Research Article

用于CAR T细胞功能分析的基于珠子的多重流式细胞术检测

DOI:

10.3791/70344

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July 10th, 2026

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1Miltenyi Biotec, 2Lehrstuhl für Zelluläre Immuntherapie, Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universitätsklinikum Würzburg, 3Außenstelle Zelluläre Immuntherapie, Fraunhofer Institut für Zelltherapie und Immunologie (IZI), 4IRCCS Bambino Gesù Children's Hospital

In This Article

Summary

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本文介绍了一种基于多重珠子的流式细胞术检测方法，用于定量分析来自嵌合抗原受体（CAR）-T细胞上清液中的多达12种细胞因子和效应分子，能够在小样本体积下快速、重复性地分析工程化T细胞的功能。

Abstract

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由于CAR T细胞的异质性、复杂的免疫反应以及样本可用性有限，对其进行分析存在挑战。多重检测法通过允许同时检测广泛的效应分子（包括细胞因子、趋化因子和细胞毒介质）来实现功能评估。在此，我们描述了一种与流式细胞术兼容的基于珠子的多重检测法，用于分析人源嵌合抗原受体（CAR）-T细胞分泌的效应分子。CAR T细胞上清液与包含多种荧光编码人群的捕获珠子混合物一起孵育，这些珠子与分析物特异性抗体偶联。这些珠子与样本中的可溶靶标结合，形成珠子-分析物复合物，随后使用标记的检测抗体进行检测。该检测法包括一系列免疫介质，如干扰素（IFN）-γ、白介素（IL）-2、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-6、IL-10、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和颗粒酶B。使用预定义的标准可以对单个样本中的多种分析物进行定量测量。数据获取和分析可以使用仪器相关或网络软件工具提供的自动分区方法进行，从而促进数据处理。总之，所介绍的多重检测法能够对CAR T细胞功能进行多参数分析，并可应用于研究、质量控制测试、机制研究和功能表征等背景中。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

功能表征在嵌合抗原受体（CAR）T细胞测试中至关重要，因为它提供了这些疗法的效力、安全性和作用机制的洞察。了解细胞因子和细胞毒介质特征有助于评估治疗效果和潜在的不良反应，确保开发出安全有效的治疗方法。传统的单一测定法如酶联免疫吸附试验（ELISA）存在一些局限性，如需要大量样品、较长的处理时间，以及对每种分析物进行单独运行，同时在单个样品中提供有限的动态范围1,2。相比之下，多重珠子基测定法能够同时检测多种可溶介质，减少处理时间和样品要求，同时增加动态范围1,2。这种效率和深度分析使多重测定法成为推进CAR T细胞研究和开发的宝贵工具3,4,5。

本研究中介绍的多重测定法利用捕获珠子，这些珠子在荧光素异硫氰酸酯（FITC）和叶绿素（PE）通道中展现出定义的荧光特征，并被涂覆有针对可溶分析物的特定抗体。在与样品孵育过程中，这些珠子选择性地从溶液中结合其目标分析物。在分析物捕获之后，添加检测抗体以形成分析物特异性的三明治复合物。这些抗体要么直接结合于藻胆蛋白（APC）（直接检测），要么结合于生物素（间接检测）。对于间接检测，需要随后进行与APC结合的抗生物素抗体的孵育（图1）。由此形成的复合物——包括捕获珠子、分析物和检测抗体——通过流式细胞术进行分析以量化分析物浓度。多重测定法是一种基于板的技术，包括用于生成特定分析物标准曲线的预定义标准1,2。

图1
图1: 细胞因子技术原理和测定法工作流程。该测定法基于12个荧光编码的捕获珠子种群，结合针对特定分析物的抗体。在样品孵育过程中，形成可通过流式细胞术使用特定检测抗体进行检测的珠子-分析物复合物。测定法工作流程包括：1）在过滤板上准备分析物标准和感兴趣的样品，2）与捕获珠子孵育，3）与生物素标记的抗分析物抗体孵育以形成三明治复合物，4）与APC标记的抗生物素抗体孵育，5）在缓冲液中重悬以进行测量，6）样品采集。 请点击此处查看此图的较大版本。

