大型可重新封闭颅内窗的手术方案，支持小鼠默认模式网络的纵向多模态电生理记录

摘要

该方案描述了一种两阶段手术方法，用于在小鼠中创建一个大型、可重新封闭、保留硬膜的颅内窗口。该技术使得分布式深脑网络（如默认模式网络）能够进行数周的慢性多模态电生理记录。

摘要

默认模式网络（DMN）是一个中心的、大规模的大脑网络，涉及多种认知功能和神经精神疾病，如重度抑郁症（MDD）。在动物模型中研究DMN复杂的动态，为了解其在健康和病理状态下的功能提供了宝贵的见解。然而，在清醒状态下，从DMN多个深层且分布的节点进行稳定、长期、大规模的电生理记录仍然是一项重大挑战。

本书提出了一种新型的两阶段手术方案，用于在小鼠中创建一个大型（4毫米×7.6毫米）的坚固且可重新封闭的颅窗。该手术旨在保持硬脑膜的完整性，这对长期脑健康和记录稳定性至关重要。

该窗口通过结合表面微小皮层电图（μECoG）与两个高密度颅内电极探针，实现了来自1000多个电极的同时重复纵向记录，实现了前所未有的DMN访问。该技术为为期数周的网络范围电生理动力学进行多模态、多尺度探究提供了坚实的平台，为研究脑部疾病病理生理背后的神经可塑性变化以及评估新型治疗的慢性效应开辟了新途径。

引言

默认模式网络（DMN）最早在人脑成像研究中被识别为一组在外部导向、注意力要求高的任务中持续被抑制的区域星座¹.现在它被认为是支持内在认知过程的基础大型网络，如自我指涉思维、自传记忆和未来事件规划 ^2,3。在人类中，典型的DMN包括一组解剖学上相连的核心区域，包括内侧前额叶皮层（mPFC）、后扣带皮层（PCC）、下顶叶叶（IPL）和^海马体4。该网络的功能障碍是多种神经精神疾病的一个关键特征。在重度抑郁障碍（MDD）中，DMN常表现出多动和功能连接模式的改变，这些被认为是MDD核心症状的根源，如反复思考和负面^{自我形象5,6}。

为了研究驱动DMN功能障碍的细胞和回路机制，稳健的动物模型是不可或缺的。在啮齿动物中，已可靠地鉴定出同源DMN，该区域包括mPFC、扣带皮层和脾后皮层（RSP），从而验证了小鼠作为机制研究的翻译相关模型（^7,8）。此外，慢性压力作为抑郁症的关键因素，已被证明会以类似人类重度抑^郁症患者观察到的方式改变啮齿动物的DMN连接性9。

理解疾病状态或慢性治疗干预反应下的神经可塑性变化需要纵向观察神经活动，因为单次记录无法捕捉神经回路随时间的动态适应变化¹⁰。体内电生理学提供了研究神经振荡和局部场电位（LFP）同步所需的毫秒级时间分辨率。LFP表现出反映局部神经元群体同步突触活动的细胞外信号，这些群体是网络通信的基本基底^11,12。然而，在清醒小鼠中进行慢性大规模电生理记录仍然技术要求较高。传统的慢性颅内窗是为清醒小鼠光学成像开发的，并且至今仍是该目的的标准准备方法，其典型的单半球布局和透明玻璃罩片是预期^{读数的最佳}选择。然而，它们并非为清醒多点电生理设计，因此工作区和光学接口阻碍了像DMN¹⁴这样网络分布式双侧节点的同时高密度记录。慢性电极植入物则允许纵向记录，但会导致永久位置的刺骨周围逐渐形成异体包裹和胶质瘢痕，随时间降低信号质量^15,16。

这里描述的两阶段手术直接解决了这些局限性。它通过被动聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜、硅胶密封剂和3D打印盖在两次治疗间隙中形成一个大型可重新封闭的颅内窗口，允许反复非终端插入μECoG网格以记录中尺度LFP记录，同时配备多个高密度颅内电极探头，用于微尺度层流分辨单单元和LFP活性^17,18.与以往依赖永久植入电极阵列以随时间积累胶质细胞包膜或需要末期急性开颅术而无法采用纵向设计不同，此处描述的窗口保留了完整的硬膜，避免了永久的异体接触 15,16,18.此外，在一个验证队列中，颅窗被重新打开三次（术后第0、21、22天），且无电生理记录，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和离子钙结合接合分子1（IBA1）的定量免疫反应性与非手术对照组无显著差异，表明在此处重复开启计划下，星状胶质和小胶质细胞增生均偏低。该方法特别适用于分布式皮层网络（包括DMN）的纵向多位点记录，结合层流高密度颅内电极探针访问清醒头固定小鼠的深层结构。其主要操作限制是需要显微外科技术以确保可靠的硬膜保留骨瓣切除，以及与自由移动录音不兼容，因为高密度颅内电极探头需要头部固定。

方案

所有动物实验均经芬兰国家动物实验委员会（许可证号：ESACI/40845/2022）批准，实验均遵循欧洲议会关于保护科学动物使用的指令2010/63/EU及国家实验动物护理与使用指南进行。

