Method Article

固定福马林固定石蜡小鼠胚胎组织早期牙齿形态发生的空间转录组学

DOI:

10.3791/70340

⸱

March 13th, 2026

 , 
1Section on Craniofacial Genetic Disorders, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Shriners Hospital for Children

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

当前方案描述了利用小鼠胚胎E13.5和E15.5颅面区域中福马林固定、石蜡嵌入切片，利用空间转录组学分析基因表达差异。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

发育中的牙齿由多样且高度专业化的细胞群体组成，协同工作以维持正确的形态和功能。阐明这些细胞及其周围微环境之间的相互作用，对于理解正常牙齿发育背后的调控机制至关重要。这些过程的紊乱可能导致先天性疾病，如牙齿缺如、牙本质生成不全和变质生成不全。尽管单细胞RNA测序（scRNA-seq）在揭示细胞异质性方面取得了显著进展，但它未能保留细胞在组织中的空间环境，限制了将基因表达与组织结构联系的能力。空间转录组技术通过将高分辨率基因表达谱与原生组织结构的保存相结合，解决了这一局限，实现分子特征的 原位 定位。本文介绍了适合下游空间转录组应用的小鼠胚胎颅面组织的采集、固定及石蜡嵌入的逐步方案。工作流程详细说明了对福马林固定、石蜡嵌入组织的切片和处理，以保持RNA完整性和组织形态，以便进行高分辨率空间分析。该方法兼容测序和基于图像的空间转录组平台，实现了小鼠胚胎早期牙齿形态发生的空间转录组画像。这一方法为颅面结构在发育和病理状态下的空间组织和功能动态提供了有力见解，为将分子机制与组织形态联系起来提供了关键框架。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

牙齿发育依赖于胚胎早期生长期间高度协调的形态发生过程序列1,2,3,4。尽管通过遗传和发育研究已识别出众多关键基因和信号通路，但我们对这些因素如何相互作用塑造个体颅面结构的了解仍然有限。值得注意的是，尽管在将特定遗传变异与综合征性和非综合征性牙齿疾病联系起来方面取得了显著进展，结构特异性形态发生的详细分子机制仍未完全定义 1,2,3,4。这一知识空白持续限制了针对牙齿发育不良或其他牙齿异常的靶向治疗策略的进展。

单细胞mRNA测序（scRNA-seq）使得在健康和病变组织中发现此前未被识别的细胞类型成为可能，并基于不同的基因表达谱鉴定出多种细胞亚型。然而，由于scRNA-seq需要将组织解离为单细胞，因此每个细胞在组织中的原始空间位置信息会丢失。因此，这些数据集无法捕捉细胞相对于组织结构的排列情况

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有动物操作均由美国国立卫生研究院、国家儿童健康与人类发展研究所动物护理与使用委员会（ACUC）根据动物研究协议#21-031批准。

1. 实验动物的制备及组织采集

  1. 将健康、有生育能力的雄性和雌 性肌肉鼠 配对，进行定时交配。通过阴道塞的存在来识别怀孕的雌鼠，该塞子被标记为胚胎日（E）0.5。
  2. 通过吸入二氧化碳后进行宫颈脱位，安乐死孕母鼠。将动物仰卧放在无菌吸收手术表面上，沿预定切口部位用70%乙醇消毒腹部区域。
  3. 用无菌手术剪刀在腹部中线切口，并用显微手术剪刀小心打开腹膜壁，露出子宫角。用钝钳轻柔地切除子宫链。通过沿肌组释放子宫组织，并在输卵管和子宫正中角连接处切断胚胎。
  4. 立即将整个胚胎转移到冰冷无菌的1x PBS中，置于10厘米培养皿中。
  5. 小心地将每个胚胎与周围子宫、羊膜和绒毛膜分离，转移到一个新鲜的10厘米盘中，内含冰冷无菌的1xPBS。
  6. 在所需发育阶段使用无菌手术刀片解剖胚胎头部，并在进一步处理前用冰冷的1倍PBS冲洗一次。

2. 组织的固定与处理

  1. 在所需发育阶段解剖胚胎小鼠头部，并在室温下用摇床固定10....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方法概述了对新鲜解剖小鼠胚胎头部的处理，以生成颅面组织（包括发育中的牙齿）的FFPE样本，这些样本可通过切片机轻松切片，同时保持RNA完整性（见图1）。该方案已成功应用于E13.5（胚胎第13.5天）、E15.5和E16.5小鼠胚头，用于基于图像（图2）和基于测序的空间转录组学（图3）颅面区域。在基于测序的空间转录组学数据集中，通过分析空间簇间的差异表达、检测特定簇内富集的转录本以及具有空间限制表达模式的基因来识别标记基因。这种结合方法使基因能够可靠地分配到不同细胞类型和空间区域。候选标记的验证使得通过转录组分析识别出的基因在完整组织中具有特异性、稳健性和生物学意义。

基于测序和基于影像的空间转录组学通过在位检测RNA分子的单细胞分辨率，同时保持空间上下文，促进这一过程。在标记选择后，会评估其表达，确保其出现在预期的解.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究提出了一个详细的方案，用于制备小鼠胚胎头部的FFPE块，优化用于高分辨率空间RNA成像平台，包括基于测序和基于影像的空间转录组学。该方案的关键目标是保持整个头部切片的组织形态和核酸完整性，特别关注发育中的颅面区域。确保这种保存水平对于在复杂多组织环境中准确解析空间基因表达模式至关重要，如发育中的腭部和牙齿结构。

