形状形态测量分析：斑马鱼颅面形状量化的分析软件工具箱

Summary

本研究描述了一种利用免费软件（tpsDigs2、MorphoJ和PAST）量化颅面软骨形状的方案，用于测量斑马鱼幼体面部结构的变化。

Abstract

胎儿酒精谱系障碍（FASD）的特征是产前乙醇暴露导致的一系列不同的身体、认知和行为障碍，包括影响面部骨骼的障碍。对乙醇敏感的遗传位点导致FASD高度变异，使面部形状分析变得复杂。我们此前已证明，可以通过斑马鱼基因与乙醇相互作用分析这些面部形状的变化。斑马鱼是分析这种变异的理想模型，原因有几个：（i）70%的基因是人类与斑马鱼之间的直系同源基因;（ii）外部受精使研究人员能够控制乙醇处理的时间和剂量;（iii）其面部骨骼结构在脊椎动物中保持保守;（iv）半透明的幼虫能够直接观察发育过程中颅面骨骼结构的变化。然而，仅用简单的线性测量难以全面评估颅面骨骼的形状，因为这些测量无法捕捉整体形状的变化。此外，头部大小的变化会使数据解释变得复杂。为此，我们采用形态计量方法，通过免费软件tpsDigs2、MorphoJ和PAST的主成分分析整体面部形状。该软件的组合允许对整体面部形态进行两对比较。本文介绍了我们利用这些程序对乙醇处理斑马鱼突变体面部形状的研究方法和分析，并进行一系列补充的多变量统计分析。

Introduction

胎儿酒精谱系障碍（FASD）的特征包括广泛的发育缺陷，包括行为、神经^{和身体方面1,2}。这些身体缺陷中包括颅面缺损，如颌骨发育不全3,4,5,6。乙醇暴露的时间和剂量对FASD复杂病因有重要影响，但遗传贡献在FASD病因6,7,8,9,10,11,12中起着重要作用。这些因素的结合使得研究人类群体中的面部缺陷变得具有挑战性。为了研究产前乙醇暴露对发育的影响，我们采用斑马鱼模型。斑马鱼作为FASD的强模型，因为它们与人类共享70%的基因同源基因，其中82%的已知致病基因13,14,15,16。除了遗传保护外，斑马鱼还包括：（i）高繁殖力，允许同时产生多个斑马鱼幼体，（ii）接受外部受精，这便于直接研究对乙醇敏感的发育过程，（iii）高度保守且具备典型的脊椎动物颅面发育，（iv）为半透明胚胎/幼体，便于骨骼结构的可视化¹⁷.我们此前已证明，许多不同斑马鱼基因的突变会使胚胎对乙醇诱导的面部缺陷敏感，而这些缺陷可能很微妙，难以用肉眼识别^10,18。此外，我们观察到乙醇处理的野生型幼虫在颅面区域也存在轻微变化，尽管这些变化仍难以^用肉眼识别。虽然这些变化在肉眼观察中未被发现，但我们通过2D内核颅骨2D图像的形态测量分析，展示了乙醇诱导的面部形状^变化。

面是一个复杂的三维结构，难以用传统线性测量测量。这些单一线性度量并未考虑每个结构相对于面中其他结构的相对位置及其对其他测量结构的影响。形态计量分析通过通过地标来调整形状配置，考虑所有结构的相对位置，甚至控制整体大小^{差异 18、19、20}。这种方法能获得更准确、分辨率更高且易于可视化的数据，从而可能得到传统线性测量（18,19,20）无法观察到的结果。此外，形态计量方法还可以通过多变量统计方法直接比较群体之间和群体内部的关系。本文介绍了免费形态测量软件tpsUtil、tpsDigs2²¹、MorphoJ²⁰和古生物学统计（PAST）²²的使用，结合未处理和乙醇处理的野生型及幼体杂合子内脏颅骨的二维图像，用于骨骼形态发生蛋白（Bmp）基因bmp7a.虽然这些程序主要应用于古生物学和生态学领域，但结合使用时，可以对面部形状进行全面的分析。最终，在本方案中，我们将展示如何利用这些免费软件应用量化斑马鱼模型中颅面软骨形状的变化。

Protocol

所有用于此程序的斑马鱼幼体均按照路易斯维尔大学批准的IACUC规范饲养和^繁殖。

注：本研究使用了斑马鱼品系 bmp7a^ty68a24 及野生型兄弟品种（均属AB背景），成鱼保持在28.5°C，明暗周期为14/10小时。根据期望的实验结果使用合适的线条。使用经过逆渗透消毒的水。性别作为生物学变量不适用于研究的发育阶段，因为斑马鱼在受精后约20-25天首次检测到性别^{，经过所有}分析。

1. 乙醇处理

1. 从杂合杂交中采集卵子，并^按描述的形态分期胚胎。
2. 将胚胎分组，每组100个，并在28.5°C的环境下孵化至理想的发育时间点。在胚胎培养基中孵育所有群组（EM）^10,18。
3. 受精后6小时（hpf），将EM换成含1%乙醇（v/v）的EM。在24 hpf下，用三次新更换的EM^10,18冲洗含乙醇的电磁。

