形状形态测量分析：斑马鱼颅面形状量化的分析软件工具箱

Summary

本研究描述了一种利用免费软件（tpsDigs2、MorphoJ和PAST）量化颅面软骨形状的方案，用于测量斑马鱼幼体面部结构的变化。

Abstract

胎儿酒精谱系障碍（FASD）的特征是产前乙醇暴露导致的一系列不同的身体、认知和行为障碍，包括影响面部骨骼的障碍。对乙醇敏感的遗传位点导致FASD高度变异，使面部形状分析变得复杂。我们此前已证明，可以通过斑马鱼基因与乙醇相互作用分析这些面部形状的变化。斑马鱼是分析这种变异的理想模型，原因有几个：（i）70%的基因是人类与斑马鱼之间的直系同源基因;（ii）外部受精使研究人员能够控制乙醇处理的时间和剂量;（iii）其面部骨骼结构在脊椎动物中保持保守;（iv）半透明的幼虫能够直接观察发育过程中颅面骨骼结构的变化。然而，仅用简单的线性测量难以全面评估颅面骨骼的形状，因为这些测量无法捕捉整体形状的变化。此外，头部大小的变化会使数据解释变得复杂。为此，我们采用形态计量方法，通过免费软件tpsDigs2、MorphoJ和PAST的主成分分析整体面部形状。该软件的组合允许对整体面部形态进行两对比较。本文介绍了我们利用这些程序对乙醇处理斑马鱼突变体面部形状的研究方法和分析，并进行一系列补充的多变量统计分析。

Introduction

胎儿酒精谱系障碍（FASD）的特征包括广泛的发育缺陷，包括行为、神经^{和身体方面1,2}。这些身体缺陷中包括颅面缺损，如颌骨发育不全3,4,5,6。乙醇暴露的时间和剂量对FASD复杂病因有重要影响，但遗传贡献在FASD病因6,7,8,9,10,11,12中起着重要作用。这些因素的结合使得研究人类群体中的面部缺陷变得具有挑战性。为了研究产前乙醇暴露对发育的影响，我们采用斑马鱼模型。斑马鱼作为FASD的强模型，因为它们与人类共享70%的基因同源....

Protocol

所有用于此程序的斑马鱼幼体均按照路易斯维尔大学批准的IACUC规范饲养和^繁殖。

注：本研究使用了斑马鱼品系 bmp7a^ty68a24 及野生型兄弟品种（均属AB背景），成鱼保持在28.5°C，明暗周期为14/10小时。根据期望的实验结果使用合适的线条。使用经过逆渗透消毒的水。性别作为生物学变量不适用于研究的发育阶段，因为斑马鱼在受精后约20-25天首次检测到性别^{，经过所有}分析。

1. 乙醇处理

1. 从杂合杂交中采集卵子，并^按描述的形态分期胚胎。
2. 将胚胎分组，每组100个，并在28.5°C的环境下孵化至理想的发育时间点。在胚胎培养基中孵育所有群组（EM）^10,18。
3. 受精后6小时（hpf），将EM换成含1%乙醇（v/v）的EM。在24 hpf下，用三次新更换的EM^10,18....

Results

为了识别乙醇引起的斑马鱼面部形状变化，我们结合了免费可用的软件应用，生成并量化了面部骨骼的形态学数据。从bmp7a杂合成体携带鱼中生成胚胎，并用6-24 hpf的乙醇处理。这些杂交的幼虫被固定在5 dpf，面部软骨则涂上Alcian Blue。为每个基因型和处理组的每只幼虫拍摄了内脏颅骨图像（见图1A-D）。内脏颅骨的软骨在代表性图像中被标记（图1E）。使用tpsDigs2在每张图像上放置地标并保存（代表性图片，见图1E'）。这组“地标标记”图像数据集随后被导入了MorphoJ。进行了主成分分析（PCA），以可视化个体的分布，基于形状变化。每个主成分（PC1、PC2等）相对于所有内脏颅骨的平均形状（图2，黑色线框）表现出特定的变化（

Discussion

FASD的特征包括广泛的发育缺陷，包括颅面缺陷如颌骨发育不全。斑马鱼因其与人类的遗传保护性、高繁殖力、半透明幼体以及体外受精，是FASD的强有力模型。斑马鱼已被用来研究颅面骨骼的形成以及乙醇对发育的影响，时间^为6,12,13,15,18,28,29。近期研究探讨了乙醇对面部发育的影响。这项工作的关键在于对面部形状的正确分析。本文介绍了一种整体分析面部形状的技术，以确定FASD下颌形状的显著形态变化。

量化面部形状之所以困难，原因有多方面：单一面部结构的线性.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
tpsUtil， tpsDig2， MorphoJ	https://sbmorphometrics.org		免费软件——可能需要管理员权限才能下载
过去	https://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/		免费软件——可能需要管理员权限才能下载
复合明场显微镜	奥林匹斯	BX53