使用冻干重组抗体组合的标准流式细胞术检测用于CAR T细胞表征

摘要

本方案展示了干燥的重组抗体组合如何通过减少变异性并简化操作流程，来加速嵌合抗原受体T（CAR T）细胞的表征。该方法可对包括CAR T细胞绝对定量在内的关键质量属性进行可重复的评估，并适用于不同的流式细胞术平台。

摘要

流式细胞术常用于评估嵌合抗原受体T细胞（CAR T细胞）的关键质量属性，包括细胞活力、表型和转导效率。传统的液体试剂工作流程需要多个制备步骤，可能引入操作者依赖性处理带来的变异和差异。预配制的干粉重组抗体试剂 panel 提供了一种替代方案，将重组抗体技术与即用型配置相结合。重组抗体具有明确的特异性，并可降低批间差异，而干粉形式则减少了制备步骤，简化了试剂操作。本文介绍了一种使用干粉重组抗体 panel 进行CAR T细胞分析的逐步工作流程。该方案包括样本染色、数据采集和数据分析，并附有工作流程的示意图概览。通过代表性染色结果展示 panel 的应用效果，并重点说明与传统液体试剂工作流程相比在实际操作时间上的差异。所提供的示例展示了这些 panel 如何用于简化CAR T细胞的多参数表征。总体而言，本研究为在基于流式细胞术的CAR T细胞分析中实施干粉重组抗体 panel 提供了一个实用的框架。

引言

CAR T细胞疗法已成为癌症治疗领域的一项重大进展，尤其在血液系统恶性肿瘤的治疗中表现突出。该方法利用患者自身的免疫系统，通过改造T细胞使其表达能够识别并靶向癌细胞的嵌合抗原受体（CAR），从而发挥治疗作用¹。然而，CAR T细胞的生产需要高度复杂的基础设施和劳动密集型的制造工艺，因此必须进行严格且标准化的表征分析，以确保产品质量和患者安全。CAR T细胞疗法的总体成本中，很大一部分来源于大量的实验室工作和质量控制（QC）程序，其中许多步骤涉及手动、多阶段的操作流程。在此背景下，转导效率和身份鉴定等关键表征参数对于评估修饰后细胞的治疗潜力至关重要²。目前常用于这些检测的流式细胞术液体染色方法存在若干挑战。加样操作的差异、试剂稳定性问题以及操作者偏差可能导致数据不一致和不准确，进而影响结果的可靠性³。

流式细胞术是CAR T细胞表征和质量控制的核心技术，能够对多种细胞参数进行详细分析。然而，该过程中常规使用的液体试剂存在诸多潜在问题^4,5。移液操作的变异性可能引入显著误差，尤其是在处理小体积和多种试剂时。此外，液体试剂随时间推移容易降解，可能影响其稳定性并导致染色结果不一致⁶。由人工配制和操作带来的操作者偏差进一步加剧了这些问题，可能导致不同实验室之间甚至同一实验室不同实验批次之间的结果差异。细胞活力、转导频率、CD3⁺计数及细胞身份等关键质量属性对于CAR T产品的安全放行至关重要。确保这些检测结果的准确性和一致性极为重要，因为它们直接影响CAR T细胞的治疗效果和安全性¹。例如，准确评估转导频率对于确定成功修饰以表达CAR的T细胞比例至关重要，而CD3⁺计数及其百分比则可反映T细胞群体的整体组成和纯度。

干燥抗体面板通过提供稳定的试剂递送、减少设置时间及降低操作错误风险，为上述挑战提供了有前景的解决方案。这些面板由预先混合的多种抗体混合物经干燥制备而成。干燥后，面板具有良好的稳定性且可直接使用，无需复杂的制备步骤，从而最大限度地减少了人为误差的可能性^6,7。重要的是，使用前无需对这些干燥面板进行重悬——可直接将细胞悬液加入干燥的抗体混合物中。将重组抗体整合入此类干燥形式中，相较于传统的多克隆抗体或杂交瘤来源的试剂具有多项优势。其分子结构明确，可确保批间高度一致性和可重复性，从而降低不同实验及实验室之间的变异性。基于人IgG1设计的工程化Fc区可最大限度地减少交叉反应和背景染色。因此，无需进行Fc封闭步骤，进一步缩短了流式细胞术检测所需的时间。干燥形式可保护试剂免受降解，长期保持其效能及批间一致性。这种一致性对于获得可靠且可重复的流式细胞术检测结果至关重要⁸。