本研究中描述的多重测定法与配备蓝色（例如，488 nm；FITC和PE通道）和红色激光（例如，635 nm；APC通道）的标准流式细胞仪兼容。由于流式细胞仪在研究实验室、临床环境和质量控制环境中广泛可用，这种兼容性促进了在不需要额外专门仪器的情况下实施5。在CAR T细胞功能测试的背景下，这种方法能够在常见的分析工作流程中进行多参数评估功能反应6。该测定法为CAR T细胞研究提供了显著优势，能够同时量化关键分析物，包括GM-CSF、颗粒酶B、干扰素（IFN）-α、白介素（IL）-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-21、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、孔蛋白和肿瘤坏死因子（TNF）-α（人细胞毒性面板）。这些介质对于理解CAR T细胞活化、效应功能和安全相关的细胞因子释放至关重要4,5,7,8。

测定法工作流程包括使用与仪器相关的软件以及仪器无关的网络分析工具进行自动分门和数据分析的选项5。这些功能通过减少手动干预的程度来支持CAR T细胞效应分子分析数据的流线化处理。自动分析的使用可能有助于提高数据处理的一致性，并促进更有效的功能读出评估8。

本文协议概述了一种可重复、可扩展的CAR T细胞免疫介质分析多重方法。通过在单个样品中测量12种不同的分析物，该方法特别适用于机制调查、早期研究和同步研究。在CAR T细胞疗法的后期阶段，可能有益于减少测量的细胞因子数量，尤其是在药物释放测试的受监管、时间敏感的质量控制（QC）环境中。为此目的，可以从所呈现的面板中选择1至7种细胞因子，设计一个可验证的工程T细胞分析的自定义细胞因子测定法。这使得所描述的协议理想适用于研究和QC环境中的多种应用，包括CAR T细胞疗法的早期和后期阶段3,4,5,

Protocol

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所有人类样本均来自于健康的匿名志愿者，在获得书面知情同意后收集。所有程序均经过北莱茵-威斯特法伦医师协会伦理委员会批准（#2020272），并根据所需的伦理和生物安全法规进行。

1. CAR T 细胞共培养

  1. 在无共源抗原和有共源抗原的情况下，以2.5:1（效应细胞：靶细胞）的比例，准备工程化人类 CAR T 细胞的细胞培养，例如，抗原呈递肿瘤细胞。
  2. 定义一次或多个时间点用于收集上清液，以分析分泌的细胞因子，或在特定时间范围内分析细胞因子动力学，例如在4、8、16、24和48小时时收集。
    注意：上清液可以直接使用，也可以冷冻以备后用。

2. 标准品和样品制备

  1. 通过将200 μL缓冲液或细胞培养基加入沉淀物中，轻轻混合，重新制备分析物标准品。准备六个试剂管，并对重新制备的标准品进行1:5稀释系列，直到3.2 pg/mL或0.6 pg/mL（取决于分析物），并准备一个空白。
  2. 收集CAR T共培养上清液，例如，共培养后16小时或24小时。可选择性地收获CAR T细胞用于并行流式细胞术表型分析。
  3. 在4℃下以10,000×g 离心样品10分钟。使用原始上清液或将其稀释以适应标准曲线范围。

3. 检测工作流程

  1. 涡旋捕获珠混合物以彻底重悬。向96孔滤板的孔中加入50 μL标准品或样品，以及20 μL预稀释珠。
  2. 在室温下孵育2小时，在450 rpm的摇晃下，在黑暗中。使用真空滤板或离心机用200 μL缓冲液洗涤孔两次。
  3. 加入100 μL 1:50预稀释的检测试剂1（在缓冲液中）。在室温下孵育1小时，在450 rpm的摇晃下，在黑暗中。洗涤两次。
  4. 加入100 μL 1:50预稀释的检测试剂2（在缓冲液中）。在室温下孵育30分钟，在450 rpm的摇晃下，在黑暗中。洗涤一次。
  5. 用于采集，将样品重悬于200 μL缓冲液中。检测工作流程概述如图1所示。