注意：所有手术均在层流手术罩内进行，该罩已通过紫外线照射（至少15分钟）或彻底的乙醇表面消毒进行预先消毒。异氟醚废气通过安装在排气罩内的活性炭扫气系统捕获。操作员佩戴一次性发罩、外科口罩、长袖实验外套和单层非无菌丁腈检查手套（进入引擎盖前喷涂80%乙醇）。头罩内放置锐器处理容器，便于立即处理手术刀和注射针头。

1. 术前准备与麻醉

1. 使用C57BL/6JRj小鼠，至少10周龄，体重超过20克。
2. 手术前，用温水超声波清洗所有器械。冲洗、擦干后，用70%乙醇浸泡至少15分钟。
3. 或者，在使用前立即通过玻璃珠或红外灭菌器短暂消毒器械。不使用无菌窗帘。在同一次训练中，连续的动物放回乙醇浸泡至少2分¹⁹秒。
4. 用校准的秤单独称重每只小鼠，计算术前药物的体积。
5. 提前准备无菌PDMS膜（每批一次，非急性手术日）。
   1. 根据制造商说明和片材，将未固化混合物夹在两块扁平硼硅酸盐玻璃板之间，将10：1弹性体与固化剂混合物铸造至约500微米的目标厚度，然后在60°C下固化至少2小时。
   2. 将固化的片材密封在高压灭菌器袋中，并用蒸汽高压灭菌消毒。在预先消毒的手术罩内，使用无菌手术刀#11号和一把小型不锈钢尺，将每片片切成与颅窗尺寸相匹配的矩形膜。
   3. 将预切膜存放在无菌实验室器具中（例如6孔细胞培养板的单个孔）中，直到使用。
6. 每次录音前都要进行硬件质量控制。
   注意：μECoG阵列不进行常规阻抗检查：原始线路中明显可见参考线故障，阻抗测试仅在怀疑硬件问题时启动。高密度颅内电极探头内置阻抗和电缆完整性诊断功能，可通过录音软件图形用户界面访问;当信号质量明显受损时运行这些设备。