干燥试剂形式的适用性贯穿于CAR T细胞治疗开发与监测的各个阶段。在生产质量控制中，干燥试剂有助于实现封闭系统的取样，确保无菌性和一致性，这在临床环境中尤为重要，因为维持样本的完整性至关重要⁹。在产品表征方面，干燥试剂能够准确评估绝对计数和免疫细胞亚群，这对于确定CAR T细胞的治疗质量至关重要。此外，在科研环境中，干燥试剂在患者的长期监测中具有重要价值，可实现对CAR T细胞持久性的持续追踪，这对于理解该疗法的长期有效性和安全性至关重要。

在流式细胞术中使用预干式抗体组合具有多种优势，其中最重要的一点是，通过提供完全预配置的抗体组合，避免了手动重悬和混合单个试剂的操作，从而减少移液误差。与仍需复溶和移液的单个干粉抗体不同（这类抗体主要优势在于延长保存期限），预组装的干粉抗体组合消除了多个手动操作步骤。这简化了实验流程，显著降低了因操作人员差异带来的变异性。因此，整个实验过程的出错概率更低、耗时更少，且对专业技术培训的依赖程度降低，使更广泛的实验室均可开展相关检测¹⁰。此外，干粉重组抗体组合具有稳定且即用型的特点，可确保不同操作人员和不同实验地点之间检测结果的一致性和可靠性⁹。

为了充分实现干燥试剂技术在流式细胞术中的潜力，必须建立一套逐步操作的使用方案。该方案应包括干燥抗体 panel 染色、数据采集和自动化分析的操作指南，确保整个流程的各个环节均实现标准化，并优化其准确性和效率。通过提供清晰且全面的操作流程，实验室可以获得一致且可靠的结果，从而促进 CAR T 细胞产品的安全有效放行²。本文提供了一种利用干燥抗体 panel 优势的实验方案，以克服传统液体染色方法的局限性，进而提高实验的可靠性、效率和可重复性——这些关键特性对于确保 CAR T 细胞治疗的安全性和有效性至关重要（图 1）。

方案

所有人体样本均在获得书面知情同意后，从健康的匿名志愿者处采集。所有操作均经北莱茵医师协会伦理委员会（#2020272）批准，并依照必要的伦理和生物安全规定进行。

1. 样品采集与制备

1. 从制备袋中无菌采集嵌合抗原受体T细胞（CAR T细胞）样品，用于生产质量控制。
2. 应及时处理样品以维持细胞活性。在染色前将样品置于2–8 °C避光保存。
3. 染色前测定每个样品的细胞数量。
4. 使用磷酸盐缓冲液（PBS）/2 mM EDTA/0.5% BSA缓冲液（pH 7.2），将每个样品调整至每100 µL含最多10⁶个有核细胞的浓度。
   1. 如有需要，将样品在300 × g 条件下离心5分钟，彻底吸除上清液。
   2. 将细胞重悬至适当浓度。

2. 干燥玻片染色

注意：使用两种预配制的冻干抗体组合对样本进行染色：冻干重组人免疫细胞组成（ICC）混合抗体和冻干重组人CAR-T转导混合抗体。CAR-T转导检测面板中的CAR染色至关重要。为准确测定转导频率，必须可靠地区分CAR阴性细胞与CAR阳性细胞。洗涤步骤可能导致细胞在离心和吸液过程中丢失，从而降低细胞回收率。因此，在需要准确细胞浓度时，通常优先采用免洗涤方案。

1. ICC 混合抗体（免洗涤方案）
   1. 将 100 µL 制备好的细胞悬液直接加入干燥的 ICC 抗体管中。通过移液吹打和/或短暂涡旋混匀，充分溶解沉淀。在避光条件下室温（19–25 °C）孵育 10 分钟。
   2. 确认干燥的抗体沉淀已完全溶解。无需洗涤，直接进行上机检测。
2. CAR T 转导混合液（洗涤方案）
   1. 将 100 µL 制备好的细胞悬液加入干燥的 CAR T 转导管中。
   2. 加入适量的 CAR 检测试剂（例如 2 µL）。通过移液吹打和/或短暂涡旋混匀，充分溶解沉淀。在避光条件下室温（19–25 °C）孵育 10 分钟。确认干燥的抗体沉淀已完全溶解。
   3. 加入 1 mL 缓冲液洗涤细胞。在 300 × g 条件下离心 5 分钟。彻底移除上清液。
3. 二抗染色（如需要）
   1. 对生物素标记的 CAR 检测试剂执行第二次洗涤（参见步骤 2.2.3），以去除游离的生物素偶联试剂并降低背景染色。
   2. 将细胞重悬于 98 µL 缓冲液中。加入 2 µL 藻红蛋白（PE）标记的二抗。短暂涡旋混匀。在避光条件下室温（19–25 °C）孵育 10 分钟。
   3. 洗涤细胞以去除未结合的二抗（参见步骤 2.2.3）。
4. 上机前最终处理
   1. 用缓冲液将所有染色样本（CAR T 转导混合液和 ICC 混合抗体）调整至 300–500 µL 体积。避免光照，并置于 2–8 °C 保存。
   2. 应在 1 小时内完成上机检测，以维持荧光染料的稳定性和细胞活性。