4. 数据采集和分析

  1. 使用配备蓝色和红色激光器的流式细胞仪采集数据（需要PE、FITC和APC通道）。在使用MACSQuant流式细胞仪时，使用Express模式模板进行完全自动化的门控和数据分析。
  2. 或者，将FSC或MQD数据文件上传到基于Web的InspectoR工具，该工具执行自动化的定量细胞因子测量，并提供独立于所使用仪器的可导出结果。
  3. 确保在FITC与PE通道中正确分离12个不同的捕获珠群体。
  4. 应用标准曲线计算细胞因子浓度，并导出和可视化结果。
  5. 对于MACSQuant流式细胞仪上的数据采集，使用捕获珠小瓶的2D条形码，其中包含所有相关的采集设置。
    1. 登录软件后，选择MACSPlex滤板作为样品架，并点击工具栏上的条形码按钮以激活2D码读取器。
    2. 将小瓶呈现给读取器，确保代码面对闪烁的光，距离最佳距离为0.5至2.5厘米。
    3. 在自动标签选项卡中，分配捕获珠（MPx Cyt T-NK,h）和无标签。对于细胞毒性T/NK细胞标准的连续稀释，定义组位置，并在设置选项卡中选择Express模式，类型：分析和模式：MACSPlex_Standard，根据需要进行轻柔混合。
    4. 未知样品分配类似，定义其位置，可选分组，并选择Express模式，类型：分析和模式：MACSPlex_Sample在设置选项卡中，包括可选的样品ID和描述。
    5. 在实验表中验证机架定义是否正确，确保滤板孔中液体水平正确，然后开始测量。

Results

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编码12种可溶性分析物的代表性捕获珠群体的鉴定

使用流式细胞仪的FITC和PE通道来鉴定捕获珠群体。在二轴图中清晰地分辨出代表单个分析物的不同珠群，包括IL-10、颗粒酶B、MCP-1、IL-17A、孔蛋白、IL-2、IL-6、IFN-α、TNF-α、IL-21、IL-4和GM-CSF（图2）。每个群体展示了独特的荧光特征，证实了多重检测的成功及所测定的细胞因子和效应分子的明确区分。

图2
图2: 代表性多重捕获珠群体的检测。捕获珠包含固有的荧光强度，可用于区分不同分析物特异性的群体。散点图显示了基于FITC（B1）和PE（B2）通道荧光强度的分析物特异性信号的分离。图中显示了编码GM-CSF、颗粒酶B、IFN-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-21、MCP-1（CCL2）、孔蛋白和TNF-α的12个捕获珠群体的代表性轮廓。 请点击此处查看此图的较大版本。

共培养肿瘤细胞后CAR T细胞的代表性细胞因子浓度轮廓

在CAR T细胞与肿瘤靶细胞共培养后，使用多重检测的人类细胞毒性面板来量化细胞因子浓度（图3）。CAR T细胞分泌了高水平的颗粒酶B（49,950.2 pg/mL）、IFN-α（48,367.8 pg/mL）、TNF-α（7,055.2 pg/mL）和GM-CSF（6,653.5 pg/mL），表明在肿瘤接触后激活和细胞毒性效应功能强烈。IL-2水平超过了上限检测值（>10,000 pg/mL），与强烈的增殖信号一致。样品没有进一步稀释或重新测量。相反，与调节或替代辅助T细胞反应相关的细胞因子，包括IL-6、IL-10、IL-17A、IL-21和MCP-1，处于低水平或接近不可检测的水平。这些结果表明CAR T细胞主要发动了一种1型（Th1/细胞毒性）免疫反应，其特征是高效应活性和有限的免疫抑制性细胞因子产生。

图3
图3: 共培养肿瘤细胞后CAR T细胞的代表性细胞因子轮廓。工程化嵌合抗原受体（CAR）T细胞与JeKo-1肿瘤细胞共培养了一夜。在孵育16小时后，收集细胞培养上清液并进行离心以去除颗粒物。稀释样品使用多重检测的人类细胞毒性面板进行分析。进行了两条标准曲线，并确定了所有12种分析物的浓度。显示了使用流式细胞仪的Express模式进行分析和计算分析物特异性浓度的代表性数据输出。条形图和附带的表格显示了12种效应分子的计算水平（皮克克/毫升）。 请点击此处查看此图的较大版本。

