固定福马林固定石蜡小鼠胚胎组织早期牙齿形态发生的空间转录组学

摘要

当前方案描述了利用小鼠胚胎E13.5和E15.5颅面区域中福马林固定、石蜡嵌入切片，利用空间转录组学分析基因表达差异。

摘要

发育中的牙齿由多样且高度专业化的细胞群体组成，协同工作以维持正确的形态和功能。阐明这些细胞及其周围微环境之间的相互作用，对于理解正常牙齿发育背后的调控机制至关重要。这些过程的紊乱可能导致先天性疾病，如牙齿缺如、牙本质生成不全和变质生成不全。尽管单细胞RNA测序（scRNA-seq）在揭示细胞异质性方面取得了显著进展，但它未能保留细胞在组织中的空间环境，限制了将基因表达与组织结构联系的能力。空间转录组技术通过将高分辨率基因表达谱与原生组织结构的保存相结合，解决了这一局限，实现分子特征的 原位 定位。本文介绍了适合下游空间转录组应用的小鼠胚胎颅面组织的采集、固定及石蜡嵌入的逐步方案。工作流程详细说明了对福马林固定、石蜡嵌入组织的切片和处理，以保持RNA完整性和组织形态，以便进行高分辨率空间分析。该方法兼容测序和基于图像的空间转录组平台，实现了小鼠胚胎早期牙齿形态发生的空间转录组画像。这一方法为颅面结构在发育和病理状态下的空间组织和功能动态提供了有力见解，为将分子机制与组织形态联系起来提供了关键框架。

引言

牙齿发育依赖于胚胎早期生长期间高度协调的形态发生过程^序列1,2,3,4。尽管通过遗传和发育研究已识别出众多关键基因和信号通路，但我们对这些因素如何相互作用塑造个体颅面结构的了解仍然有限。值得注意的是，尽管在将特定遗传变异与综合征性和非综合征性牙齿疾病联系起来方面取得了显著进展，结构特异性形态发生的详细分子机制仍未完全定义 1,2,3,4。这一知识空白持续限制了针对牙齿发育不良或其他牙齿异常的靶向治疗策略的进展。

单细胞mRNA测序（scRNA-seq）使得在健康和病变组织中发现此前未被识别的细胞类型成为可能，并基于不同的基因表达谱鉴定出多种细胞亚型。然而，由于scRNA-seq需要将组织解离为单细胞，因此每个细胞在组织中的原始空间位置信息会丢失。因此，这些数据集无法捕捉细胞相对于组织结构的排列情况 ^5,6,7。此外，预测的细胞间相互作用依赖于转录本之间互补的相互作用，但不考虑实际的空间信息，而空间信息对于判断此类相互作用是否在体内发生非常重要 ^5,6,7。

空间转录组技术实现了基因表达的高通量剖析，同时保留组织切片^8,9的空间信息。空间转录组学技术分为基于影像的^10,11,12，或基于测序的^12,13。基于影像的空间转录组学方法利用FISH以细胞或亚细胞空间精度检测和测量靶向基因表达。相比之下，基于测序的技术则以较低的空间分辨率捕捉全转录组的基因表达。基于测序的空间转录组学采用了一种策略，实现近单细胞分辨率，覆盖全转录组（~20,000个基因），支持无偏的探索性分析;而基于图像的空间转录组学则针对基因面板（最多~5,000个基因），从而实现基于假设的精确分析特定通路和细胞相互作用¹⁴。

空间转录组学的技术进步使得在保存的组织结构中分析基因表达成为可能。福马林固定石蜡嵌入（FFPE）和基于冷冻切割的工作流程为空间转录组学提供了互补的方法 15,16,17。FFPE提供了卓越的组织结构保存能力，能够精确定位结构复杂组织（如发育中的牙齿和腭架）中的基因表达。在我们及其他研究中，FFPE固定和存档产生了高度准确且可重复的空间转录组数据¹⁸。冷冻切片工作流程保持RNA完整性，但更容易发生组织变^形。因此，FFPE被选中参与本研究。虽然scRNA测序的成功很大程度上依赖于保持高RNA完整性，但空间转录组学同样需要高质量的组织形态学，以准确定位基因表达信号到特定组织学特征。

该方案最适合适用于跨越早期发育阶段的小鼠胚胎颅面组织，在这些阶段，保存细小组织结构对于空间转录组分析至关重要。在过度固定样品、取向不良的石蜡块或RNA完整性受损的组织中，该工作流程可能表现不佳，可能导致信号质量下降和空间分辨率损失。该方法的成功应用表现为组织形态完整、切片扭曲极少，以及与组织学特征一致的强健、空间分辨的转录组信号。

