建立早孕期母体免疫激活小鼠模型以评估产前炎症对神经发育的影响

摘要

本文提供了一种全面的方案，用于建立母体免疫激活（MIA）小鼠模型，以研究妊娠早期炎症对神经发育的影响，包括确保实验可靠性和可重复性的关键指标。

摘要

神经发育障碍（NDDs）源于遗传和环境风险因素之间的复杂相互作用，其中包括产前免疫激活。在小鼠中，母体免疫激活（MIA）是研究环境因素对NDDs贡献的常用模型；然而实验结果的变异性限制了其可重复性。本文提出了一种在小鼠妊娠早期胚胎第9.5天（E9.5）诱导MIA的标准操作流程，并引入多项质量控制指标，用于评估免疫反应并预测妊娠结局。在给予聚胞苷酸：聚肌苷酸（poly(I:C)）后，通过定量母体血清细胞因子以确认强烈的免疫激活，从而建立对低应答个体的排除标准。母体从E0.5至E12.5期间的体重变化轨迹可预测子代存活率，成功产仔的母鼠表现出特征性的体重增长模式，与流产母鼠明显不同。我们还发现，实验动物供应商显著影响母体免疫反应和子代存活率，而poly(I:C)的制剂形式则无显著影响。综上所述，该流程通过监测母体免疫反应和体重变化，并控制动物供应商来源，提供了提高早期妊娠MIA模型可重复性及子代存活率的策略，从而更有效地研究产前免疫激活对神经发育的影响。

引言

目前的全基因组关联研究已鉴定出数百个与神经发育障碍（NDD）易感性相关的风险等位基因、染色体重排和拷贝数变异^1,2,3,4,5。然而，遗传变异仅带来轻微的风险增加，而具有较强疾病关联性的大拷贝数变异仅影响少数病例⁶。此外，人类流行病学研究显示，生命早期应激因素（如产前炎症）会增加被诊断为NDD的风险^7,8,9。因此，环境因素与遗传风险因素在NDD病因学中共同作用的观点已得到广泛认可，而小鼠模型是解析遗传与环境风险因素在脑发育及疾病风险中各自贡献的重要工具。尽管评估NDD遗传风险因素的动物模型因其结果稳健且可重复而被广泛接受，但评估环境风险的模型在标准化一致性以及表型结果（如母体免疫激活后代的行为或神经解剖学差异）的变异性方面仍面临挑战^{10,11,12,13,14,15,16,17}。例如，关键实验参数（如免疫刺激的妊娠时期、免疫刺激物类型与剂量的差异、母体细胞因子反应）以及子代窝内变异性（如具有抗性或易感性的后代）会显著影响实验结果，但这些因素在方法学描述中并不总是被充分考虑。本文介绍了一种标准化的小鼠早期妊娠母体免疫激活（MIA）建模方案，包含多项质量控制步骤，以确保在研究生命早期免疫应激对神经发育及健康结局影响时具备严谨性和可重复性。

我们的目标是提供一种实验方案，以实现以下两个目的：1）提高母体免疫激活（MIA）模型的可靠性；2）明确可能导致实验异质性的各种变量。在啮齿类动物中，MIA通常通过在不同妊娠时期（包括胚胎第9.5天（E9.5）、E12.5、E15.5、E17.5等）系统性给予免疫刺激剂来诱导，常用的免疫刺激剂包括模拟病毒感染的聚胞苷酸：聚胞苷酸（poly(I:C)）或模拟细菌感染的脂多糖（LPS）^18,19。这些处理可引发强烈的母体细胞因子反应，干扰胎儿神经发育，导致与神经发育障碍（NDDs）相关的分子和行为表型^20,21,22,23。然而，许多研究并未常规评估母体免疫反应，导致难以确认不同实验间MIA诱导的强度或一致性^12,14,24。为解决这一问题，我们建立了多项质量控制指标，并根据poly(I:C)免疫刺激后母体血清中细胞因子水平，设定了E9.5 MIA母体反应的阈值。该方法可实现对免疫刺激剂更精确的剂量控制，并有助于识别和剔除低反应或无反应个体，从而提升模型的可靠性与稳健性。尽管该问题在领域内很少被讨论，但产仔存活率低是MIA模型已知的局限性之一，尤其在E9.5诱导时更为明显。虽然在妊娠中期（E12.5）诱导可改善产仔存活率，但我们旨在建立早期妊娠MIA诱导过程中的关键监测节点，以帮助预测产仔存活情况，并进一步识别有助于提高繁殖成功率的相关变量。