抗原特异性刺激后CAR T细胞的细胞因子分泌动力学

在CAR T细胞与表达（抗原⁺）或缺乏（抗原⁻）相应抗原的靶细胞共培养后，使用多重检测的人类细胞毒性面板随时间监测细胞因子的分泌。CAR T细胞在识别到抗原⁺靶标时表现出快速而强烈的细胞因子释放，在8-24小时内颗粒酶B、IFN-α、TNF-α、GM-CSF和IL-2大幅上调，在48小时达到峰值（图4）。这种模式表明在抗原接触后激活和细胞毒性效应功能强烈。也观察到IL-6、IL-17A和IL-21的适度增加，而IL-4、IL-10、MCP-1和孔蛋白保持低或适度升高。相反，与抗原⁻靶标共培养显示所有分析物的细胞因子诱导最小（图4）。总之，这些数据表明CAR T细胞的激活和效应细胞因子的产生是特定于抗原识别的，并随时间加剧。

图4
图4: 共培养抗原阳性或抗原阴性靶细胞的CAR T细胞的效应分子分泌动力学​。工程化嵌合抗原受体（CAR）T细胞与表达（抗原⁺）或缺乏（抗原⁻）相应CAR T细胞抗原的靶细胞共培养了4、8、16、24和48小时。在每个时间点，收集

Discussion

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多重检测用于分析CAR T细胞共培养中可溶性免疫介质反应。与抗原阳性靶细胞共培养的CAR T细胞显示IFN-α、TNF-α、GM-CSF、颗粒酶B和IL-2分泌增加，与效应器活化和细胞毒功能一致4,5,8。相比之下，抗原阴性对照组表现出低水平的细胞因子产生，表明该检测在测试条件下能够区分抗原特异性反应5,8。这些结果支持该检测用于评估CAR T细胞功能的适用性，包括用于效力相关分析、安全性相关分析和机制研究。

虽然固定的12种分析物面板提供了CAR T免疫活性的广泛概述，但在所有应用中捕获完整范围的分析物可能并不实际。对于诸如CAR T细胞产品的检测验证或质量控制（QC）测试等重点工作流程，可以将面板缩减为一个较小的子集（例如，IL-2、IFN-α和TNF-α），以简化分析，同时保持功能敏感性1,2。

协议中的关键步骤包括CAR T细胞共培养的设计和适当的取样条件选择。特别是，共培养时间和效应细胞数量（E:T比）直接决定细胞因子的大小，应在检测设置期间定义5,6。此外，应调整样品稀释，以确保分析物浓度在检测的动态范围内1,2。因此，故障排除应集中在验证标准曲线性能，并在信号落在可量化范围之外时调整共培养条件或稀释因子1,2。

与传统的单重ELISA相比，基于流式细胞术的多重平台可以从最小的样品体积中生成高密度、多分析物数据集。通过使在单个样品中同时测量多个分析物成为可能，多重化可减少整体试剂消耗，提高样品吞吐量，并相对于执行多个单重检测缩短检测时间1,2。自动采集和标准化分析选项可以潜在地减少用户依赖性变异，并支持实验或生产环境中的可重复性和可扩展性5,8。标准ELISA检测灵敏度通常在16到2000 pg/mL之间（高灵敏度试剂盒可能更低）7。在本研究中提出的平台中，最低可检测浓度范围从最敏感的分析物的0.05 pg/mL到约93.8 pg/mL不等，在内部评估中，超过74%的测量分析物显示检测限低于5 pg/mL，38%的分析物可检测低于1 pg/mL，这凸显了系统的整体灵敏度。由于多重灵敏度可能因细胞因子而异，潜在的表位竞争仍是一个重要的考虑因素。为了最小化此类干扰，该检测采用非重叠表位来捕获和检测每种分析物，从而减少竞争相关偏差并提高多重条件下的测量可靠性。