2. 面部染色与影像学

1. 将斑马鱼幼虫定型于5 dpf，并用Alcian Blue染色，标记软骨（见图1），如前所述²⁶。
2. 拍摄全装载、腹面、明场内脏颅骨图像，安装幼虫，如^前所述。
3. 简要地，将鱼腹面朝上，置于Alcian Blue染色结束时的50%甘油溶液中。
   注意：复合显微镜的设置可能有所不同;使用符合所需图像结构的设置。本研究使用了奥林巴斯BX53复合显微镜生成所有分析图像。图像采用10倍放大。

3. 基因分型

1. 按照^{之前描述的}Alcian Blue软骨染色，去除5个dpf幼虫的尾巴。
2. 将幼虫的头和尾分开。将磁头保存在50%的甘油储存中，以便后续成像。
3. 用5微升蛋白酶K（10 mg/mL）进行裂解，提取gDNA。
4. 使用靶向目标基因的引物对每个样本的gDNA进行PCR检测，以扩增含有SNP的区域。
5. 利用限制性核酸酶DNA消化PCR产物，以根据SNP区分突变型和野生型等位基因，以识别SNP。按基因型将样本分成合并组并进行图像分析。
   注：本研究中，SNP在 bmp7a 中扩增并使用BslI（NEB）进行基因分型。

4. 用于形状分析的软件

1. 使用tpsUtil和tpsDig2²¹，以及MorphoJ²⁰ （https://sbmorphometrics.org）进行带阿尔西安染色幼虫的形态计量分析，所有统计分析则使用MorphoJ和古生物学统计软件包（PAST）²² （https://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/）。
   注意：tpsUtil 软件可在“工具程序”链接中找到，tpsDig2 软件可在“数据采集”链接中找到，MorphoJ 则可在 https://sbmorphometrics.org 的“综合程序”链接中找到。每种软件的故障排除都可以在网上、多个平台以及软件内部轻松找到。主成分分析（PCA）、典范变量分析（CVA）、Procrustes 方差分析和面部变异线框图均使用MorphoJ生成，并用PAST进行了多元正态性检验和多元方差分析（MANOVA）。

5. 对所有样本进行一致的面部骨骼成像

1. 确保面部骨骼的图像在相同的显微镜设置下拍摄，并保存为.tif档。
   注意：显微镜设置会根据显微镜的设置和功能以及待成像的样本/组织而有所不同。关键在于显微镜的配置和样品准备保持一致。
2. 将文件保存在一个标签明确的文件夹中，以完整标识实验内容。

6. 使用TPS软件准备图像

1. 打开记事本，选择 另存为。点击底部 所有文件 。将文件保存为“experiment-name.tps”，并保存在包含所有待分析图像的文件夹中。

7. 将图像输入到TPS软件中

1. 打开tpsUtil软件。接着，拉下 作 ，从图片标签页选择 Build tps 文件 。
2. 从该标签页点击 输入 ，打开包含图片的文件。点击文件中的第一个图片，选择 打开。
3. 选择 输出 标签，然后选择 tps记事本文件，然后 保存。当提示替换文件时，选择 “是”。
4. 接下来，点击 “设置 ”标签并 创建。去文件查看图片是否被添加。

8. 为图像添加地标

1. 打开tpsDigs2，按顺序打开以下标签页： 输入源码、文件，然后是保存的 tps记事本文件。
2. 接着，点击 选项 以可视化 图像工具 选项。这里，确保将参考长度设置为100微米。按下 “设定音阶”。
   注意：不要相对于图片上的比例进行缩放。
3. 设置比例时，按 确定 键设置参数，然后退出图像工具。
4. 此时，点击目标符号为每张图像添加地标，以便进行正确的形态分析。
5. 确保每张图片的地标按相同顺序排列。软骨元素之间的以下关节处设置了标志（见 图1E，E'）：
   1. 梅克尔软骨之间的中线关节（标志#1， 图1E，E'）。
   2. 梅克尔软骨与腭方骨软骨之间的双侧关节（标志#2， 图1E，E'）。
   3. 神经膜软骨之间的中线关节（标志#3， 图1E，E'）。
   4. 腭方骨与角膜软骨之间的双侧关节（标志#4， 图1E，E'）。
   5. 舌下颌软骨远端（标志#5， 图1E，E'）。
6. 在图片上放置地标后，点击 文件 进入下拉菜单。按照这个路径 保存数据 ，然后 覆盖。
7. 退出tpsDigs2。