母体免疫激活（MIA）是一种研究环境因素对神经发育影响的有价值模型，因为与体外模型（将细胞从其环境中分离）不同，MIA 利用子宫内环境来研究对子代神经发育的影响。尽管 MIA 常单独用于模拟神经发育障碍（NDDs），但它也可与遗传模型或其他早期生命阶段的压力因素联合使用，从而揭示基因与环境之间或重复环境压力之间的复杂相互作用。已有研究将 MIA 与携带遗传性 NDD 风险变异的啮齿类动物（如 DISC1、CNTNAP2 和 SHANK3）相结合，以证明环境与遗传之间的协同作用^{25,26,27,28,29}。此外，一种“二次打击”环境压力模型将 MIA 与另一种早期生命压力（如心理应激或青春期药物暴露）相结合，在出生后导致表型的出现或加重^30,31,32。这些方法共同凸显了 MIA 模型的多功能性，既可单独使用，也可与其他环境或遗传风险因素联用。

本文提供了在小鼠中诱导母体免疫激活（MIA）以研究产前炎症对神经发育影响的逐步实验方法。文中包含多个关键质控点，以提高实验的可重复性，并深入解析影响MIA效率的各种因素（图1）。

图1：母体免疫激活（MIA）模型构建时间线。在妊娠第9.5天（E9.5）对配准妊娠母鼠注射聚肌胞苷酸（poly(I:C)）或生理盐水，3小时后采集血液样本。在E0.5、E9.5、E10.5、E11.5和E12.5时间点记录母鼠体重，以监测注射后的妊娠进展。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

所有动物实验均按照俄克拉荷马大学的伦理准则进行，并经机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。动物饲养在独立通风的笼具中，垫料为1/8英寸的纤维素，可自由获取食物和水，并提供筑巢垫料和小屋等笼内丰富化设施。动物繁殖室遵循杰克逊实验室的标准，维持14小时光照、10小时黑暗的光周期，以模拟晚春的光照条件，此时期为小鼠繁殖的高峰期。

请参见表1以获取本方案中需收集的具体数据字段。详细的统计分析请参见补充统计表（补充表1）和GitHub（https://hayes-lab.github.io/2026_Camfield_JoVE/）。

表1：示例数据采集表。 建立MIA模型过程中需收集的重要数据模板。请点击此处下载该表格。

1. 定时妊娠小鼠的制备

1. 在傍晚或晚上，将两只8至10周龄的C57BL/6雌性小鼠与C57BL/6种用雄性小鼠合笼。使用2至10月龄且在配种前已单独饲养的成熟雄鼠，可获得更快且更稳定的妊娠结果。
2. 次日上午检查雌鼠是否有阴道栓，并每天持续检查一次，直至发现阴道栓。需要注意的是，阴道栓为暂时性结构，若未在早晨及时检查，可能在下午前脱落。
   注：有关阴道栓检查的详细方案，请参见Behringer et al. (2016)³³。
3. 确认出现阴道栓后，称量雌鼠体重并记录，以便通过整个妊娠期间的体重增长情况监测妊娠状态。
4. 将发现阴道栓的雌鼠分笼单独饲养，在标准饲养条件下自由摄食和饮水。将发现阴道栓的雌鼠记为胚胎发育第0.5天（E0.5）。记录阴道栓发现日期，以确保准确追踪妊娠周期。

