需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

形态计量学分析：用于斑马鱼颅面形态定量分析的软件工具箱

929 次观看

⸱

DOI：

10.3791/70345

⸱

2026年2月27日

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Alcohol Research Center, University of Louisville, 2Department of Pediatrics, Section of Developmental Biology, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus

本文内容

摘要

本研究介绍了一种利用免费软件（tpsDigs2、MorphoJ 和 PAST）对斑马鱼幼鱼面部结构变化进行测量，从而定量分析颅面软骨形态的实验方案。

摘要

胎儿酒精谱系障碍（FASD）是一组由产前乙醇暴露引起的、临床表现各异的躯体、认知和行为障碍，其中包括对面部骨骼系统的影响。乙醇敏感的遗传位点导致FASD具有高度异质性，这使得对面部形态的分析变得复杂。我们此前已证明，可以在斑马鱼中分析基因与乙醇相互作用对面部形态的影响。斑马鱼是研究这种变异的理想模型，原因如下：（i）人类与斑马鱼之间约有70%的基因具有直系同源关系；（ii）体外受精使研究人员能够精确控制乙醇处理的时间和剂量；（iii）其面部骨骼结构在脊椎动物中具有保守性；（iv）透明的幼体使得在发育过程中直接观察颅面骨骼结构的变化成为可能。然而，仅通过简单的线性测量难以全面评估颅面骨骼的形态变化，因为这些方法无法捕捉整体形状的改变。此外，头部大小的变化也可能使数据分析和解释变得复杂。为解决这一问题，我们采用了一种形态测量学方法，利用免费软件tpsDig2、MorphoJ和PAST，通过主成分分析对面部整体形态进行分析。这些软件的结合使用可实现面部形态的成对比较。本文中，我们概述了使用这些程序对经乙醇处理的斑马鱼突变体进行面部形态分析的方法和流程，以开展一系列互补的多元统计分析。

引言

胎儿酒精谱系障碍（Fetal Alcohol Spectrum Disorders, FASD）表现为一系列广泛的发育缺陷，包括行为、神经和身体方面的异常1,2。其中身体缺陷包括颅面畸形，例如下颌发育不全3,4,5,6。尽管乙醇暴露的时间和剂量是FASD复杂病因的重要因素，但遗传因素在FASD的发病机制中也起着重要作用6,7,8,9,10,11,12。这些因素的共同作用使得在人类队列中研究面部缺陷具有挑战性。为了研究产前乙醇暴露对发育的影响，我们采用斑马鱼模型。斑马鱼是研究FASD的理想模型，因为其与人类共享约70%的基因直系同源物，以及82%的已知致病基因13,14,15,16。除了基因保守性外，斑马鱼还具有以下优势：（i）繁殖力高，可一次性产生大量幼鱼；（ii）体外受精，便于直接研究对乙醇敏感的发育过程；（iii）脊椎动物颅面发育高度保守且模式固定；（iv）胚胎和幼鱼呈半透明状态，便于观察骨骼结构17。我们先前已证明，多种不同斑马鱼基因的突变会使胚胎对乙醇诱导的面部缺陷更加敏感，而这些缺陷往往较为细微，难以通过肉眼识别10,18。此外，我们还观察到，与未经处理的野生型幼鱼相比，经乙醇处理的野生型幼鱼在颅面区域也存在轻微变化，但这些变化同样难以通过肉眼察觉10。尽管这些变化在视觉观察中不易被发现，但我们能够利用二维图像上对内颅面结构进行的形态测量分析，揭示乙醇诱导的面部形态改变10。

面部是一个复杂的三维结构，使用传统的线性测量方法难以准确评估。这些单一的线性测量无法反映所测各结构之间的相对位置关系及其对其他面部结构的影响。形态测量分析通过使用标志点（landmarks）来构建形状构型，克服了这些局限性，能够综合考虑所有被测结构的相对位置，甚至可以校正整体尺寸差异18,19,20。该方法所得数据更加准确、分辨率更高，且更易于可视化，因而可能揭示传统线性测量无法发现的结果18,19,20。此外，形态测量方法可借助多元统计分析，实现组间和组内的直接比较。本文介绍了免费形态测量软件 tpsUtil、tpsDigs221、MorphoJ20 和古生物学统计软件（Paleontological Statistics, PAST）22 的联合应用，结合未经处理及乙醇处理的野生型和骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein, BMP）基因 bmp7a 杂合突变幼鱼的黏附颅（viscerocranium）二维图像进行分析。尽管这些软件主要应用于古生物学和生态学领域，但联合使用时可对面部形状进行系统而全面的分析。本实验方案最终展示了如何利用这些免费软件工具，对斑马鱼模型中的颅面软骨形态变化进行定量分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本实验所用的所有斑马鱼幼鱼均按照路易维尔大学批准的IACUC标准方案进行饲养和繁殖23。