2. 第一阶段：动物制备与头板植入

1. 动物制备
   1. 用异氟醚麻醉小鼠（诱导：4%，维持：1.5−2.5%，氧气流量0.5升/分钟）。通过失去脚趾夹击反射来确认麻醉深度。
   2. 从头顶剃毛，大约从眼睛到脖子。
   3. 将动物放置在配备内部温度传感器的反馈控加热垫上，该加热垫在整个过程中能保持体温在37°C。涂抹碳糖球眼膏以防止角膜干燥。
   4. 用防破裂的耳条将鼠标固定在立体定向框架中。调整门牙杆使头骨平放，骨肌和λ背腹高度相等（头骨平坦方向）。通过鼻锥以0.5升/分钟的氧气流量维持异氟醚（1.5–2.5%）麻醉。
   5. 术前通过皮下注射注射镇痛药和抗炎药物：卡洛芬（5 mg/kg）、丁丙诺啡（0.05 mg/kg）和地塞米松（2 mg/kg）。
   6. 用聚维酮碘溶液消毒剃净部位。
   7. 在头皮下注射利多卡因-肾上腺素溶液（S.C.）作为局部麻醉剂。
2. 头骨暴露
   1. 在耳廓处做一个小的横切口（大约1厘米）。
   2. 通过将切口沿耳朵外侧及头部两侧向眼睛方向延伸，逐渐扩大切口，但切口不要超过眼睛。在中线方向对比一侧切开，使整个背部头骨表面暴露，完成曝光。
3. 清理头骨
   1. 用实验室级丙酮仔细清洁暴露的头骨。将无菌棉签蘸丙酮，去除多余溶剂（防止滴落到邻近组织），然后涂抹在骨骼上，直到所有可见的骨膜被清除。
   2. 使用丙酮是为了溶解骨表面的脂肪残留和顽固膜质残留物，而非作为消毒剂。
      注意：彻底去除骨膜和骨表面脂质残留对于头板和牙胶的牢固附着至关重要。由于植入物必须承受清醒小鼠产生的机械应力，骨粘界面处残留的骨膜或脂质膜成为主要失效点。
   3. 使用钝的显微外科（圆形）手术刀，去除丙酮洗液未能完全溶解的残留骨膜和结缔组织碎片。将头骨保持在与骨面约45°角的位置，并用轻柔的放射状划痕从骨头-中线交界处向外刮擦，朝暴露骨骼的侧缘方向。
   4. 持续直到整个裸露的骨骼表面至少被穿过一次，并且看起来均匀干净且哑光。
   5. 最后用棉尖涂抹器做最后简短清洁，用丙酮清洁。
4. 开颅部位的标记
   1. 将生物相容的手术皮肤标记连接到数字立体定向臂上。
   2. 在头骨上标记一个4毫米×7.6毫米的矩形区域相对于bregma。
      1. 用标记笔尖导航到bregma，并将数字读数上的X和Y坐标重置为零。
      2. 将臂向计划窗户的四个角各移动，使矩形从窗户两侧侧向延伸2毫米，前方3毫米，后方4.6毫米，并在每个角落放置一个点。
5. 标记右半球的两个颅内探针插入点。
   1. 标记前端探针位置为1.66毫米A/P，距离bregma为1.95毫米M/L。
   2. 标记尾探测点，距布雷格玛为-2.2毫米A/P，距离1.9毫米M/L。
      注意：这些站点已调整以针对DMN特有区域。通过该方案，插入位点可以调整到多个不同区域。
   3. 把标记从立体定位臂上拆下来。
   4. 用消毒过的柔性直边（例如薄塑料卡）抵住头骨，将四个角点与记号笔连接，勾勒出未来颅骨窗的连续矩形。
6. 增加表面积以提升附着力
   1. 在双眼显微镜下完成以下所有步骤直到第4部分。
   2. 使用#11手术刀片在指定窗户区域外的所有裸露骨骼表面雕刻交叉图案，形成浅而明确的沟槽，深度为0.2–0.4毫米，形成约1毫米×1毫米正方形的均匀网格。
      注意：这将增加覆盖胶水和牙科胶水的有效表面积，从而增强机械抓地力。
   3. 通过将一根30克无菌针头插入长颈棉签的尖端，并将针头弯曲成V形，制作细胶涂抹器。
   4. 将氰基丙烯酸盐胶水倒入一次性塑料称重船中，然后将涂抹器浸入胶水储罐中。
   5. 在每个裸露和刻有骨头的表面上涂抹沉积胶，每个部位最多涂一层，确保覆盖均匀但不过多。让胶水干7分钟。
7. 植入参考插座
   1. 选择钻孔点位于左小脑上方，避免露出浅层血管。
   2. 将牙科电钻安装在立体定向臂上的钻头支架上。
   3. 在每5至10秒的点燃中，使用圆形钢钻头以20,000至25,000转/分钟的速度钻导向孔，并在爆发间收回钻头，用望远镜检查现场情况。
   4. 钻孔直到孔变得更透明，露出浅粉色，硬膜通过薄骨可见。
   5. 此时立即停止钻孔，以避免硬膜穿透。将成品孔径调整为约0.5毫米，仅略大于参考套筒的外径。
   6. 将镀金参考套筒插入导向孔，用氰基丙烯酸酯胶固定，并用可紫外线固化的牙科胶水加固连接处。用405纳米发光二极管（LED）固化笔灯固化牙胶1分钟。
8. 头板植入
   1. 在暴露的前骨顶端（靠近鼻子的一点）放置少量可紫外线固化的牙科胶水，作为平整支撑。
   2. 将头板放在头骨上，使一边靠在围绕参考牙槽的牙胶脚手架上（步骤2.7.6），另一边则放在新鲜的前端水泥上。
   3. 将头板对准，使其长轴位于矢状面中线中心，两个固定柄垂直于中线轴线（90°）。在紫外线灯下固化复合材料，锁定头板。
   4. 通过在头板底部周围连续施加约1毫米厚的可紫外线固化牙科胶水层，环绕雕刻骨骼和参考窝，直到形成一个连续且密封的外壳，环绕未来颅窗的周边。
   5. 用405纳米LED固化笔分别固化每个增量，工作距离为1–2厘米，持续40秒，确保完全聚合后再施加下一层。确保完成的水泥墙与头板上表面齐平，并完全包围裸露骨头的周边，且不会在标记的窗户区域重叠。
9. 让小鼠从麻醉中恢复。把老鼠放回它的家笼，至少48小时。
10. 进入第3节前，确认动物已恢复到术前体重的5%以内，且在小鼠皱眉量表²⁰上无疼痛迹象。如果这些条件中的任何一项未满足，应延长恢复期限，直到满足为止。
    注意：这种分阶段设计并设有手术间恢复间隔至关重要。它帮助动物从开颅术前的生理压力和炎症中恢复，研究发现这能提高手术成功率和植入物的长期健康;此处至少使用48小时，分阶段颅骨植入术，头板固定与开颅术之间有多天恢复间隔，已被证明能减少围手术期炎症并提升长期准备质量¹⁴。