3. 流式细胞术数据采集与分析

1. 准备并启动流式细胞仪，确保校准和仪器设置已优化。
2. 打开激光器并冲洗流体系统。光学平台至少预热 30 分钟。
3. 预热期间，使用 1% 次氯酸盐溶液运行清洗程序。
4. 使用校准微球调整激光设置。
5. 使用匹配的抗体组合制备单染对照样本用于补偿：
   1. 对于微球：加入适量的阳性与阴性对照微球。
   2. 对于细胞：加入 100 µL 细胞悬液。
   3. 对于生物素标记试剂：加入含有 98 µL 缓冲液和 2 µL PE 标记二抗的管。
   4. 确认补偿试剂与抗体混合物匹配（批号一致）。
6. 将对照样本孵育 10–20 秒，涡旋振荡 5 秒，然后在 19–25 °C 避光孵育 10 分钟。
7. 用 600 µL 缓冲液稀释样本并充分混匀。
8. 使用单染对照样本进行补偿设置。
9. 调整 FSC 和 SSC 电压，并设定阈值以排除碎片。
10. 每份样本至少采集 50,000–100,000 个活淋巴细胞。
11. 进行设门分析，评估细胞活力、CD3 表达及 CAR 表达。
12. 如需绝对定量，确定 CAR 阳性 T 细胞的比例（f₍CAR T₎）。
13. 将总白细胞（N₍total₎）定义为排除碎片后具有活性且 CD45⁺ 的单个细胞。
14. 若仪器支持，可通过 ICC 染色样本直接计数获得总白细胞数，或使用计数微球或血细胞分析仪进行测定。
15. 计算 CAR T 细胞浓度：
    
    注：根据 图 2 和 图 3 中的数据进行示例计算
    ​
    
16. 可在不同仪器和工作流程中应用此方法进行 CAR T 细胞定量。

结果

应用冻干重组抗体试剂盒对CAR⁺ T细胞样本进行染色，以展示流式细胞术染色工作流程。如图1所示，使用预配制的冻干抗体试剂盒替代传统的液体试剂工作流程，可省去多个准备步骤——包括试管标记（用于标明试剂盒的抗体组成；每个试管仍需标注相应的样本编号）、试剂混合及手动混匀——从而简化染色过程。试管上带有标签，可使用兼容的流式细胞仪进行扫描或人工读取，为样本识别提供灵活的选择。

代表性示例表明，干燥的免疫细胞组成检测面板可用于鉴定关键的白细胞亚群（图2），而干燥的CAR T转导检测面板则可用于可视化表达CAR的T细胞并评估转导效率（图3）。这些检测面板无需进行Fc阻断，且整个抗体组合仅需使用一种同型对照。这些示例突出了干燥检测面板在CAR T细胞多参数分析中的应用，并展示了如何通过减少操作步骤实现高效的工作流程。本研究中所用干燥抗体面板的组成详见表1。

图4展示了使用预干式试剂板后，无论对于经验较少还是经验丰富的操作者，代表性实验的准备时间均有所缩短。预干式格式简化了染色流程，减少了人工操作步骤，并为工作流程的实施和人员培训提供了实用指导。重要的是，使用预干式抗体混合物所获得的免疫细胞亚群频率与传统液态抗体混合物所得结果相当（图 5）。此外，预干式抗体面板在室温下稳定，可在常温条件下储存长达一年有效期，而传统液态抗体通常需要低温保存。这种稳定性支持试剂的重复使用、长期研究以及更简便的库存管理。