注意：本研究使用了斑马鱼品系 bmp7aty68a24 及其野生型同胞（均处于 AB 遗传背景），成年鱼饲养于 28.5 °C 环境下，光照周期为 14 小时光照 / 10 小时黑暗。请根据预期的实验结果选用合适的品系。使用经反渗透法灭菌的水。性别作为生物学变量不适用于本研究所涉及的发育阶段，因为斑马鱼的性别最早在受精后约 20–25 天（dpf）25 才能被检测到，而所有分析均在此时间之前完成。

1. 乙醇处理

  1. 从杂合子交配中收集卵子，并按照文献所述方法通过形态学对胚胎进行分期23。
  2. 将胚胎按每组100个进行分选，并在28.5 °C条件下培养至所需的发育时间点。所有组均在胚胎培养基（EM）中孵育10,18。
  3. 受精后6小时（hpf），将胚胎培养基更换为新鲜的胚胎培养基或含1%乙醇（v/v）的胚胎培养基。在24 hpf时，用三次新鲜胚胎培养基更换以洗去含乙醇的培养基10,18。

2. 面部染色与成像

  1. 在5 dpf时固定斑马鱼幼鱼，并用阿利新蓝染色，标记软骨（图1），方法如前所述26。
  2. 对幼鱼进行整体封片，拍摄咽颅腹面的明场图像，幼鱼封片方法如前所述27。
  3. 简言之，将鱼体腹面朝上置于阿利新蓝染色结束后的50%甘油溶液中进行封片。
    注意：复合显微镜的设置可能有所不同；应根据所需成像结构选择合适的设置。本研究中所有分析图像均使用Olympus BX53复合显微镜获取，图像放大倍数为10倍。

3. 基因分型

  1. 按照先前所述方法18，在完成Alcian Blue软骨染色后，去除5 dpf幼鱼的尾部。
  2. 将幼鱼的头部与尾部分离。将头部保存于50%甘油中，用于后续成像。
  3. 使用5 µL蛋白酶K（10 mg/mL）裂解尾部，以提取基因组DNA（gDNA）。
  4. 针对每个样本的gDNA，使用靶向目的基因的引物进行PCR扩增，以扩增包含SNP的区域。
  5. 利用限制性内切酶介导的DNA消化反应消化PCR产物，根据SNP区分突变型与野生型等位基因，从而鉴定SNP。根据基因型将样本分组并合并，进行成像分析。
    注：本研究中，对bmp7a基因中的SNP进行扩增，并使用BslI（NEB）进行基因分型。

用于形态分析的软件

  1. 使用 tpsUtil 和 tpsDig221和 MorphoJ20 (https://sbmorphometrics.org) 用于阿尔新蓝染色幼虫的形态测量分析，以及用于教学与数据分析的形态学软件 MorphoJ 和古生物学统计软件包（PAST）22 分析软件（https://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/）用于所有统计分析。 
    注意：tpsUtil 软件可在以下位置找到 "实用程序" 链接，可在 tpsDig2 软件下方找到 "数据采集" 链接，MorphoJ 可在以下位置找到 "全面的项目" 链接开启 https://sbmorphometrics.org。每种软件的故障排除方法均可通过多种在线平台免费获取，也可在软件内部直接找到。面部变异的主成分分析（PCA）、典型变量分析（CVA）、Procrustes 方差分析及线框图由 MorphoJ 生成，多变量正态性检验和多变量方差分析（MANOVA）使用 PAST 完成。 

对所有待分析样本进行面部骨骼的一致性成像

  1. 确保以相同的显微镜设置拍摄面部骨骼的图像，并将其保存为 .tif 文件。
    注意：显微镜设置因显微镜的配置、功能以及待成像的样本/组织而异。关键是保持显微镜设置和样本制备的一致性。
  2. 将文件保存在一个单独的文件夹中，文件夹名称应能完整标识该实验。