3. 第二阶段：慢性颅窗的形成

1. 术前准备
   1. 准备手术区域和器械，如第1节所述。
   2. 用异氟醚重新麻醉小鼠（诱导率4%，维持剂量1.5–2.5%）
   3. 将鼠标置于立体定向框架中，步骤2.1.4中描述。
   4. 术前药物按步骤2.1描述的剂量使用，除了利多卡因-肾上腺素局部麻醉（头皮已在A阶段切除，因此不再适用）。
2. 钻窗户
   1. 开始用牙科钻头沿着第一阶段（步骤2.4）标记的矩形轮廓进行骨头变薄。从25,000转/分钟开始，钻孔装置垂直于骨面（≈90°），沿矩形边缘进行一到两次稍深的切削，以建立初始切割槽。
      注意：起始钻探速度可根据操作员的经验水平进行调整。
   2. 在2.5步标记的两个探针插入坐标处，钻入骨和牙水泥，靠近颅骨窗，钻入约0.2–0.3毫米深。
      注意：这些沟槽作为持续的视觉标志，骨瓣取出后仍可见，用于在后续电生理治疗中重新定位颅内探针。
   3. 在整个钻孔过程中，定期使用冰冷无菌人工脑脊液（ACSF;根据Goldey等人¹⁴的含头孢唑林配方制备），以防止对下层皮层的热损伤并减少出血¹⁴。
   4. 随着骨头变薄，逐渐降低钻头速度至20,000转/分钟，并将手柄倾斜至≈45°，使操作员能够稳固钻头贴合手部，并转向更温和、更受控的动作。
3. 取出骨瓣（关键步骤）
   1. 沿矩形周边继续钻孔，直到轮廓内的骨头变薄约90%。不要完全钻穿头骨。
   2. 通过两次互补检查确认剩余骨厚：
      1. 在双筒显微镜下，用钝器轻敲薄骨架边缘。轻敲产生的挠度大小直接反映了残余骨骼厚度。
      2. 在钻孔窗户上敷上冰冷的ACSF，并立即用望远镜观察：在ACSF渗透骨骼前的前20–30秒，液体层显著增强视觉对比，能辨认靠近硬膜的骨质稀薄处的皮层毛细血管，而残余厚度区域在液体下方则相对不透明。当瓣膜均匀半透明且明显柔韧后，继续步骤3.3.3。
   3. 换成细弯曲的硬膜钩，钩尖弯曲90°。极其小心地将钩尖插入薄骨边缘，角度约为15°，沿窗户边缘滑动，小心地将骨瓣从周围头骨及下方组织中分离。
   4. 沿着两侧的侧面从一个角落向另一个角落递进，最后从角落向矩形中心推进，直到整个周边与下方硬膜分离。
   5. 滑行时不要对硬脑膜钩施加任何向下压力，也避免触碰大脑。
      注意：在对角对角角交替使用浅钩角，可以均匀分布机械应力绕过骨瓣。这种方法可以预防硬膜撕裂，并维护底层脑组织的长期健康。
   6. 如果钩子在任何角落遇到焦点阻力，不要强迫移动。相反，降低瓣膜，回到第3.4步，进一步稀薄粘附区域。
      1. 如果发生硬脊膜撕裂，应停止该动物的手术（表现为突发局部肿块、粉红色液体渗出或鲜红色动脉出血，且在用冰冷的ACSF三次注满头板腔后仍未消退，每次洗涤后仍需静置30秒）。
         注意：成功的脱离表现为骨瓣沿其周边均匀活动，无明显硬膜膨出，仅有轻微毛细血管出血。
   7. 用硬脑膜钩小心地从后到前方向抬起成功脱落的骨瓣，约在颅骨表面上方35°。
   8. 用产钳抓住被抬起的边缘，轻轻左右摇摆，直到钢板完全松开。如果板在任何角落有阻力，将板放回原位，回到步骤3.3.4，将粘附区域变薄，然后再尝试拆除;这种阻力表明骨头局部薄弱。
   9. 用冰冷的ACSF反复清洗，轻柔地清除暴露区域的凝血。
   10. 在继续前，确认硬膜完整透明。
       注意：从后边缘缓慢、渐进地抬起对于降低下方上矢状静脉窦和横静脉窦及皮层表面受伤的风险至关重要。
4. 封闭颅内窗
   1. 出血缓解后，将一块无菌预制的PDMS膜（在第1段准备）直接放置在硬膜表面。当尺寸合适时，它能精确覆盖窗户，并被动地附着于硬膜，使其贴合大脑。
   2. 用非纤维性擦拭器吸收窗户周边残留的ACSF。
      注意：擦拭绝不能接触暴露的硬膜，且必须始终严格采用无菌操作技术（无菌操作、工具和现场），因为窗口会反复打开，任何在此阶段引入的污染都会影响后续的纵向记录。
   3. 按照制造商说明准备两组分硅胶弹性体密封剂，并在涂装后30秒内涂抹混合弹性体，填满牙科水泥外壳与头板内缘之间的每个缝隙，完全包围并覆盖PDMS膜的边缘。
   4. 让弹性体固化大约2分钟（或制造商规定的时间）。确保固化密封连续且密封，同时在每次录音开始时仍可机械拆卸。
   5. 在录音间隙间，将定制的3D打印保护盖固定在头板上，并添加少量氰基丙烯酸酯胶水保护窗户。
   6. 让小鼠从麻醉中恢复，然后将其送回自己的笼子，单独安置，以防止植入物受损。

4. 术后护理与习惯化

1. 手术后至少要密切监测小鼠的健康状况两天。如果小鼠出现疼痛迹象，术后2天内额外使用止痛药（S.C.），根据小鼠皱眉量表²⁰。
2. 术后至少让小鼠恢复4天，保持不扰。然后开始为期5天的习惯化期，时间逐渐递增：第1天5分钟，第2、3、4、5天分别为15、30、45和60分钟，以适应操作和头部固定记录平台。
   注意：开颅术后组织水肿和局部炎症已知可持续长达两周²¹。在实验时间允许的情况下，建议在首次录音前延长恢复期。在首次记录前，确认颅内窗口在双眼显微镜下是否清晰无透明度或纤维组织，动物的体重和行为是否正常。