方案

所有动物操作均由美国国立卫生研究院、国家儿童健康与人类发展研究所动物护理与使用委员会（ACUC）根据动物研究协议#21-031批准。

1. 实验动物的制备及组织采集

1. 将健康、有生育能力的雄性和雌 性肌肉鼠 配对，进行定时交配。通过阴道塞的存在来识别怀孕的雌鼠，该塞子被标记为胚胎日（E）0.5。
2. 通过吸入二氧化碳后进行宫颈脱位，安乐死孕母鼠。将动物仰卧放在无菌吸收手术表面上，沿预定切口部位用70%乙醇消毒腹部区域。
3. 用无菌手术剪刀在腹部中线切口，并用显微手术剪刀小心打开腹膜壁，露出子宫角。用钝钳轻柔地切除子宫链。通过沿肌组释放子宫组织，并在输卵管和子宫正中角连接处切断胚胎。
4. 立即将整个胚胎转移到冰冷无菌的1x PBS中，置于10厘米培养皿中。
5. 小心地将每个胚胎与周围子宫、羊膜和绒毛膜分离，转移到一个新鲜的10厘米盘中，内含冰冷无菌的1xPBS。
6. 在所需发育阶段使用无菌手术刀片解剖胚胎头部，并在进一步处理前用冰冷的1倍PBS冲洗一次。

2. 组织的固定与处理

1. 在所需发育阶段解剖胚胎小鼠头部，并在室温下用摇床固定10%中性缓冲福马林。
2. 固定后，去除福尔马林，用1xPBS冲洗样品，然后转移到70%乙醇中储存。使用自动化组织处理机进行组织脱水、清除和石蜡浸润。
3. 将胚胎头嵌入石蜡中，朝向冠状面或矢状面。
4. 蜡凝固后，将石蜡块从模具中取出，放入标有标识的密封容器或密封袋中，并以4°C保存至切片。
   注意：FFPE块可以在切片前保存数年，而不会损害组织完整性。

3. 空间转录组学对FFPE组织的处理

1. 用70%乙醇消毒工作表面和仪器，随后用RNase去污溶液处理，以减少RNA降解。
2. 准备一个含有去离子水的水浴，并保持在40°C，根据胚胎阶段或组织特性调整温度在40°C至43°C之间。
3. 安装切片机，用RNase消毒液轻轻擦拭后安装新刀片，固定刀片，并将间隙角设为10°。
   注意：确保新刀片用于切片以实现精确的组织切片。改变切片机刀片角度会显著影响切片质量，影响组织完整性、厚度均匀性以及形态特征的保存。
4. 修剪嵌入组织周围多余的石蜡，并将FFPE块安装在切片机的冷级。
5. 使用前，用RNase去污溶液准备并处理干净的镊子和刷子。
6. 将石蜡块面与切片片对齐，并对约12微米的切割切割，直到接近目标区域（例如，直到磨牙的近侧部分在冠状切片中可见）。根据需要调整块状和刀片位置，确保整顶冠状节对称且正确朝向。
7. 如果要进行组织切片的RNA分离，应直接将10微米切片收集到1 mL微离心管中，并按照制造商建议^19,20进行DV200质量评估进行处理。
8. 切割厚度为5微米的串行切片，并通过显微镜观察普通载玻片上的测试切片，持续监测目标区域的接近程度。
9. 接近目标区域后，使用11号手术刀在组织区域划分两个有策略的区域，但不完全切开，以防止切片卷曲或粘连。切片后，用细刷的刷毛去除附着的石蜡。
10. 将组织切片以41°C的温度浮到水浴上，以便轻柔放松和压平，然后再用载玻片取出。

4. 基于测序的空间转录组学

1. 将组织切片收集到推荐的玻片上，确保所有感兴趣区域均位于6.5×6.5毫米范围内。当多个相邻切片被放置在同一滑套上时，应在40°C的滑套加热器上短暂加热滑套，以促进附着并防止先前放置的切片脱落。所有切片定位完成后，将载玻片置于带盖的载玻片加热器中，以60°C温存2小时，以增强组织附着。
   注：超出6.5×6.5毫米区域的切片未被处理。
2. 培养后，使用标准的H&E染色方案进行血液素和伊丝蛋白（H&E）染色，将去离子水替换自来水以保持RNA完整性。
3. 使用80%甘油安装覆盖套片，获取高分辨率H&E图像，提供更高质量的参考图像，以取代由载玻片成像和组织转移系统生成的典型H&E图像。
4. 成像后，将切片单独浸入装有去离子水的50毫升管中，取出盖片，准备送往堆芯设施进行后续处理。

5. 基于图像的空间转录组学

注：载玻片由制造商提供²⁰，每片包含指定的可成像区域（轮廓线），尺寸为12毫米×24毫米，样品放置区域约为235平方毫米（10.45毫米×22.45毫米）。

1. 将组织切片完全置于该区域内，确保包括残留石蜡在内的切片不重叠。放置多个相邻段时，先在40°C的滑套加热器上短暂加热滑套，以促进附着并防止先前安装段脱落。
2. 所有组织切片放置完毕后，将载玻片放入有盖的载玻片加热器中，并在40°C下潜伏一夜以确保粘附。
3. 孵育后，按照制造商的¹⁹ 协议处理切片并导入机器进行RNA测序，同时与最新版本进行交叉核对，因为程序细节会定期更新。
   注意：在该方案中产生的所有有害物质，如福尔马林、乙醇和RNase去污溶液，应按照机构安全政策和当地法规进行处置，使用适当的化学废物容器、生物危害处置方法和排风罩操作。