2. 聚胞苷酸：聚肌苷酸（poly(I:C)）的制备

1. 根据生产商说明书，将冻干的聚(I:C)用无菌生理盐水或无菌水溶解，配制成高浓度储存液（10–20 mg/mL），形成澄清溶液。记录聚(I:C)的供应商、货号和批号。
   注意：聚(I:C)属于化学危害品；操作时应遵循机构的生物安全指南，并佩戴适当的个人防护装备以减少暴露风险，废弃物应置于合适的生物危害废物容器中处理。
2. 涡旋混匀后，用生理盐水进一步稀释为低浓度储存液（4 mg/mL）。为避免反复冻融，将单次使用量的低浓度储存液（约125 µL）分装至1.5 mL离心管中，于-20 °C或-80 °C保存。在配制和操作过程中，应将复溶后的聚(I:C)置于冰上，以最大限度减少降解。
   注意：有关聚(I:C)变异性的综述，请参见Mueller et al. (2019)¹⁴。
3. 在E9.5注射前立即用无菌生理盐水将低浓度聚(I:C)储存液（4 mg/mL）稀释至所需工作浓度（2 mg/mL）。
   注意：小鼠常用的聚(I:C)注射剂量范围通常为~5–20 mg/kg，但最佳剂量应由研究人员根据实验确定。
4. 将工作液（2 mg/mL）在65 °C加热10分钟，以确保双链RNA结构正确复性。
5. 通过涡旋或移液混匀，确保溶液在注射前均匀一致。

3. 注射聚肌胞苷酸（poly(I:C)）

1. 在E9.5当天早晨，称量母鼠体重以确认妊娠，并根据体重计算母体免疫激活组（MIA）所需注射的聚肌胞苷酸（poly(I:C)）体积以及对照组（CON）所需注射的0.9%生理盐水体积。在本实验所述结果中，注射体积为动物体重的5倍时可达到10 mg/kg的剂量。应避免注射体积超过动物体重的10倍。
   E9.5体重 × 5 = µL poly(I:C)（2 mg/mL）或0.9%生理盐水
   注：从E0.5到E9.5期间，母鼠体重通常增加2–3克，表明妊娠状态正常。
2. 将适量体积的配制好的poly(I:C)工作液（2 mg/mL）或生理盐水抽入无菌的27号或更小规格的注射器中。
3. 正确固定母鼠，以最大程度减少疼痛和应激。将poly(I:C)或生理盐水通过腹腔注射（IP）方式注入母鼠下腹部左侧或右侧象限，位置在髋部水平稍上方或第二对乳头处。使用指定的生物安全锐器容器妥善处理用过的注射器。记录注射侧别，以确保同一批次动物操作的一致性。
4. 注射后立即将母鼠放回其原饲养笼，并观察其是否出现应激反应。注射后至少24小时内提供水凝胶，以预防因病态行为导致的脱水。
5. 为确保记录完整，需记录poly(I:C)剂量、注射的poly(I:C)体积（µL）、注射日期/时间、妊娠天数以及所用poly(I:C)的批号（表1）。
   注：未给予镇痛药物，因其可能改变poly(I:C)诱导的炎症反应。

4. 采血

1. 注射后3小时，对小鼠进行个体观察，每只观察1分钟。记录是否出现以下任何行为，如活动减少、弓背姿势、面部皱眉或稀便，并采用三级评分标准（无表型、轻度、明显）进行记录；出现一种或多种上述行为的小鼠被归类为表现出急性病态行为。
   注意：对照组（CON）母鼠不应观察到任何病态行为。
2. 此外，使用微创方法（如尾静脉采血）小心采集注射后母鼠的血液。采血后，用无菌纱布对尾部施加适度压力，直至出血停止。 使用止血剂（如止血粉）处理伤口，并将母鼠放回原笼具中。 目标采集约50 µL血液，用于定量分析炎症性细胞因子。
   注意：所有接触血液的材料均应视为生物危害物，须在适当个人防护装备下操作，并按照机构生物安全指南进行处置。
3. 将血液在室温（20–25 °C）下静置凝固30分钟。在室温下以2,000 ×g离心5分钟，使血清与血凝块分离。上层透明液体为血清，底部深色沉淀物为血凝块。小心吸取血清，避免扰动或吸入任何血凝块成分。血清可在-20 °C保存，待后续细胞因子分析时使用。