5. 纵向电生理记录程序

1. 将动物放置在记录平台上
   1. 将鼠标放在录音平台上，引导鼠标头固定夹。确保高度已预先调整，以保持动物在固定头部时的自然站立姿势。
      注意：如果鼠标持续抗拒头部固定，请勿强制操作。将动物放回原笼，并将适应阶段（第4节）延长一到两次，然后再尝试固定。
   2. 拧紧夹子的锁定螺丝。
   3. 使用前将钝头显微外科圆形刀片浸泡在80%乙醇中。
   4. 将刀片插入3D打印盖子与头板表面之间，保持刀片几乎与头板表面平行。切勿将刀片推进超过头板开口内缘，以避免与大脑接触的风险。
      注意：盖子是故意用透明树脂打印的，使刀刃深度始终清晰可见。
   5. 用轻柔的左右摆动动作绕着盖子，逐步切割胶层。
   6. 用细小的解剖产钳将盖子抬起，完全释放后将其丢弃。
   7. 抓住硅橡胶密封圈的外缘，缓慢地从尾侧向前侧提起。弹性体密封和其下的PDMS膜作为一个整体分离，露出完整的硬膜。
   8. 通过滴几滴ACSF保持大脑湿润。
2. 安装录音设备
   1. 将μECoG阵列安装在带有磁基座的铰接臂上;根据操作员的经验调整机械臂的摩擦旋钮，有经验的操作者更倾向于选择低摩擦设置，以保留精细的运动控制。
   2. 引导阵列使其电极面沿颅腔窗右缘垂直落在皮层表面（90°）;一旦定位妥当，拧紧摩擦旋钮以固定臂。
   3. 使用尖锐的硅胶尖端工具，轻轻将阵列的扁平带缆向下敲击头板表面，使缆绳与头板紧贴成型，阵列本身平贴硬膜，剩余的ACSF提供被动附着。由于颅窗尺寸设计为单一方向兼容双子网格阵列，粗略排列易于检测。
   4. 用硅胶工具做最后的细微调整，侧向推动阵列，直到矢状中线在半透明阵列中清晰居中。
      注意：半透明的μECoG网格将矢状窦暴露为一个明确的解剖对齐线索，通过阵列保持可见，使相同的侧向偏移能够在纵向疗程中重现。该阵列位于前端半部双侧覆盖前扣带皮层（ACC）和尾部半部双侧覆盖后脾皮层（RSP），覆盖本研究目标的DMN节点。一个开源分析软件包（ephy_spatial_fidelity-toolkit，可在 https://github.com/RazBalin/ephy_spatial_fidelity-toolkit 获取）量化了从保守记录到会话间网格放置的漂移。
   5. 将μECoG参考线连接到第2.7步植入的镀金参考插座。
      注意：作为可选的会前质量控制检查，请先录制一段简短的录音，探针和阵列浸入50毫升ACSF锥形管中，以确认法拉第笼有效减弱环境电磁干扰，然后再进行 体内 记录。
   6. 将尾部高密度颅内电极探头安装在微型操作臂上，臂垂直于脑表面（≈90°），头部高密度颅内电极探头置于另一臂上，倾斜50°。
   7. 在双筒显微镜下，将每个探针推进到硬膜上方约1毫米处，并将每个探针的Y轴与步骤3.2.4中雕刻的导槽对齐。
   8. 通过书面笔记或照片通过双筒望远镜记录，μECoG电极网格紧邻每个探头的预定进入点。
      注意：当手术正确进行且无皮层水肿时，骨缘与μECoG阵列之间的间距极小，使入点选择变得明确无歧义。为了实现纵向会话中最大的空间精度，拍摄暴露皮层并安装阵列的照片，并在骨缘与μE-OG阵列之间狭窄区域识别出独特的乳汁血管。该图像标注参考容器及其相对于μECoG垫的位置，作为会话间的参考映射，用于后续记录日重现同一入口点。
   9. 记录完探针与垫片的对应关系后，将每个探针向上缩回约15毫米，以保护脆弱的电极柄在硬膜穿刺过程中。
   10. 通过将无菌30克皮下注射针固定在棉尖导管尖端，并用无齿细钳将针尖弯曲至90°，制造硬膜穿刺工具。
   11. 慢慢引导穿刺工具在头板上方。通过双筒望远镜观察，计数μECoG电极垫，以使工具与记录的入坐标对齐。将弯曲的刀尖降低到硬膜表面，使切割尖端以90°角接近硬膜，同时工具轴保持与老鼠背部长轴平行。
   12. 将尖端前移至硬膜面下方约1毫米处并收回。穿刺处预期有轻微瞬态出血;用非纤维湿巾的扭曲角擦干。
   13. 穿刺后立即在连续双眼观察下，将每个高密度颅内电极探针降低至硬膜表面。如果穿刺位置精确，探针能平滑穿过穿孔，不会有刀柄偏移。
   14. 每个探针以约0.1毫米/秒或较慢²²毫米的速度，逐步下沉至硬脑膜下方5毫米的目标深度。
   15. 让探针机械稳定10分钟后再开始数据采集。
       注意：30 G针头形成的小型硬膜穿孔可在几分钟内自动闭合;因此，探针插入必须紧随穿刺后进行。
3. 数据采集
   1. 开始数据采集。
      注意：μECoG信号通过四个128通道数字头段通过SPI接口线连接到开源采集板进行放大，而两个高密度颅内电极探头则通过专用的高密度探针采集模块获取，该模块安装在模块化仪器机体内，旁边还有多功能输入/输出和数据采集模块，用于同步和数字信号传输。一个通用的TTL主时钟由开源的μECoG采集板生成，并通过其多功能I/O模块作为硬件同步线分发到探针采集机箱，使两个采集流共享一个采样对齐的时间基。所有数据流通过采集系统的图形用户界面同步录制;完整硬件型号和目录号列于 材料表中。
   2. 记录结束时，在μECoG网格上注射0.5毫升ACSF，然后以插入时相同的速度（≈6毫米/分钟）收回每个高密度颅内电极探头，轻柔地移除μECoG阵列。
   3. 将探针和阵列浸泡在新鲜制备的1%酶促洗涤剂溶液中45分钟。
   4. 酶促洗涤剂浸泡后，将电极连续三次浸入逆渗透纯化水中，每次冲洗时使用新管子冲洗。
   5. 按照步骤3.4.1，用新的无菌片替换PDMS膜。
   6. 重新涂抹弹性体密封剂（步骤3.4.3–3.4.4），并安装新的3D打印保护盖（步骤3.4.5）。
   7. 让重新密封的组件自然风干5分钟，然后将老鼠放回笼子。该程序可重复多次录音，持续数周。