结果

该方法概述了对新鲜解剖小鼠胚胎头部的处理，以生成颅面组织（包括发育中的牙齿）的FFPE样本，这些样本可通过切片机轻松切片，同时保持RNA完整性（见图1）。该方案已成功应用于E13.5（胚胎第13.5天）、E15.5和E16.5小鼠胚头，用于基于图像（图2）和基于测序的空间转录组学（图3）颅面区域。在基于测序的空间转录组学数据集中，通过分析空间簇间的差异表达、检测特定簇内富集的转录本以及具有空间限制表达模式的基因来识别标记基因。这种结合方法使基因能够可靠地分配到不同细胞类型和空间区域。候选标记的验证使得通过转录组分析识别出的基因在完整组织中具有特异性、稳健性和生物学意义。

基于测序和基于影像的空间转录组学通过在位检测RNA分子的单细胞分辨率，同时保持空间上下文，促进这一过程。在标记选择后，会评估其表达，确保其出现在预期的解...

讨论

本研究提出了一个详细的方案，用于制备小鼠胚胎头部的FFPE块，优化用于高分辨率空间RNA成像平台，包括基于测序和基于影像的空间转录组学。该方案的关键目标是保持整个头部切片的组织形态和核酸完整性，特别关注发育中的颅面区域。确保这种保存水平对于在复杂多组织环境中准确解析空间基因表达模式至关重要，如发育中的腭部和牙齿结构。

近期研究强调了空间转录组学在解剖颅面发育过程中细胞异质性和谱系指定的重要性。例如，单细胞RNA测序与空间转录组学的结合，使得构建全面的牙齿发育转录图谱成为可能^14,15。这些集成数据集定义了人类胚胎牙齿中独特的上皮和间充质细胞群体，揭示了谱系承诺的分子调控因子，并为早期牙发生研究提供了基础参考图谱。同样，利用空间RNA测序方法分析腭间充质揭示了硬腭成骨细胞分化背后的动态转录程序，包括晚期成骨标志物的空间限制激活¹⁶。这些发现凸显了空间转录...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x PBS	热费舍尔	10010023	使用 在工作流程中进行洗涤
50 mL锥形管（Ambion）游离RNAse	热费舍尔	AM12502	用于储存不同溶液中的样品
先进轨道震荡器	VWR	6683-470	在孵育期间用于摇晃固定溶液中的组织
酒精，70%，Fisherbrand，HistoPrep	费舍尔科学	HC-1000-1GL	用来清洁和消毒所有工作区
自动真空组织处理机	徕卡生物系统	ASP300S	用于样品的清除、脱水、补水和蜡浸渍
玻璃罩厚度1.5,25毫米×25毫米及nbsp;	科宁	2850-25	在 Visium HD 工作流程中用于安装幻灯片
Dako Bluing 缓冲器，现成型	敏捷科技	CS70230-2	用于H&电色染色
带四剜的爱氨酸Y	费舍尔科学	22050198	用于H&电色染色
Hematoxylin，Mayer's，即用水溶液	敏捷科技	S330930-2	用于H&电色染色
HistoCore水澡	徕卡生物系统	HIS2326	使用浮动40-43度的截面;C 用于去除 FFPE 切片上的皱褶
放大镜浏览器 9.0.0	10X 基因组公司及nbsp;		用于分析Visium HD数据
低矮型一次性刀片 DB80LX	徕卡生物系统	14035843496	用于分段FFPE块
中性缓冲福马林 10%	阿泽尔科学	NBF-4-G	用来修复组织
RNaseZap RNase 去污溶液	热费舍尔	AM9782	用于清洁和去除RNase
半自动旋转切片机	徕卡生物系统	RM2245	请按指南中报告的FFPE区块进行分区。
带盖的滑套加热器	首映	XH2004	用于不同温度下的载玻片孵育
超级霜冻加幻灯片及nbsp;	费舍尔科学	12-550-15	用于连接Vsium HD的分段
手术刀11号	英特格拉·米尔特克斯	4-311	用于FFPE组织的评分
Surgipath Paraplast（护送伞）	徕卡生物系统	39601006	用于组织浸润和嵌入组织
TISsue 培养天线 100X20MM 500/CS	费舍尔科学	877222	用于采集和解剖1倍PBS样本
超纯甘油	热费舍尔	15514011	在CytAssist之前用于Visium HD载玻片安装盖玻片
Visium CytAssist	10X 基因组公司及nbsp;	PN-1000442	用于Visium HD工作流程实验
Visium HD 空间 RNA 测序	10X 基因组公司及nbsp;	1000676	用于进行空间转录组实验
Xenium 5K 原位RNA定位	10X 基因组公司及nbsp;	PN-1000724	用于进行空间转录组实验
氙分析仪	10X 基因组公司及nbsp;	PN-1000481	使用Xenium和Xenium 5K RNA成像并nbsp;
异星探险者4号	10X 基因组公司及nbsp;		用于分析Xenium数据
氙原位RNA定位	10X 基因组公司及nbsp;	1000672	用于进行空间转录组实验