多重检测性能可能因检测灵敏度和生物学背景而在不同分析物之间变化，并且在某些条件下，分析物浓度可能接近检测上限，因此应在检测设置期间进行评估。相反，一些分析物（例如，本研究中的MCP-1和IL-4）可能在不同的实验条件下仍然无法检测到。此外，样品处理等前分析因素可能影响细胞因子测量，应保持一致的处理条件以确保可比性。

总的来说，这种多重方法可以高效且定量地表征CAR T细胞功能。相对于大多数现有的多重细胞因子检测平台，该检测与标准流式细胞仪兼容，并包括一个与仪器相关的软件工具，可简化数据采集和分析。虽然多重细胞因子检测已在其他免疫环境中使用，但目前的工作展示了其在标准化工作流程中对CAR T细胞功能分析的应用。基于珠子的格式允许同时检测多个分析物，与单重方法相比，支持更高的吞吐量。潜在应用包括药物产品的功能评估，如CAR结合物评估、载体优化和工艺开发。该检测的可扩展性和自动化分析能力还支持效力测试、安全性分析和旨在理解CAR T细胞行为和功能的机制研究5,7,8。

虽然细胞因子分泌谱为CAR T细胞的in vitro活化和功能效力提供了宝贵的见解，但它们无法完全复制决定患者治疗效果的复杂生物学。肿瘤微环境、抗原密度、免疫调节和in vivo持久性等因素都会影响CAR T细胞的性能，超出了在受控检测中可以测量的范围6,8,10。尽管如此，建立稳健和标准化的功能检测（如多重细胞因子分析）代表了药物产品功能表征的重要一步3,4。细胞因子模式不仅表明CAR T

Disclosures

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M.L.和M.H.被列为专利申请WO2021/058811A1的发明人。M.H.被列为由西雅图华盛顿州弗雷德·哈钦森癌症研究中心以及德国维尔茨堡的维尔茨堡大学提交的与CAR T技术相关的专利申请和已批准专利的发明人。M.H.是T-CURX GmbH的联合创始人和股权持有人，位于德国维尔茨堡。M.H.收到了来自Celgene/BMS、Janssen、Kite/Gilead的荣誉费。J.J、A.R.和C.E.是Miltenyi Biotec的员工。

Acknowledgements

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这项研究由创新药物倡议2联合行动项目资助，资助协议号为945393，T2EVOLVE。这个联合行动项目获得了欧洲联盟2020年地平线研究与创新计划、欧洲制药工业和协会联合会（EFPIA）以及欧洲血液学协会（EHA）的支持（对于M.H.、C.Q.、M.L.），ERA-NET TRANSCAN-3（欧盟共同资助的2021年通告，SmartCAR-T 对于M.H.和M.L.），Wilhelm-Sander-Stiftung（资助号2022.134.1 对于M.L.），Paula & Rodger Riney基金会（对于M.H.和M.L.），IZKF Würzburg（S-511, C-543 对于M.L.），德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG, TRR 221（子项目A03和A06 对于M.H.和M.L.）；SFB-TRR 338/3 2026–452881907（子项目A02 M.H.和C04 M.L.）和CRC1525（种子资助 对于M.L.），巴伐利亚癌症研究中心（BZKF；TANGO 对于M.H.和M.L.），诺华公司的INCA奖（对于M.L.）

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, humanMiltenyi Biotec130-125-800基于珠子的多重细胞因子流式细胞术检测试剂盒
MACSPlex InspectoR ToolMiltenyi Biotec\用于自动门控和MACSPlex数据分析的Web工具
MACSQuant Analyzer 10 Flow CytometerMiltenyi Biotec130-096-343多重数据测量的流式细胞仪器
MACSQuant Analyzer 16 Flow CytometerMiltenyi Biotec130-109-803多重数据测量的流式细胞仪器
MACSQuant Express ModeMiltenyi Biotec\自动门控和分析软件
TexMACS MediumMiltenyi Biotec130-097-196针对人类和小鼠T细胞培养和扩增而开发的优化无血清细胞培养基

References

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