5. 注射后母体的监测

1. 在注射后连续三天（E10.5、E11.5 和 E12.5）每天称量母鼠体重，以监测其对聚肌胞苷酸（poly(I:C)）的反应。通常在注射 poly(I:C) 后第一天（E10.5）观察到体重下降，最多可达 1 g，随后逐渐恢复，至 E12.5 时体重通常超过 E9.5 的基线水平。
   注意：若体重下降超过 1 g，或至 E12.5 仍未恢复体重，通常提示妊娠失败。
2. 在后续妊娠期间，确保母鼠持续获得食物、饮水和筑巢材料。此外，应尽量减少对动物的操作或移动笼具，以免增加应激反应，进而降低仔鼠存活率。
3. 在预期分娩日（E19.5），记录产仔情况，包括产仔数、仔鼠存活情况或无产仔（提示妊娠失败）。应及时移除死亡仔鼠，并根据机构生物安全及 IACUC 批准的动物尸体处理指南进行处置。
   注意：母体免疫激活（MIA）模型可能产仔数较少，并可能出现分娩困难，导致延迟至 E20.5 分娩。

6. 免疫反应的验证

1. 使用MIA和CON注射后收集的母体血清，根据制造商说明书，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）或多重检测法定量炎症细胞因子，如IL-6或TNF-α。典型的血清稀释比例为MIA血清1:100，CON血清1:25。
2. 定量完成后，利用结果设定MIA反应的代表性阈值。MIA阈值定义为母体血清IL-6反应高于1,000 pg/mL（约低于MIA组平均反应值25%），任何反应低于该阈值的MIA母鼠应从数据集中剔除，视为低反应或无反应个体。
   注意：CON组母鼠的细胞因子水平应极低或无法检测；任何细胞因子水平超过CON组平均值25%的CON母鼠（即250 pg/mL阈值）也应予以剔除。

7. 统计分析

1. 使用 R 统计软件进行所有统计分析。在所有分析中将母鼠视为生物学单位。将统计学显著性定义为 p < 0.05。数据以箱线图表示，其中箱体显示中位数和四分位距（IQR；第25–75百分位数），须线延伸至1.5 × IQR，每个数据点代表一只单独的母鼠。
2. 使用 Shapiro-Wilk 检验评估数据正态性，以指导选择参数检验或非参数检验。对于两个独立组之间的比较，根据数据分布情况，采用非配对双侧 t 检验（正态分布）或 Wilcoxon 秩和检验（非正态分布）。对于同一动物内的配对测量值（例如体重），采用配对 t 检验（正态分布）或 Wilcoxon 符号秩检验（非正态分布）。在评估胚胎发育不同天数的相对体重增长时，进行单样本检验，检验值设为零。
3. 使用 Spearman 等级相关分析母体血清 IL-6 与 TNF-α 水平之间的关系。使用 Fisher 精确检验比较不同供应商及 poly(I:C) 制剂之间成功产仔比例的差异。详细的统计学汇总信息见补充表 1，分析代码发布于 GitHub（https://hayes-lab.github.io/2026_Camfield_JoVE/）。

结果

在E9.5天给予聚(I:C)或生理盐水后，检测母体血清细胞因子以评估母体免疫激活（MIA）诱导的效率与强度（图2）。与对照组（CON）母鼠相比，MIA母鼠的白细胞介素-6（IL-6）水平显著升高（图2A）。此外，通过检测IL-6水平，可排除未达到预设阈值（1,000 pg/mL）的MIA母鼠。因此，IL-6定量可作为识别免疫激活不足的有效生物标志物。我们发现约31%的MIA母鼠表现出免疫反应不足。对其他促炎性细胞因子（如肿瘤坏死因子α，TNF-α）的分析也可用于评估MIA诱导效果，因其与母体IL-6细胞因子反应呈强相关性（图2B）。

接下来，我们比较了孕鼠在胚胎发育不同阶段（E0.5–E12.5）的体重变化，以确定是否可通过母体体重变化轨迹预测妊娠结局。在E0.5至E9.5期间，成功产下幼崽的孕鼠体重增加显著高于未能维持至足月妊娠的孕鼠。具体而言，成功分娩的孕鼠体重增加了2.5 g ± 0.11 g，而未...