结果

成功的手术会在皮层上方形成一个透明透明的窗户，血管可见，炎症或感染的迹象极少。这种清晰度可维持超过21天（见图1），便于进行长期纵向研究。该植入物的稳健性体现在其在21天慢性皮质酮给药模式下仍能保持稳定，这是诱发啮齿动物抑郁状态的常见模型10,23,24。这证实了该方法在慢性病建模中的适用性。

通过慢性窗口记录的原始电生理信号在纵向时间线上保持高质量。图 2中，第一记录日（第0天）和第21天（第21天）的代表性宽带μECoG痕迹从后脾后格网抽样，同时从浅皮层通道抽样的颅内探针局部场电位痕迹并列展示。第21天的记录显示信号幅度、频谱含量以及运动和噪声伪影与同一动物的第0天记录相当，证实无论是PDMS膜和硅胶密封的慢...

讨论

本报告详细介绍了一种两阶段、保留硬膜的手术方案，为小鼠创造大型、慢性且可重新封闭的颅窗提供了可靠且高效的方法。这种技术的重要性不仅限于窗户的大小。其主要优势在于能够在纵向时间尺度上同时、多尺度地探询大规模大脑网络。通过结合表面μECoG网格（提供中尺度LFP数据）与深层高密度颅内电极探针（提供微尺度层流分辨单单位和LFP数据），研究人员可以直接研究特定电路活动，例如深DMN节点内的特定电路活动，如何促进皮层上观察到的涌现网络级动力学。此外，这种方法适用于任何大规模网络，因为它能够访问小鼠大脑的大部分区域。

