基于微珠的多重流式细胞术分析用于CAR T细胞功能剖析

摘要

本文介绍了一种多重珠状流式细胞术测定，用于定量嵌合抗原受体（CAR）-T细胞来源上清液中最多12种细胞因子和效应分子，从而在小样本量下快速且可重复地分析工程T细胞功能。

摘要

由于CAR T细胞的异质性、复杂的免疫反应以及样本供应有限，分析CAR T细胞存在挑战。多重检测通过同时检测包括细胞因子、趋化因子和细胞毒性介质在内的多种效应分子，实现功能评估。本文介绍了一种基于珠子的多重检测法，该方法与流式细胞术兼容，用于分析人类嵌合抗原受体（CAR）-T细胞的效应子分子分泌。CAR T细胞上清液与多种捕获珠混合孵育，这些收集珠由多个荧光编码的群体与分析物特异性抗体结合。这些珠子结合样品中的可溶性靶点，形成珠状-分析物复合物，随后通过标记检测抗体检测。该检测包括一组免疫介质，如干扰素（IFN）-γ、白介素（IL）-2、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-6、IL-10、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和Granzyme B。使用预定义标准可以定量测量单个样本中的多种分析物。数据采集和分析可以通过仪器相关或基于网络的软件工具提供的自动门控方法进行，从而促进数据处理。总之，所提出的多重检测法能够对CAR T细胞功能进行多参数分析，并可应用于研究、质量控制测试、机理研究和功能表征等领域。

引言

功能特征分析在嵌合抗原受体（CAR）T细胞检测中至关重要，因为它为了解这些疗法的效力、安全性及作用机制提供了见解。了解细胞因子和细胞毒性介质特征有助于评估治疗效果及潜在不良反应，确保安全有效的治疗方法的开发。传统的单组检测方法如酶联免疫吸附分析（ELISA）存在局限性，如需要大量样本量、较长处理时间以及每个分析物分别运行，同时^{单个样本内}动态范围^有限。相比之下，多重珠子测定法能够同时检测多个可溶介质，减少处理时间和样品需求，同时增加动态范围^1,2。这种高效且深入的分析使多复用检测成为推动CAR T细胞研发的重要工具 ^3,4,5。

本研究提出的多重检测方法使用捕获珠，这些收集珠在荧光素异硫氰酸酯（FITC）和藻氨酸（PE）通道中具有明确的荧光谱，并涂有针对可溶性分析物的特异性抗体。在与样品一起培养过程中，这些珠子会选择性结合溶液中的目标分析物。分析物捕获后，加入检测抗体形成分析物特异性夹心复合物。这些抗体要么直接结合于异氰素（APC）（直接检测），要么结合生物素（间接检测）。间接检测需进行后续与APC结合抗生物素抗体的潜伏（见图1）。所得的复合物——包括捕捉珠、分析物和检测抗体——通过流式细胞术分析以定量分析物浓度。多重检测是一种基于板的技术，包括用于生成分析物特异性标准曲线^的预定义标准^1,2。

图1：细胞因子技术原理与检测工作流程。 该检测方法基于12个荧光编码的捕获珠群与分析物特异性抗体。在样本培养过程中，会形成珠状-分析物复合物，这些配合物可以通过使用特异性检测抗体进行流式细胞术检测。检测流程包括：1）在滤纸板上制备分析物标准和样本，2）用Capture珠培养，3）用生物素标记的抗分析物抗体培养形成夹心复合物，4）用APC标记的抗生物素抗体培养，5）缓冲液中再悬浮进行测量，6）样本采集。 请点击此处查看该图的放大版本。

本研究中描述的多重复用测定法兼容配备蓝光（例如488纳米;FITC和PE通道）以及一束红色激光（例如，635纳米;APC频道）。由于流式细胞仪在研究实验室、临床环境和质量控制环境中广泛使用，这种兼容性有助于实现而无需额外的专用仪器⁵.在CAR T细胞功能测试的背景下，这种方法使得在常见的分析流程中对功能反应进行多参数评估成为可能^6.该检测法为CAR T细胞研究带来了显著优势，能够同时定量关键分析物，包括GM-CSF、Granzyme B、干扰素（IFN）-γ、白介素（IL）-2、IL-4、IL-6、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-21、单核细胞化学吸引蛋白-1（MCP-1）、Perforin和肿瘤坏死因子（TNF）-α（人体细胞毒性面板）。这些介质对于理解CAR T细胞的激活、效应器功能以及安全性相关的细胞^因子释放4,5,7,8至关重要。

检测工作流程包括使用仪器相关软件以及仪器无关的基于网络的分析工具进行自动门控和数据分析选项⁵.这些功能通过减少人工干预的程度，支持简化CAR T细胞效应分子剖析数据的处理。自动分析的使用有助于提高数据处理的一致性，并促进功能读数的更高效评估⁸.