6. 使用 tps 软件准备图像

  1. 打开记事本，选择另存为。在底部点击所有文件，将文件保存为 "experiment-name.tps"，并将其保存在包含所有待分析图像的文件夹中。

7. 将图像输入 tps 软件

  1. 打开 tpsUtil 软件。接着，下拉 Operation 菜单，并选择 Build tps file from the images 选项卡。
  2. 在该选项卡中，点击 input，打开包含图像的文件。选择文件中的第一张图像，然后点击 Open。
  3. 选择 output 选项卡，随后选择 tps notepad file，然后点击 save。当提示是否替换文件时，选择 yes。
  4. 接着，点击 set up 选项卡并点击 create。前往该文件查看图像是否已成功添加。

8. 在图像上添加标记点

  1. 打开 tpsDigs2，并依次打开以下标签页：输入源，文件，然后是已保存的tps 记事本文件。
  2. 接着，点击选项以显示图像工具选项。在此处，确保将参考长度设置为 100 µm。点击设置比例。
    注意：不要根据图像上的比例尺进行相对缩放。
  3. 设置比例时，点击确定以确认参数，然后退出图像工具。
  4. 此时，通过点击瞄准符号，在每张待分析的图像上添加标志点，以进行正确的形态学分析。
  5. 确保每个图像上的标志点按相同顺序放置。标志点应置于软骨结构之间的以下关节位置（见图 1E，E'）：
    1. Meckel 软骨之间的中线关节（标志点 #1，图 1E，E'）。
    2. Meckel 软骨与腭方软骨之间的双侧关节（标志点 #2，图 1E，E'）。
    3. 角舌软骨之间的中线关节（标志点 #3，图 1E，E'）。
    4. 腭方软骨与角舌软骨之间的双侧关节（标志点 #4，图 1E，E'）。
    5. 舌颌软骨的远端末端（标志点 #5，图 1E，E'）。
  6. 在图像上放置完标志点后，点击文件以打开下拉菜单。按此路径选择保存数据，然后选择覆盖。
  7. 退出 tpsDigs2。

9. 使用 MorphoJ 通过普氏方差分析（Procrustes ANOVA）分析形态

  1. 打开 MorphoJ 软件。
  2. 在“初步设置”中创建并命名数据集。选择创建新数据集，并为数据集命名。然后点击 tps，并选择记事本中从步骤 8.4 添加的新数据点。创建数据集。
  3. 图像已准备好通过 Procrustes 拟合进行统计分析。选择标签页中的项目树，然后点击数据集。依次点击以下按钮：初步设置、新建 Procrustes 拟合、按主轴对齐和执行 Procrustes 拟合。
  4. 在“初步设置”下选择生成协方差矩阵；软件将显示 Procrustes 坐标。当提示时执行该功能。
  5. 在“初步设置”下选择创建或编辑线框图，并连接图像上的点。然后选择连接点，并选择接受或创建图像。编辑分类器。
  6. 在保持 MorphoJ 打开的同时，打开一个电子表格。添加所有必要信息，例如：基因型、处理方式、基因型与处理方式、实验等。将电子表格保存为 CSV 文件。
  7. 在 MorphoJ 中，点击文件和导入分类变量，以选择该 CSV 文件。打开文件后，返回项目树并点击数据集。
  8. 数据集打开后，点击初步设置和编辑分类器。这将确保所有图像均已添加。
  9. 接下来，点击项目树、Covmatrix，然后点击顶部的变异。
  10. 选择主成分分析以查看主成分（PC）得分。点击PC 得分以查看生成的图形。
  11. 要为图形添加颜色，右键单击并按下置信椭圆以添加所需的分类器。按下为数据点着色以添加颜色，然后按确定以确认这些更改。
    注意：一旦按照步骤 9.10 的说明关闭并重新打开 PC 得分标签页，颜色应自动更新。
  12. 要更改线框图的颜色，请进入初步设置。点击屏幕底部的形状图设置选项。选择线框图以更改目标形状、起始形状和数字的颜色。
  13. 选择变异，然后选择Procrustes 方差分析。
  14. 将 Procrustes 方差分析结果导出到步骤 9.7 中的电子表格文件。

10. 数据集的典型变量分析

  1. 在 MorphoJ 中，选择原始数据集或项目。要开始典型变量分析（CVA），依次选择 比较 和 典型变量分析。选择分类变量——选择 基因型 & 处理，然后执行该功能。
  2. 要导出 CVA 结果，点击 结果 选项卡，然后在已打开的结果页面上单击右键。选择 导出到文件，并保存信息。
  3. 点击 项目树 ，选择 CVA，然后选择 得分。在页面左上角，点击 文件。当 文件 选项卡打开后，选择导出数据集，并选择数据类型和 基因型 & 处理。将 CVA 得分保存为 .txt 文件。
  4. 为准备在 PAST 软件中使用该文件，请在记事本或等效软件中打开已保存的 CVA 得分文件。将左上角的 ID 更改为 标签，以避免与 PAST 软件产生混淆。保存编辑后的 CVA 得分文件或等效文件。