协议的两个方面是其成功的基础。首先，将手术分为两个阶段，每个阶段之间有48小时的恢复期，这是一个关键的设计选择。该策略最大限度地减少动物的累积生理压力，减少急性炎症反应，并允许在更侵入性的开颅手术前获得初步愈合。从经验角度看，这种分阶段设计提高了健康长期植入物的可靠性，符合已发表的小鼠分阶段颅植入方案¹⁴。其次，保留硬膜开颅术是最关键的操作。通过将骨头变薄至约90%...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
µECoG 阵列 & mdash;512通道定制（256声道）	神经连接	E256-200-30-80	包装：IH256。两次1600倍;16个子网格（每个3.3毫米，乘以3.5毫米）;200 & mu;m音高;80 & mu;电极直径。表面层的DMN录音。
三轴左手微操作臂	世界精密仪器公司（WPI）	504926	10 & mu;m分辨率;数字显示;用于手术中的头板/探针定位
3D打印保护帽	内部（Anycubic Photon Mono 4K）	无	定制设计;用Anycubic高透明紫外线树脂印刷;STL文件可在 https://github.com/RazBalin/ProtectiveDMN_Cap
丙酮（实验室级）	西格玛-奥尔德里奇	179973	粘剂涂抹前的颅骨表面脱脂和骨膜清除
Adson 硬脑膜钩 5毫米（细硬脑膜钩）	gSource	gS 25.2570	用于沿周边从硬膜上剥离骨板;由细钨丝或类似材料制成
Anycubic高透明紫外线树脂	任意立方	STMGCL-102B	光聚合物树脂用于Anycubic Photon Mono 4K打印机，用于3D打印保护盖
Anycubic Photon 单体 4K 3D 树脂打印机	任意立方	光子单体4K	用于用Anycubic高透明树脂打印保护性窗盖
Anycubic UV树脂洗涤与治愈机2.0	任意立方	285-550	3D打印盖的打印后清洗和紫外线固化
带磁基的铰接臂（及时间;2)	哈斯模具	09-0535	用来保持和微型;在记录过程中，位于皮层表面的 ECoG 子网格
人工脑脊液（aCSF）	内部准备	无（内部）	aCSF配方：124 mM NaCl，3 mM KCl，26 mM NaHCO3，2 mM CaCl2，1 mM MgSO4，1.25 mM KH2PO4<>， 10 mM D-葡萄糖;制备后立即含氧，含95%<氧亚>2/5%二氧化碳<亚>2。目录号单独列出。
钝显微外科刀（圆形手术刀）及nbsp;	伊欧根	374769	用于颅骨表面刮除和去除头盖
丁丙诺啡（Temgesic）	Indivior	编号BE-112515	阿片类镇痛药;术前0.05 mg/kg，超速
C57BL/6JRj 鼠标	Janvier 实验室		无论男女;至少10周大，手术时体重>20克
氯化钙二水合物（CaCl2·双人<下>2O）	西格玛-奥尔德里奇	C-7902	2 mM;中山147.02小时;0.29克/升。以钙和时间制备;100个股票。这是院内aCSF的组成部分。
卡洛芬（Rimadyl）	佐蒂斯动物健康	RXRIM-INJ	非甾体抗炎药镇痛药;术前5毫克/公斤，手术前
皮质酮	西格玛-奥尔德里奇	C2505	21天慢性压力/抑郁模型中溶解于饮用水中
棉签	费舍尔布兰德	22-363-157	作为30克硬脑膜穿刺装置的手柄，并用丙酮去除头骨表面的油脂
氰基丙烯酸酯胶水及mdash;洛克泰特401	亨克尔胶水	洛克泰特401	薄粘度氰基丙烯酸酯;用于头骨表面底漆、头板和帽固定
牙科钻机和mdash;福尔多姆 K.1070	前导	K.1070	柔性轴旋转钻机;用于开颅稀释和导孔钻孔
地塞米松	多法玛	1DEX004	皮质类固醇抗炎药;术前2毫克/公斤，手术前
D-葡萄糖	西格玛-奥尔德里奇	G-7021	10 mM;中波180.20小时;1.80克/升。以葡萄糖制备及时间;100个股票。这是院内aCSF的组成部分。
钢钻头 1/007W 圆钻	哈格与梅辛格	18089	用于参考点和颅窗
乙醇80%（v/v）- A12t二硝基苯丙醇	伯纳	13221132	术前浸泡手术器械和手术层状罩以进行灭菌
气体排放装置	后驱生命科学	R546W	清理物会排出手术区域的麻醉气体
镀金参考插座	DigiKey（数字钥匙）	310-13-102-41-001000	植入左小脑上方;作为ECoG的接地/参考
GRANT 超声波清洗机及 mdash;型号17002A。	GRANT乐器	17002A	伊安：4064343191654。热水超声波浴;与TICKOPUR TR 3用于仪器清洁
热敷包和mdash;超级科技TMP-5B	超级科技	TMP-5B	保持体温在37度及以下;麻醉期间的C型
异氟醚	皮拉马尔医疗	66794-017-25	吸入麻醉;感应率4%，维持率1.5%和无量冲击;2.5%
Kimtech Science，精准湿巾（非纤维组织）	金伯利·克拉克	7552	与尖头一起使用，以干燥残留的ACSF，并帮助PDMS膜粘附硬脑膜
Kwik-cast无菌弹性体密封剂	世界精密仪器公司（WPI）	KWIK-cast-s	型号：KWIK-CAST-S。生物相容性硅胶;用于在PDMS膜周围形成可拆卸密封。nbsp;
LED紫外固化笔 405 nm	CureUV	514424-405	用于植牙过程中固化紫外线激活的牙科胶（Total C-Ram）
利多卡因-肾上腺素溶液	猎户座制药	05 10 31	局部麻醉;头皮下注射S.C.