本方案概述了一种可重复且可扩展的多重复用方法，用于CAR T细胞免疫介质分析。通过在单样本中测量12种不同的分析物，该方法对机制性调查、早期研究及相关研究尤为重要。在CAR T细胞治疗的后期阶段，减少检测的细胞因子数量可能有益，尤其是在受控且时间敏感的质量控制环境中进行药物释放检测。为此，可以从所展示的面板中组装1至7个细胞因子，设计定制的细胞因子检测法，以验证工程化T细胞分析。这使得该方案非常适合在CAR T^{细胞治疗早期}和晚期的多样研究和质量控制环境中应用，3,4,5,9。

方案

所有人体样本均在获得书面知情同意后，从健康的匿名志愿者中采集。所有程序均由北莱茵铁路公司（#2020272）伦理委员会批准，并按照所需的伦理和生物安全法规执行。

1. CAR T细胞共培养

1. 在无对应抗原（例如抗原呈递肿瘤细胞）的情况下，以2.5：1（效应子：靶细胞）的比例，准备工程化的人类CAR T细胞培养。
2. 定义一个或多个时间点用于收集上清液，以分析分泌的细胞因子一次，或在特定时间范围内进行细胞因子动力学分析，例如4、8、16、24和48小时。
   注意：上清液可以直接使用，也可以冷冻保存以备后续使用。

2. 标准和样品制备

1. 通过向沉淀中加入200微升缓冲液或细胞培养基，轻轻混合，重新合成分析物标准。准备六个试剂管，对重组标准品进行1：5稀释序列，浓度降至3.2 pg/mL或0.6 pg/mL（视分析物而定），并制备一个空白样品。
2. 收集CAR T共培养上清液，例如共培养后16小时或24小时。可选地，利用流式细胞术采集CAR T细胞进行平行表型鉴定。
3. 在10,000 × g 、4°C下离心10分钟。 上清液可以纯饮或稀释以符合标准曲线范围。

3. 检测工作流程

1. 用漩涡捕捉珠混合物彻底重新悬浮。将50微升标准样品或样品，以及20微升预稀释珠子加入96孔滤板的孔中。
2. 在室温下孵育2小时，摇晃450转/分钟，在黑暗中。用真空歧管或离心机用200微升缓冲液清洗井两次。
3. 加入100微升1：50预稀释的检测试剂1（缓冲液中）。在室温下孵育1小时，摇晃转速450转/分钟，在黑暗中。洗两次。
4. 加入100微升1：50预稀释检测试剂2（缓冲液中）。在室温下孵育30分钟，摇晃时转速450转/分钟，在黑暗中。洗一次。
5. 采集时，将样品重新悬浮在200微升缓冲液中。分析工作流程概述见 图1。

4. 获取与数据分析

1. 在配备蓝光和红光激光的流式细胞仪上采集数据（需PE、FITC和APC通道）。使用MACSQuant流式细胞仪时，使用 快速模式 模板进行全自动门控和数据分析。
2. 或者，将FSC或MQD数据文件上传到基于网页的InspectoR工具，该工具自动进行定量细胞因子测量，并提供可导出的即用结果，不受所用仪器限制。
3. 确保FITC与PE通道中12种不同捕捉珠的正确分离。
4. 应用标准曲线计算细胞因子浓度，并导出和可视化结果。
5. 在MACSQuant流式细胞仪上采集数据时，使用捕获珠瓶的二维条码，该条码包含所有相关采集设置。
   1. 登录软件后，选择 MACSPlex滤镜 板作为样本架，点击工具栏上的 条码 按钮激活2D码读取器。
   2. 将小瓶递给读者，确保代码对着闪烁的光，距离为0.5–2.5厘米。
   3. 在自动标签页中，分配捕获珠（MPx Cyt T-NK，h）和无标签。对于细胞毒性T/NK细胞标准的序列稀释，定义基团位置，并在设置标签中选择带有类型分析的快速模式和MACSPlex_Standard模式，并根据需要轻柔混合。
   4. 未知样本也以类似方式分配，位置定义，可选分组，并在设置标签中选择快速模式、类型分析和模式：MACSPlex_Sample，包括可选的样本ID和描述。
   5. 确认 实验 表中的机架定义正确，确保滤板井液位正常，然后开始测量。

