285-550	3D打印帽状物的打印后清洗与紫外线固化
带磁性底座的关节臂×2)	哈斯工装	09-0535	用于固定 µ记录期间置于皮层表面的ECoG子网格
人工脑脊液（aCSF）	内部制备	N/A（内部）	aCSF 配方：124 mM NaCl，3 mM KCl，26 mM NaHCO₃3，2 mM CaCl2，1 mM MgSO₄4，1.25 mM KH2PO4，10 mM D-葡萄糖；用95% O₂供氧2 / 5% CO₂2 制备后立即使用。目录编号单独列出。
钝头显微手术刀（环形手术刀）	Iogen	374769	用于颅骨表面刮除和帽状腱膜去除
布托啡诺（Temgesic）	Indivior	BE-112515	阿片类镇痛药；术前皮下注射 0.05 mg/kg
C57BL/6JRj 小鼠	Janvier Labs		雄性或雌性；至少10周龄 >手术时体重20 g
二水合氯化钙（CaCl₂）2·2H2O	Sigma-Aldrich	C-7902	2 mM；分子量 147.02；0.29 g/L。以 Ca 形式配制 ×100倍浓缩液。自制aCSF的组分。
卡洛芬（Rimadyl）	硕腾动物保健	RXRIM-INJ	非甾体抗炎镇痛药；术前皮下注射 5 mg/kg
皮质酮	Sigma-Aldrich	C2505	溶于饮水中用于21天慢性应激/抑郁症模型
棉签	Fisherbrand	22-363-157	作为30 G硬膜穿刺装置的手柄，并用于丙酮脱脂颅骨表面
氰基丙烯酸酯胶水 — Loctite 401	亨克尔粘合剂	Loctite 401	低黏度氰基丙烯酸酯；用于颅骨表面预处理、头固定板和帽固定
牙科钻头 — Foredom K.1070	Foredom	K.1070	柔性轴旋转钻；用于开颅减薄和导孔钻孔
地塞米松	Dopharma	1DEX004	皮质类固醇抗炎；术前皮下注射 2 mg/kg
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G-7021	10 mM；分子量 180.20；1.80 g/L。以葡萄糖配制 ×100倍浓缩液。自制aCSF的组分。
钻头 钢制圆钻 1/007W	Hager &和 Meisinger	18089	用于参考位点和颅窗
80% 乙醇（v/v）- A12t Dilutus	Berner	13221132	手术器械及手术层流罩术前浸泡消毒
气体抽排装置	RWD生命科学	R546W	清除手术区域的废气麻醉气体
镀金参考电极插座	DigiKey	310-13-102-41-001000	植入左侧小脑；用作皮层脑电图（ECoG）的接地/参考电极
GRANT 超声波清洗机 — Model 17002A	GRANT Instruments	17002A	EAN: 4064343191654。热水超声波清洗机；与 TICKOPUR TR 3 配合用于器械清洗
加热垫 — Supertech TMP-5B	Supertech	TMP-5B	保持体温在37 °麻醉期间持续监测 C
异氟烷	Piramal Healthcare	66794-017-25	吸入麻醉剂；诱导 4%，维持 1.5%–2.5%
Kimtech Science 精密擦拭纸（无纤维组织）	金伯利·克拉克	7552	使用尖头工具吸干残留的ACSF，并辅助PDMS膜与硬脑膜粘附
Kwik-Cast 无菌弹性密封剂	世界精密仪器公司（WPI）	KWIK-CAST-s	型号：KWIK-CAST-S。生物相容性硅胶；用于在PDMS膜周围形成可移除的密封。
LED 紫外固化笔 405 nm	CureUV	514424-405	用于种植过程中固化紫外激活的牙科粘接剂（Total C-Ram）
利多卡因-肾上腺素溶液	Orion Pharma	05 10 31	局部麻醉；皮下注射至头皮皮肤下方
七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）4·7H2O	Sigma-Aldrich	M-7774	1 mM；分子量 246.48；0.25 g/L。以 Mg 形式配制 ×100倍浓缩液。自制aCSF的组分。
金属头板 — Neurotar Model 13	Neurotar	模型 13	钛合金头颅固定板；圆形开口，直径11 mm；使用氰基丙烯酸酯和牙科水泥固定于颅骨
NeuroNexus 头戴式适配器	NeuroNexus	定制 IH256 64×4 Molex	定制适配器板；夹层式结构 µ两个Intan RHD 128通道头戴装置之间的ECoG子网格
Neuropixels 1.0 探针配金属帽（×2)	IMEC	PRB_1_4_0480_1_C	960 个记录位点；10 mm 探针柄。一个探针靶向海马-丘脑-视觉皮层柱，另一个靶向内侧前额叶皮层（mPFC）柱
NI PXIe-1083 机箱	国家仪器公司	PXIe-1083	9槽PXI Express机箱，用于容纳Neuropixels模块和NI DAQ数据采集卡