硫酸镁七水合物（MgSOs4 ·7H2O）	西格玛-奥尔德里奇	M-7774	1 mM;中均246.48小时;0.25克/升。以毫克和时间制备;100个股票。这是院内aCSF的组成部分。
金属头板和装饰;神经地标13型	神经脂肪	13型	钛合金头板;圆形开口直径11毫米;用氰基丙烯酸盐和牙科胶水固定在头骨上
NeuroNexus 头置适配器 ：）	神经连接	定制IH256 64×4 莫莱克斯	定制适配器板;三明治各和微型;ECoG 子格网，位于两台 Intan RHD 128 声道头段之间
带金属帽的Neuropixels 1.0探头（以及时间;2)	IMEC	PRB_1_4_0480_1_C	960个录音点;10毫米的刀柄。一个探针靶向海马-丘脑-视觉柱，另一个靶向mPFC柱
NI PXIe-1083底盘	国家仪器	PXIe-1083	9槽PXI Express机箱，内含Neuropixels模块和NI DAQ卡
NI PXIe-3839多功能输入输出模块	国家仪器	PXIe-3839	安装在NI PXIe-1083底盘上;用于同步和辅助输入输出
NI PXIe-6363多功能DAQ	国家仪器	PXIe-6363	安装在NI PXIe-1083底盘上;模拟和数字输入输出用于同步
Nova Microcinerator - 红外灭菌器	阿尔戈斯科技	S3022	用于快速消毒任何可能接触暴露脑组织的器械
奥林巴斯SZ51立体双筒显微镜	奥林匹斯	SZ51	外科可视化;在整个开颅和植入过程中使用
开放Ephys采购板（One Box，第一代）	开放的Ephys	OEPS-9029	接收与微观;通过SPI传输ECoG数据流;开源硬件。参见 open-ephys.org
打开Ephys GUI	开放的Ephys	不适用（开源）	免费开源的电生理学获取软件。可访问：open-ephys.org
氯化钾（KCl）	西格玛-奥尔德里奇	P-5405	3 mM;中山74：55;0.22克/升。内部aCSF的组成部分。
二氢磷酸钾（KH2POs4）	西格玛-奥尔德里奇	P-5655	1.25 mM;中午136.09小时;0.17克/升。内部aCSF的成分（Klebs及时间;10 个存货）。
聚维酮碘溶液（BETADINE）	武田	45 70 28	用于手术场准备的局部消毒剂
PXIe 采集模块	神经像素	PXIE_1000	用于Neuropixels 1.0数据采集的PXI格式模块;安装在NI PXIe-1083底盘上
参考插座连接器	DigiKey（数字钥匙）	342-10-102-00-591000	对应的对应连接器用于上文参考插座;用DigiKey确认零件编号
RHD 128通道头台（及时间;4)	Intan科技	右驱128	每个和micro有两个头顶;ECoG子电网;确认模型（例如，RHD2132或RHD2164）
右侧SPI接口线，0.9米	Intan 科技 / Open Ephys	C3203	连接右侧头置与开放式Ephys采集盒的标准SPI电缆
后驱空气泵	后驱生命科学	R510-29	通过麻醉回路提供气流
后驱动物麻醉蒸发器	后驱生命科学	R5835	用于麻醉诱导和维持的精密异氟醚蒸发器
手术刀刃 #11	斯旺·莫顿	SM0103	用于在头骨表面雕刻交叉图案，以增强粘附性
小动物理发器 - GT416	Aesculap Schermaschinen 有限公司	D-98528H	手术前用于修剪动物头皮
碳酸氢钠（NaHCO3）	西格玛-奥尔德里奇	S-5761	26 mM;中三 84：01;2.18 g/L。内部 aCSF 的组成部分。
氯化钠（NaCl）	西格玛-奥尔德里奇	S-5886	124米汞柱;每周58小时44分;7.25克/升。内部aCSF的组成部分。
SOL-M（无菌皮下注射针，30克）	太阳-千年欧洲	113005	弯曲90度;尖端并粘贴在棉签上，形成硬膜穿刺装置
标准机械臂，左轴三轴（斯托尔廷）	斯托尔廷公司	51604	用于录音过程中的神经像素探针插入
标准机械臂，右轴三轴（Stoelting）	斯托尔廷公司	51606	用于录音过程中的神经像素探针插入
立体定向框架和mdash;后驱车 F67001	后驱生命科学	F67001	标准立体结构框架;用于头部稳定和坐标参考植入物
带尺的外科马克笔皮肤笔（紫色墨水）	法宁	SM0372	基于龙胆紫的生物相容性手术皮肤标记，用于勾勒计划的开颅手术和骨骼植入足迹。抗氰基丙烯酸酯引爆（乐泰石401），通过头骨脱脂和头部固定仍可见，允许立体定位坐标可靠地传递到骨面。
SYLGARD 184硅胶弹性体套件（PDMS）	道琼斯（德国）	1673921	聚二甲基硅氧烷;铸成薄层（<1毫米）膜;放置在硬膜表面以保护大脑
特加酶酶清洁剂	阿尔科诺克斯	1304-1	蛋白酶基清洁剂，含1%（w/v）浓度，浸入温热的反渗透水中，用于洗礼后电极清洁（浸泡45分钟，然后在纯净水中三次冲洗）。
Total C-Ram Automix 紫外线牙科胶（白色）	伊特娜	R301950	型号：TTCRAM-BLC。可紫外线固化的牙科树脂;用于头板加固和套筒固定
超声波清洗液（TICKOPUR TR 3）	H. Stamm博士有限公司	TR-3-913及nbsp;	柠檬酸基浓缩物;用于超声波浴，用于术后器械清洁
Viscotears 眼部凝胶 2 mg/g	阿尔康	503849	基于碳水的润滑眼膏;麻醉时涂抹于角膜以防止干燥
蔡司冷光源 KL1500 LCD	卡尔·蔡司	KL1500液晶屏	用于手术领域的光纤冷照明;防止热损伤