近期研究强调了空间转录组学在解剖颅面发育过程中细胞异质性和谱系指定的重要性。例如，单细胞RNA测序与空间转录组学的结合，使得构建全面的牙齿发育转录图谱成为可能14,15。这些集成数据集定义了人类胚胎牙齿中独特的上皮和间充质细胞群体，揭示了谱系承诺的分子调控因子，并为早期牙发生研究提供了基础参考图谱。同样，利用空间RNA测序方法分析腭间充质揭示了硬腭成骨细胞分化背后的动态转录程序，包括晚期成骨标志物的空间限制激活16。这些发现凸显了空间转录.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有利益冲突可披露。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们衷心感谢Sergey L. Leikin博士、Elena Makareeva博士（NICHD/NIH物理生物化学科）和Jeremie Oliver Piña博士（NIDCR/NIH）在实验设计和技术支持方面的建议。感谢Iben James博士和Vivek Mahadevan博士（NICHD/NIH分子基因组核心）为基于测序的空间转录组学运行提供技术支持。我们感谢Gustaf Wigerblad博士（国家关节炎与肌肉骨骼及皮肤病研究所系统性自身免疫分支，NIAMS/NIH）为基于图像的空间转录组学提供技术支持。我们感谢Michael Kelly博士和Jatinder Singh博士（CCR单细胞分析设施（SCAF），NCI/NIH）为基于图像的空间转录组学运行提供技术支持。我们感谢NICHD动物设施工作人员在动物饲养和繁育方面的协助。 图1 是用 BioRender.com 制作的。

本稿由NIH/NIDCR资助（1RO1DE033520）资助至医学学士。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决策或手稿准备中没有任何角色。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBS热费舍尔10010023使用 在工作流程中进行洗涤
50 mL锥形管（Ambion）游离RNAse热费舍尔AM12502用于储存不同溶液中的样品
先进轨道震荡器VWR6683-470在孵育期间用于摇晃固定溶液中的组织
酒精，70%，Fisherbrand，HistoPrep费舍尔科学HC-1000-1GL用来清洁和消毒所有工作区
自动真空组织处理机徕卡生物系统ASP300S用于样品的清除、脱水、补水和蜡浸渍
玻璃罩厚度1.5,25毫米×25毫米及nbsp;科宁2850-25在 Visium HD 工作流程中用于安装幻灯片
Dako Bluing 缓冲器，现成型敏捷科技CS70230-2用于H&电色染色
带四剜的爱氨酸Y费舍尔科学22050198用于H&电色染色
Hematoxylin，Mayer's，即用水溶液敏捷科技S330930-2用于H&电色染色
HistoCore水澡 徕卡生物系统HIS2326使用浮动40-43度的截面;C 用于去除 FFPE 切片上的皱褶 
放大镜浏览器 9.0.010X 基因组公司及nbsp;用于分析Visium HD数据 
低矮型一次性刀片 DB80LX徕卡生物系统14035843496用于分段FFPE块 
中性缓冲福马林 10%阿泽尔科学NBF-4-G用来修复组织
RNaseZap RNase 去污溶液热费舍尔AM9782用于清洁和去除RNase
半自动旋转切片机徕卡生物系统RM2245请按指南中报告的FFPE区块进行分区。
带盖的滑套加热器首映 XH2004用于不同温度下的载玻片孵育
超级霜冻加幻灯片及nbsp;费舍尔科学12-550-15 用于连接Vsium HD的分段
手术刀11号英特格拉·米尔特克斯4-311用于FFPE组织的评分
Surgipath Paraplast（护送伞）徕卡生物系统39601006用于组织浸润和嵌入组织
TISsue 培养天线 100X20MM 500/CS费舍尔科学877222用于采集和解剖1倍PBS样本
超纯甘油热费舍尔15514011在CytAssist之前用于Visium HD载玻片安装盖玻片
Visium CytAssist10X 基因组公司及nbsp;PN-1000442用于Visium HD工作流程实验
Visium HD 空间 RNA 测序10X 基因组公司及nbsp;1000676用于进行空间转录组实验
Xenium 5K 原位RNA定位 10X 基因组公司及nbsp;PN-1000724用于进行空间转录组实验
氙分析仪10X 基因组公司及nbsp;PN-1000481使用Xenium和Xenium 5K RNA成像并nbsp;
异星探险者4号10X 基因组公司及nbsp;用于分析Xenium数据 
氙原位RNA定位10X 基因组公司及nbsp;1000672用于进行空间转录组实验

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thesleff, I. From understanding tooth development to bioengineering of teeth. Eur J Oral Sci. 126 (1), 67-71 (2018).
  2. Bei, M. Molecular genetics of tooth development. Curr Opin Genet Dev. 19 (5), 504-510 (2009).
  3. Roth, D. M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatial TranscriptomicsTooth MorphogenesisMouse Embryonic TissueFormalin Fixed TissueParaffin EmbeddingCraniofacial DevelopmentRNA IntegrityTissue MorphologyGene Expression ProfilingSingle Cell RNA Sequencing

Related Articles