NI PXIe-3839 多功能 I/O 模块	国家仪器公司	PXIe-3839	安装于NI PXIe-1083机箱中；用于同步和辅助I/O
NI PXIe-6363 多功能数据采集设备	国家仪器公司	PXIe-6363	安装于 NI PXIe-1083 机箱；用于同步的模拟和数字 I/O
Nova 微型焚烧炉  红外线灭菌器	Argos Tech	S3022	用于可能接触暴露脑组织的任何器械的快速灭菌
奥林巴斯SZ51体视双目显微镜	Olympus	SZ51	手术可视化；贯穿开颅和植入步骤使用
Open Ephys 采集板（One Box，第一代）	Open Ephys	OEPS-9029	接收 µ通过 SPI 传输的 ECoG 数据流；开源硬件。参见 open-ephys.org
Open Ephys GUI	Open Ephys	N/A（开源）	免费、开源的电生理数据采集软件。可访问：open-ephys.org
氯化钾（KCl）	Sigma-Aldrich	P-5405	3 mM；分子量 74.55；0.22 g/L。自制 aCSF 的组分。
磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)	Sigma-Aldrich	P-5655	1.25 mM；分子量 136.09；0.17 g/L。自制 aCSF 成分（Klebs ×10 倍浓缩储备液。
聚维酮碘溶液（BETADINE）	武田	45 70 28	用于手术区域准备的局部消毒剂
PXIe 采集模块	Neuropixels	PXIE_1000	用于Neuropixels 1.0数据采集的PXI格式模块；安装于NI PXIe-1083机箱
参考插座连接器	DigiKey	342-10-102-00-591000	与上述参考插座配套的配对连接器；请与 DigiKey 确认部件号
RHD 128通道头戴式装置（×4)	Intan Technologies	RHD 128	每两个头级 µECoG 子网格；确认型号（例如 RHD2132 或 RHD2164）
RHD SPI 接口电缆，0.9 m	Intan Technologies / Open Ephys	C3203	标准SPI电缆，用于连接RHD前置放大器与Open Ephys数据采集盒
RWD 空气泵	RWD生命科学	R510-29	为麻醉回路提供气流
RWD 动物麻醉蒸发器	RWD生命科学	R5835	用于麻醉诱导与维持的精密异氟烷蒸发器
11号手术刀片	Swann Morton	SM0103	用于在颅骨表面雕刻交叉纹路，以增强粘附力
小型动物毛发修剪器 - GT416	Aesculap Schermaschinen GmbH	D-98528H	用于手术前修剪动物头皮
碳酸氢钠（NaHCO₃）3)	Sigma-Aldrich	S-5761	26 mM；分子量 84.01；2.18 g/L。自制 aCSF 的组分。
氯化钠（NaCl）	Sigma-Aldrich	S-5886	124 mM；分子量 58.44；7.25 g/L。自制 aCSF 的组分。
SOL-M（无菌皮下注射针头 30 G）	Sol-Millennium Europe	113005	弯曲 90° 在尖端固定于棉签上，以制备硬脑膜穿刺装置
标准操作臂，三轴左侧（Stoelting）	斯托尔廷公司	51604	用于记录过程中插入 Neuropixels 探针
标准操作臂，三轴右侧（Stoelting）	斯托尔廷公司	51606	用于记录过程中插入 Neuropixels 探针
立体定向架 — RWD F67001	RWD生命科学	F67001	标准立体定位仪；用于头部固定和基于坐标参考的植入物放置
带尺规的外科标记皮肤笔（紫色墨水）	Fannin	SM0372	基于龙胆紫的生物相容性外科皮肤标记剂，用于在骨面上标出计划开颅区域及植入物轮廓。该标记剂耐受氰基丙烯酸酯底涂剂（Loctite 401）处理，在颅骨脱脂和头固定板安装过程中仍保持清晰可见，可实现立体定位坐标的可靠转移至骨表面。
SYLGARD 184 硅弹性体试剂盒（PDMS）	陶氏（德国）	1673921	聚二甲基硅氧烷；浇铸成薄层（<1 mm）膜；置于硬脑膜表面以保护大脑
Tergazyme 酶清洁剂	Alconox	1304-1	使用1%（w/v）蛋白酶清洁剂溶于温热的反渗透水中，用于实验后电极清洗（浸泡45分钟，随后用纯化水冲洗三次）。
Total C-Ram Automix UV 牙科粘固剂（白色）	Itena	R301950	模型：TTCRAM-BLC；紫外光固化牙科树脂；用于头固定板加固和套管固定
超声波清洗液（TICKOPUR TR 3）	Dr. H. Stamm GmbH	TR-3-913	柠檬酸基浓缩液；用于超声波清洗机中术后器械的清洗
维适泰滴眼凝胶 2 mg/g	爱尔康	503849	基于卡波姆的润滑性眼膏；麻醉期间用于角膜以防止干燥
蔡司 KL1500 LCD 冷光源	卡尔·蔡司	KL1500 LCD	用于手术区域的光纤冷光源照明；可防止热损伤