结果

编码12种可溶分析物的代表性捕获珠群的鉴定

利用流式细胞仪的FITC和PE通道识别捕获珠群。在双轴图中，代表单个分析物的不同珠簇清晰分辨，包括IL-10、Granzyme B、MCP-1、IL-17A、Perforin、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-21、IL-4和GM-CSF（见图2）。每个群体都表现出独特的荧光特征，证实了多重检测的成功，以及测得的细胞因子和效应分子的清晰区分。

图2：代表性多工捕获珠群的检测。 捕获珠具有固有的荧光强度，可用于区分不同分析物特异性群体。散射图显示了基于荧光强度在FITC（B1）和PE（B2）通道中分析物特异性信号的分离情况。图像展示了12个捕捉珠群的代表性特征，编码GM-CSF、Granzyme B、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-21、MCP-1（CCL2）、Perforin和TNF-α。 请点击此处查看该图的放大版本。

与肿瘤细胞共培养后CAR T细胞的代表性细胞因子浓度谱

在CAR T细胞与肿瘤靶细胞共培养后，利用多重检测的人体细胞毒性面板定量细胞因子浓度（见图3）。CAR T细胞分泌高水平的Granzyme B（49,950.2 pg/mL）、IFN-γ（48,367.8 pg/mL）、TNF-α（7,055.2 pg/mL）和GM-CSF（6,653.5 pg/mL），表明对肿瘤结合具有强效活化和细胞毒性效应功能。IL-2水平超过检测上限（>10,000 pg/mL），符合强烈的增殖信号。样本未进一步稀释或重新测量。相比之下，与调控或替代辅助T细胞反应相关的细胞因子，包括IL-6、IL-10、IL-17A、IL-21和MCP-1，存在的水平低或几乎检测不到。这些结果表明CAR T细胞主要采用1型（Th1/细胞毒性）免疫反应，表现为高效应因子活性和有限的免疫抑制细胞因子产生。

图3：与肿瘤细胞共培养后的CAR T细胞代表性细胞因子谱。工程化嵌合抗原受体（CAR）T细胞与JeKo-1肿瘤细胞共培养了一夜。培养16小时后采集细胞培养上清液，并离心去除颗粒。稀释样本使用多重检测的人体细胞毒性面板进行分析。进行了两条标准曲线，确定了所有12种分析物的浓度。展示了使用流式细胞仪的表达模式分析和计算分析物特异性浓度的代表性数据输出。柱状图及附表显示了12个效应分子的计算水平（皮克/毫升）。请点击此处查看该图的放大版本。

抗原特异性刺激下CAR T细胞的细胞因子分泌动力学

在CAR T细胞与表达（抗原）或缺乏（抗原）相关抗原的靶细胞共培养后，利用多重检测的人体细胞毒性面板对细胞因子分泌进行长期监测。CAR T细胞在识别抗原/靶点后表现出快速且强健的细胞因子释放，Granzyme B、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-2在8–24小时内强烈上调，48小时达到峰值（见图4）。这一模式表明抗原结合后具有强效的激活和细胞毒性效应器功能。IL-6、IL-17A和IL-21也中度上升，而IL-4、IL-10、MCP-1和Perforin则保持低位或适度升高。相比之下，与抗原/靶点的共培养在所有分析物中细胞因子诱导极小（见图4）。综合来看，这些数据表明CAR T细胞的激活和效应细胞因子的产生是针对抗原识别的特异性反应，并且随时间增强。

图4：与抗原阳性或抗原阴性靶细胞共培养的CAR T细胞效应分子分泌动力学。工程化嵌合抗原受体（CAR）T细胞与表达（抗原）或缺乏（抗原）相关CAR T细胞抗原的靶细胞共培养4、8、16、24和48小时。在每个时间点，收集并利用多重检测的人体细胞毒性面板分析培养上清液，以定量广泛的可溶效应物分析样本。显示12种分析物的细胞因子动力学（皮克/毫升）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

多重检测用于分析CAR T细胞共培养中的可溶性免疫介质反应。与抗原阳性靶细胞共培养的CAR T细胞分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、Granzyme B和IL-2，符合效应激活和细胞毒性功能^4,5,8。相比之下，抗原阴性对照组细胞因子生成较低，显示该检测^{在测试条件下}能够区分抗原特异性反应^5,8。这些结果支持该检测法在评估CAR T细胞功能方面的适用性，包括在效力相关分析、安全性相关分析和机理研究中的应用。