9. 利用MorphoJ分析Procrustes方差分析形状

1. 打开MorphoJ软件。
2. 在初步设置下，创建并命名数据集。选择 创建新数据集 并命名数据集。然后点击tps，选择第8.4步新增数据点的记事本。创建数据集。
3. 图像已准备好通过普罗克鲁斯特拟合进行统计分析。选择标签阅读 项目树 ，点击数据集。在此路径中选择以下按钮： 初步、新普罗克鲁斯特拟合、按主轴对齐和 执行普罗克鲁斯特拟合。
4. 选择在预设下 生成协方差矩阵 ;软件会显示普罗克鲁斯特斯坐标。在提示时执行该函数。
5. 在初步设置下选择创建或编辑线框，并链接图像上的点。然后选择链接点，接受或创建图片。编辑分类器。
6. 打开一个电子表格，同时保持MorphoJ开启。添加所有必要信息，例如：基因型、处理、基因型以及处理、实验等。把电子表格保存成CSV文件。
7. 在 MorphoJ 中，点击 文件 并 导入分类器变量 以选择 CSV 文件。打开文件后，回到项目树，点击数据集。
8. 数据集打开后，点击 初步 分类并 编辑分类器。这样可以确保所有图片都被添加。
9. 接下来，点击 项目树、Covmatrix，然后点击顶部的 变体 。
10. 选择 主成分分析 以查看PC评分。点击 PC分数 查看生成的图表。
11. 要向图中添加颜色，右键点击 置信省略 号即可添加所需的分类器。点击 颜色数据点 添加颜色，点击 确认 按钮接受这些更改。
    注意：关闭并按照步骤9.10重新打开PC分数标签后，颜色应当更新。
12. 要更改线框颜色，请访问 预备。点击屏幕底部的形状图 设置选项 。选择 线框图 以更改目标形状、起始形状和数字的颜色。
13. 选择 变异，然后选择 普罗克鲁斯氏方差分析。
14. 将普罗克鲁斯氏方差分析结果导出到第9.7步的电子表格文件。

10. 数据集的典型变量分析

1. 在 MorphoJ 中，选择原始数据集或项目。要开始正则变量分析（CVA），选择 “比较 ”，然后选择 “典型变数分析”。选择分类器变量——选择 基因型和处理 ，然后执行该函数。
2. 要导出CVA，点击 结果 标签页，右键点击已打开的结果页面。选择 导出为文件 并保存信息。
3. 点击 项目树 ，选择 CVA，然后选择 分数。在页面左上角，选择 “文件”。打开 文件 标签后，选择 导出数据集 ，选择数据类型和 基因型与处理。将CVA成绩保存为.txt文件。
4. 要准备文件以供PAST软件使用，请在记事本或同等软件中打开保存的CVA成绩。把左上角的 ID 改成 标签 ，以免PAST软件混淆。保存编辑后的CVA分数或同等内容。

11. 过去软件中的马诺瓦

1. 要导入PAST中的CVA分数，选择 “文件”，然后 打开 即可从记事本或类似软件访问保存的CVA分数。当导入 文本文件 窗口打开时，选择 名称，行和列选择 数据 ，分隔符选择 Tab 。选择 导入。
2. 在 “显示 ”标签下，选择 “列属性”。在 “类型 ”按钮旁边，打开下拉菜单，选择“ 组 ”，选出第一列，该列应该包含分类器变量。
3. 高亮显示PC数据或CV数据。选择 多变量检验、检验和 多变量正态性 以执行正规性检验。在PC和CV上分别运行这个测试。
4. 点击左上角 类型上方的灰色空格，选择整个数据集。选择 多变量、检验和 多元变数 来处理多元变数。将MANOVA结果导出到第9.7步的电子表格文件。
   注意：软件将提供 摘要 和 两对结果 。导出或保存两者。

Results

为了识别乙醇引起的斑马鱼面部形状变化，我们结合了免费可用的软件应用，生成并量化了面部骨骼的形态学数据。从bmp7a杂合成体携带鱼中生成胚胎，并用6-24 hpf的乙醇处理。这些杂交的幼虫被固定在5 dpf，面部软骨则涂上Alcian Blue。为每个基因型和处理组的每只幼虫拍摄了内脏颅骨图像（见图1A-D）。内脏颅骨的软骨在代表性图像中被标记（图1E）。使用tpsDigs2在每张图像上放置地标并保存（代表性图片，见图1E'）。这组“地标标记”图像数据集随后被导入了MorphoJ。进行了主成分分析（PCA），以可视化个体的分布，基于形状变化。每个主成分（PC1、PC2等）相对于所有内脏颅骨的平均形状（图2，黑色线框）表现出特定的变化（

Discussion

FASD的特征包括广泛的发育缺陷，包括颅面缺陷如颌骨发育不全。斑马鱼因其与人类的遗传保护性、高繁殖力、半透明幼体以及体外受精，是FASD的强有力模型。斑马鱼已被用来研究颅面骨骼的形成以及乙醇对发育的影响，时间^为6,12,13,15,18,28,29。近期研究探讨了乙醇对面部发育的影响。这项工作的关键在于对面部形状的正确分析。本文介绍了一种整体分析面部形状的技术，以确定FASD下颌形状的显著形态变化。

量化面部形状之所以困难，原因有多方面：单一面部结构的线性...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
tpsUtil， tpsDig2， MorphoJ	https://sbmorphometrics.org		免费软件——可能需要管理员权限才能下载
过去	https://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/		免费软件——可能需要管理员权限才能下载
复合明场显微镜	奥林匹斯	BX53