综上所述，所提供的示例展示了如何利用冻干重组抗体组合来简化CAR T细胞的多参数表征。总体而言，本研究为在基于流式细胞术的CAR T细胞分析中应用冻干抗体组合提供了一种实用方法，具有操作简便、减少制备步骤以及可灵活调整组合配置的优点。

图 1： 手动染色工作流程与冻干重组抗体试剂盒的比较。 传统的手动操作流程（上方）包含多个准备步骤，如试管标记、试剂混合与添加样本，可能增加实际操作工作量。相比之下，冻干重组抗体试剂盒流程（下方）采用预混并冻干的抗体组合，仅需加入样本即可。这种简化的操作方式减少了人工步骤，使染色过程更简便，体现了工作流程的高效性与实际应用的便捷性。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2： 使用冻干重组抗体组合“免疫细胞组成混合物”染色的白细胞分离样本的流式细胞术分析。 （A）通过FSC与SSC设门排除碎片，以包含所有细胞。（B）使用FSC-A与FSC-H设门去除双联体。（C）通过CD45⁺细胞设门鉴定白细胞，从而排除残留的红细胞。（D）利用7-AAD染色排除死细胞。（E,F）鉴定CD3⁺细胞，并根据CD56表达进一步分类为（E）T细胞和（F）NKT细胞。（G）T细胞随后被分为CD4⁺和CD8⁺亚群。（H）在CD3^–细胞群中，单核细胞由CD14表达定义，B细胞由CD19表达定义。（I）剩余的CD14^–/CD19^–细胞被进一步划分为SSC高/CD16^–嗜酸性粒细胞、SSC高/CD16⁺中性粒细胞，以及SSC低/CD56⁺/CD16⁺细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3： 使用干燥重组抗体组合“CAR T Transduction Cocktail”染色的CD19 CAR T细胞（FMC63）的流式细胞术分析。 （A）通过FSC与SSC设门排除碎片，以包含所有细胞。（B）使用FSC-A与FSC-H设门去除双联体。（C）通过CD45⁺细胞设门鉴定白细胞。（D）根据7-AAD⁻染色排除死细胞。（E,F）鉴定CD3⁺细胞，并进一步分为CAR⁺和CAR⁻细胞群。（G）CAR⁺和（H）CAR⁻细胞进一步细分为CD4⁺和CD8⁺ T细胞亚群。（I）在CD3⁻细胞群中，通过CD14表达鉴定残留的单核细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：使用预冻干抗体组合在不同经验水平下实现的时间节省。 针对无经验（左）和有经验（右）的操作者，评估了从实验开始至孵育开始前完成流式细胞术实验设置所需的时间（使用预冻干重组抗体组合“免疫细胞组成混合试剂”，技术重复三次），包括试剂处理、移液和记录等步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

图5： 裂解全血的流式细胞术分析，叠加使用干粉重组抗体组合“免疫细胞组成混合物”染色的样本（蓝色）与使用相同抗体液态形式染色的样本（橙色）。 （A）通过FSC与SSC设门排除碎片，以包含所有细胞。（B）使用FSC-A与FSC-H设门去除双联体。（C）通过CD45⁺细胞设门鉴定白细胞，从而排除残留的红细胞。（D）利用7-AAD染色排除死细胞。（E）鉴定CD3⁺细胞。（F）根据CD56表达将这些细胞进一步分为T细胞和NKT细胞。（G）T细胞随后被分为CD4⁺和CD8⁺亚群。（H）在CD3^–细胞群中，单核细胞通过CD14表达定义，B细胞通过CD19表达定义。（I）剩余的CD14^–/CD19^–细胞被进一步划分为SSC高/CD16^–嗜酸性粒细胞、SSC高/CD16⁺中性粒细胞以及SSC低/CD56⁺/CD16⁺细胞。（J）比较了使用液态抗体与干粉试剂组合获得的细胞频率。 请点击此处查看该图的放大版本。

目的	V1 VioBlue	V2 VioGreen	B1 FITC	B2 PE	B3 7-AAD PerCP-Vio 700	B4 PE-Vio770	R1 APC	R2 APC-Vio770
检测细胞活力及免疫细胞组成	CD45	CD4	CD3	CD56/CD16	7-AAD	CD19	CD14	CD8
检测CAR T细胞的转导效率	CD45	CD4	CD3	CAR检测试剂	7-AAD	/	CD14	CD8