11. 在 PAST 软件中进行多变量方差分析（MANOVA）

  1. 在 PAST 中导入 CVA 分数，选择 文件，然后 开放 从记事本或等效程序中访问已保存的 CVA 分数。当 导入文本文件 窗口打开，选择 名称, 数据 行和列 标签 作为分隔符。选择 导入.
  2. 在……之下 显示 标签，选择 柱属性。旁边的 类型 按钮，打开下拉菜单并选择 组 用于应包含分类变量的第一列。
  3. 突出显示 PC 数据或 CV 数据。选择 多变量，检验，以及 多变量正态性 进行正态性检验。分别对PC和CV进行该检验。
  4. 单击左上角灰色的空白单元格，位于 类型，以选择整个数据集。选择 多变量检验，以及 多因素方差分析 进行多变量方差分析（MANOVA）。将第9.7步得到的MANOVA结果导出至电子表格文件。
    注意：两者均 摘要 和 两两比较 结果将由软件给出。请导出并保存两者。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

为了鉴定斑马鱼中由乙醇诱导的面部形态变化，我们结合使用了多种免费软件工具，以生成并量化面部骨骼的形态学数据。实验所用胚胎来自携带bmp7a杂合突变的成年斑马鱼亲本，并在受精后6至24小时（6–24 hpf）期间进行乙醇处理。来自这些杂交后代的幼鱼在5天龄（5 dpf）时被固定，并用阿利新蓝（Alcian Blue）对面部软骨进行染色。对每种基因型和处理组的每条幼鱼均拍摄了咽颅（viscerocranium）图像（图1A–D）。在一幅代表性图像中标注了咽颅的各个软骨结构（图1E）。使用tpsDig2软件在每幅图像上放置解剖标志点（landmarks），并保存数据（代表性图像，图1E'）。随后将这一组“带标志点标注”的图像数据导入MorphoJ软件中进行分析。通过主成分分析（PCA）可视化个体在形态变异上的分布情况。每个主成分（PC1、PC2等）展示了相对于所有咽颅平均形态（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

胎儿酒精谱系障碍（FASD）表现为多种发育缺陷，包括下颌发育不全等颅面畸形。斑马鱼因其与人类基因的高度保守性、繁殖力强、幼体透明以及体外受精等特点，成为研究FASD的优良模型。数十年来，斑马鱼已被广泛用于研究颅面骨骼的形成以及乙醇对发育的影响6,12,13,15,18,28,29。近年来的研究进一步探讨了乙醇对面部发育的影响，其中关键在于对面部形态的准确分析。本文介绍了一种整体性分析面部形态的技术，可用于检测FASD导致的下颌形态显著变化。

量化面部形态因多种原因而具有挑战性：单一面部结构的线性测量难以全面反映整体形态变化...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院/酒精滥用与酒精中毒国家研究所（NIH/NIAAA）资助，项目编号R01AA031043，授予C.B.L.。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
tpsUtil、tpsDig2、MorphoJhttps://sbmorphometrics.org免费软件——下载时可能需要管理员权限
PASThttps://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/免费软件——下载时可能需要管理员权限
复合明场显微镜OlympusBX53