虽然固定的12分析物面板提供了CAR T免疫活性的广泛概览，但在所有应用中捕捉全部分析物范围可能不现实。对于如检测验证或CAR T细胞产品的质量控制（QC）等重点工作流，面板可以缩放至缩减至缩减子集（如IL-2、IFN-γ和TNF-α），以简化分析流程并保持功能敏感性^1,2。

该方案的关键步骤包括设计CAR T细胞共培养及适当选择采样条件。特别地，共培养时间和效应细胞数（E：T比）直接决定细胞因子大小，应在测定^5、6阶段确定。此外，样品稀释应调整以确保分析物浓度落在测定的动态范围内 ^1,2。因此，排查应重点在验证标准曲线表现，并在信号超出可量^化范围时调整共培养条件或稀释因子^1,2。

与传统的单重ELISA相比，基于流式细胞术的多路复用平台能够从极少的样本量生成高密度、多分析的数据集。通过允许同时测量单个样品内的多个分析物，复用可以减少整体试剂消耗，提高样品通量，并相较于多次单组测定缩短测定时间^1,2。自动化采集和标准化分析选项有望减少用户依赖的变异性，支持在实验或制造环境中的重复性和可扩展性 ^5,8。标准ELISA检测灵敏度通常在16到2000 pg/mL之间（高灵敏度试剂盒可能更低）⁷。在本研究所展示的平台上，最低可检测浓度范围为最敏感分析物的0.05 pg/mL，而检测灵敏度本身较低的检测物则约为93.8 pg/mL。在内部评估中，超过74%的检测指标检测限低于5 pg/mL，38%检测到低于1 pg/mL，凸显了系统的整体灵敏性。由于多重敏感性可能因细胞因子而异，表位竞争仍是一个重要考虑因素。为最大限度减少干扰，测定采用不重叠的表位捕捉和检测每个分析物，从而减少竞争相关偏差，提高多路复用条件下的测量可靠性。

多重测定性能可能因分析灵敏性和生物学环境而异，在特定条件下分析物浓度可能接近检测上限，因此应在检测设置时评估。相反，某些分析物（如本研究中的MCP-1和IL-4）可能因实验条件而无法检测。此外，样品处理等前分析因素会影响细胞因子测量，应保持一致的处理条件以确保可比性。

总体而言，这种多重方法能够高效且定量地表征CAR T细胞功能。与大多数现有多重细胞因子检测平台相比，该检测与标准流式细胞仪兼容，并包含仪器相关的软件工具，便于简化数据采集和分析。虽然多重细胞因子检测已应用于其他免疫环境，但本研究展示了其在标准化工作流程中CAR T细胞功能分析的应用。基于微珠的格式允许同时检测多种分析物，支持比单复用方法更高的通量。潜在应用包括药物产品的功能评估，如CAR结合剂评估、载体优化和工艺开发。该检测的可扩展性和自动化分析能力还支持效力测试、安全性分析以及旨在理解CAR T细胞行为和功能的机制研究^5,7,8。

虽然细胞因子分泌谱为体外CAR T细胞激活和功能效力提供了宝贵见解，但它们无法完全复制决定患者治疗效果的复杂生物学结构。肿瘤微环境、抗原密度、免疫调控和体内持续性等因素，都会影响CAR T细胞表现，超出受控测定6^、8、10的范围。然而，建立如多重细胞因子剖析等稳健且标准化的功能性测定，是实现^药品功能特性分析的重要一步^3,4。细胞因子模式不仅表明CAR T细胞活性，还与毒性现象密切相关，包括细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS^）3,6,7。目前，测量方法和报告的差异限制了跨试验的可比性，凸显了标准化、可重复免疫介质谱分析的必要性 ^1,2,3。随着分析技术和临床数据集的不断进步，最终目标是定义能够可靠反映治疗潜力和患者安全性的预测分泌特征，弥合临床前效力检测与临床疗效之间的差距。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human	Miltenyi Biotec	130-125-800	用于流式细胞术的基于珠子的多重细胞因子检测
MACSPlex InspectoR Tool	Miltenyi Biotec	\	用于自动网格和MACSPlex数据分析的基于网络的工具
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-096-343	多重数据测量的流式细胞术仪器
MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-109-803	多重数据测量的流式细胞术仪器
MACSQuant Express Mode	Miltenyi Biotec	\	用于自动网格和分析的软件
TexMACS Medium	Miltenyi Biotec	130-097-196	优化的无血清细胞培养基，专为人类和小鼠T细胞的培养和扩展而开发