表1： 用于CAR T细胞分析的冻干重组抗体组合物组成。 本表格列出了每个冻干组合中包含的抗体，指明了靶抗原、克隆号、荧光染料以及每管的常规用量。展示了两个组合：“免疫细胞组成”组合用于主要白细胞亚群的鉴定，“CAR T转导”组合用于检测CAR表达及T细胞亚群特征分析。该信息为工作流程的实施提供了参考，并可根据需要选择性地联合额外的液相偶联抗体进行调整。

讨论

干燥的重组抗体组合为实验室中CAR T细胞的表征提供了简化且实用的工作流程。预配制的形式减少了准备步骤并简化了操作过程，有助于降低操作者依赖性变异，支持多参数流式细胞术操作的一致执行⁸。代表性示例展示了这些抗体组合在识别白细胞亚群、检测CAR表达以及评估T细胞亚群中的应用。此外，这些组合还可补充额外的液态偶联抗体，以纳入更多标记物或免疫亚群，从而灵活适应特定实验需求或多参数分析。

准确检测CAR对于可靠确定转导频率至关重要¹。当CAR表达水平存在差异时，CAR阴性与CAR阳性细胞群的清晰区分依赖于优化适当的染色条件。荧光减一对照（FMO）等对照样本有助于准确设门。在某些情况下，洗涤步骤可通过去除未结合的抗体来提高区分度；然而，这些步骤可能因离心和吸液过程中的细胞损失而降低细胞回收率。因此，在需要准确定量细胞时，可能更倾向于采用免洗涤的工作流程。

尽管该方法理想情况下应使用可识别工程化CAR胞外域的CAR特异性检测试剂，但也可采用其他替代试剂，例如靶向抗原结合域与信号域之间保守连接区的抗体。这些替代试剂能够实现对表达CAR的细胞的检测，在CAR特异性试剂不可获得的情况下，经过适当优化后可将其整合到实验流程中。

与自动化采集和分析系统（包括快速模式）的整合可进一步简化数据收集和分析过程，减少人工操作时间，并实现不同操作人员之间工作流程的一致性执行。

尽管本研究展示了该方法，但尚未针对受监管的生产或放行检测进行正式的分析验证。目前尚未开展多中心验证，因此该方法在不同实验室间的可重复性仍有待确认⁵。该方法依赖于预配置的检测面板，可能在高度专业化的应用中灵活性受限。然而，可设计定制的冻干面板，以包含特定标志物或组合，从而实现个性化的实验流程，并克服标准面板的局限性。虽然成本因素需加以考虑，但因其显著减少了人工操作时间并简化了操作流程，整体成本得以平衡，这在高通量实验流程中可能具有显著优势。

未来的研究可侧重于定量性能评估、用于监管用途的正式验证，以及扩展至多中心研究，以评估不同实验室间工作流程的一致性。定制化panel设计是一种切实可行的途径，可用于扩展标志物覆盖范围，解决特定的实验问题，或适应纵向免疫监测研究。

总之，干燥的重组抗体组合为CAR T细胞流式细胞术提供了一个灵活且实用的平台。该平台减少了制备步骤，简化了操作流程，并支持灵活的实验设计，包括自定义组合配置。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
（可选）生物素抗体，PE，REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-951	仅在使用生物素偶联的CAR检测试剂时需要。
（可选）CAR T细胞表达模式分析软件包	Miltenyi Biotec	160-002-376	MACSQuant分析仪的软件附加模块；支持自动化设门和数据分析，但也可进行手动分析。
可在PE通道检测的CAR检测试剂（可选）， 例如：CD19 CAR检测试剂，人源，生物素标记	Miltenyi Biotec	130-129-550	其他可选试剂：CD19 CAR FMC63独特型抗体，PE，REAfinity（130-127-342）；CD22 CAR检测试剂，人源，生物素标记（130-126-727）；BCMA CAR检测试剂，人源，PE标记（130-133-888）
流式细胞仪，例如MACSQuant Analyzer 16	Miltenyi Biotec	130-109-803	StainExpress管适用于所有标准流式细胞仪。
StainExpress CAR T转导试剂盒，人源	Miltenyi Biotec	130-127-638	可通过当地Miltenyi Biotec代表或技术支持团队申请定制干燥抗体 panel 配置。
StainExpress免疫细胞组成检测试剂盒，人源	Miltenyi Biotec	130-127-637	可通过当地Miltenyi Biotec代表或技术支持团队申请定制干燥抗体 panel 配置。