参考文献

  1. May, P. A., Baete, A., Russo, J., et al. Prevalence and characteristics of fetal alcohol spectrum disorders. Pediatrics. 134 (5), 855-866 (2014).
  2. May, P. A., Gossage, J. P., Kalberg, W. O., et al. Prevalence and epidemiologic characteristics of FASD from various research methods with an emphasis on recent in-school studies. Dev Disabil Res Rev. 15 (3), 176-192 (2009).
  3. Klingenberg, C. P., Wetherill, L., Rogers, J., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44 (7-8), 649-657 (2010).
  4. Smeriglio, P., Zalc, A. Cranial neural crest cells contribution to craniofacial bone development and regeneration. Curr Osteoporos Rep. 21 (5), 624-631 (2023).
  5. Smith, S. M., Garic, A., Flentke, G. R., Berres, M. E. Neural crest development in fetal alcohol syndrome. Birth Defects Res C Embryo Today. 102 (3), 210-220 (2014).
  6. Vo, H. D. L., Lovely, C. B. Ethanol induces craniofacial defects in Bmp mutants independent of nkx2.3 by elevating cranial neural crest cell apoptosis. Biomedicines. 13 (3), (2025).
  7. Brooks, E. R., Islam, M. T., Anderson, K. V., Zallen, J. A. Sonic hedgehog signaling directs patterned cell remodeling during cranial neural tube closure. Elife. 9, e60234(2020).
  8. Eberhart, J. K., Parnell, S. E. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcohol Clin Exp Res. 40 (6), 1154-1165 (2016).
  9. Fish, E. W., Murdaugh, L. B., Sulik, K. K., Williams, K. P., Parnell, S. E. Genetic vulnerabilities to prenatal alcohol exposure: Limb defects in sonic hedgehog and GLI2 heterozygous mice. Birth Defects Res. 109 (11), 860-865 (2017).
  10. Klem, J. R., Schwantes-An, T. H., Abreu, M., et al. Mutations in the bone morphogenetic protein signaling pathway sensitize zebrafish and humans to ethanol-induced jaw malformations. Dis Model Mech. 18 (4), dmm052223(2025).
  11. Swartz, M. E., Lovely, C. B., McCarthy, N., Kuka, T., Eberhart, J. K. Novel ethanol-sensitive mutants identified in an F3 forward genetic screen. Alcohol Clin Exp Res. 44 (1), 56-65 (2020).
  12. Swartz, M. E., Wells, M. B., Griffin, M., et al. A screen of zebrafish mutants identifies ethanol-sensitive genetic loci. Alcohol Clin Exp Res. 38 (3), 694-703 (2014).
  13. Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), e23460(2021).
  14. Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  15. Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Res. 112 (4), 367-379 (2020).
  16. Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for fetal alcohol spectrum disorders: Zebrafish as a model for ethanol teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
  17. Marrs, J. A., Sarmah, S. The genius of the zebrafish model: Insights on development and disease. Biomedicines. 9 (5), 577(2021).
  18. Gray, R., Lloyd, A., Lovely, C. B. Interactions between the bone morphogenetic protein and the planar cell polarity pathways lead to distinctive ethanol-induced facial defects. Alcohol Clin Exp Res (Hoboken). 49 (11), 2502-2519 (2025).
  19. Mutsvangwa, T., Douglas, T. S. Morphometric analysis of facial landmark data to characterize the facial phenotype associated with fetal alcohol syndrome. J Anat. 210 (2), 209-220 (2007).
  20. Klingenberg, C. P. MorphoJ: An integrated software package for geometric morphometrics. Mol Ecol Resour. 11 (2), 353-357 (2011).
  21. Rohlf, F. The Tps series of software. Hystrix. 26, 1-4 (2015).
  22. Hammer, O., Harper, D., Ryan, P. PAST: Paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontol Electron. 4, 1-9 (2001).
  23. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , 5th edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
  24. Dick, A., Hild, M., Bauer, H., et al. Essential role of Bmp7 (snailhouse) and its prodomain in dorsoventral patterning of the zebrafish embryo. Development. 127 (2), 343-354 (2000).
  25. Aharon, D., Marlow, F. L. Sexual determination in zebrafish. Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).
  26. Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
  27. McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190(2014).
  28. Lovely, C. B. Quantification of ethanol levels in zebrafish embryos using head space gas chromatography. J Vis Exp. (156), e60766(2020).
  29. Klem, J. R., Gray, R., Lovely, C. B. The zebrafish Tol2 system: A modular and flexible gateway-based transgenesis approach. J Vis Exp. (189), e64679(2022).
  30. Suttie, M., Foroud, T., Wetherill, L., et al. Facial dysmorphism across the fetal alcohol spectrum. Pediatrics. 131 (3), e779-e788 (2013).
  31. Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
  32. Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Bmp and Shh signaling mediate the expression of satb2 in the pharyngeal arches. PLoS One. 8 (3), e59533(2013).
  33. Dong, X. R., Wan, S. M., Zhou, J. J., et al. Functional differentiation of BMP7 genes in zebrafish: bmp7a for dorsal-ventral pattern and bmp7b for melanin synthesis and eye development. Front Cell Dev Biol. 10, 838721(2022).
  34. McCarthy, N., Wetherill, L., Lovely, C. B., Swartz, M. E., Foroud, T. M., Eberhart, J. K. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

形态计量分析斑马鱼模型胎儿酒精谱系障碍基于标志点的形态测量学主成分分析普罗克拉斯提斯方差分析典型变量分析多变量分析
形态计量学分析：用于斑马鱼颅面形态定量分析的软件工具箱
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。