讨论

在本方案中，我们建立了若干检查点，以提高孕早期母体免疫激活（MIA）模型的效率、稳健性和可重复性，重点关注母体细胞因子反应、体重变化轨迹以及影响妊娠结局的实验变量。我们的结果表明，MIA会引发不同程度的母体免疫反应，其中IL-6可作为识别免疫激活不足的孕鼠的可靠生物标志物。约31%接受MIA处理的孕鼠未能达到预设的IL-6阈值，凸显了监测细胞因子以确保实验一致性的必要性。尽管其他促炎性细胞因子（如TNF-α）与IL-6存在相关性，但IL-6的定量检测仍是评估母体免疫反应强度的敏感且具有预测性的指标。这些数据强调，在MIA实验方案中纳入细胞因子监测至关重要，有助于标准化MIA模型的建立，减少实验变异，并确保炎症始终为关键的实验变量。

MIA 模型的一个常见局限性在于，特别是在 E9.5 注射时间点，由于诱导的炎症反应，导致子代存活率降低。在整个 MIA 诱导方案过程中，我们记录了多个参数，包括母鼠体重，该参数被用作预测子代结果的指标。在评估从发现阴栓时间点到注射时间点（E0.5 至 E9.5）的体重增长时，我们观察到成功产下子代的母鼠体重显著增加（2.5 g），而未能产下子代的母鼠体...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物体重秤	Kent Scientific	SCL-4000	用于称量小鼠
BD Lo-Dose U-100 胰岛素注射器 - 28G	Fisher Scientific	14-826-79	对于PIC，腹腔注射
C57BL/6J 雌性小鼠	杰克逊实验室	000664	10-12 周龄，未交配雌性
C57BL/6J 雄性小鼠	杰克逊实验室	000664	繁殖期雄性
C57BL/6NCrl 雌性小鼠	查尔斯河实验室	027	10-12 周龄未交配雌性
离心机（24位实验室标准）	Eppendorf	5425 R	离心血液以收集血清
数据记录平台	Airtable、Microsoft Excel 等		记录重要数据，如体重、注射时间等（表1）。
数字干浴器 - 单模块	Medicus Health	5277M1	用于注射前加热 PIC
Eppendorf管 - 1.5 mL	Eppendorf	30123611	稀释PIC至储存浓度和工作浓度时使用
Fisherbrand 纱布海绵	Fisher Scientific	MSD-1400250	用于在采血后止住尾部出血
Fisherbrand 小探头 6 英寸	Fisher Scientific	13-820-026	用于堵塞检查
水凝胶	清水 H20	70-01-5022	注射后的补充
小鼠IL-6未包被ELISA试剂盒	赛默飞世尔科技	88-7064-88	定量检测母体血清中IL-6水平
Nalgene 聚丙烯 Griffin 低型塑料烧杯	赛默飞世尔科技	1201-1000PK	称重时将小鼠放入烧杯中
聚肌胞苷酸（LMW）	Invivogen	tlrl-picw	用于MIA注射的PIC（低分子量）
聚肌苷酸–聚胞苷酸钠盐	Sigma	P9582	用于MIA注射的PIC（Sigma）
手术刀片，#22，10片装	家庭科学工具	DE-SC22BLD	用于剪断尾部末端以采集血液
0.9% 氯化钠（生理盐水），USP级，无菌，Cytiva Hyclone	Cytiva	Z1376	用于对照小鼠的制备注射
尾部取样平台	Braintree Scientific, Inc.	IL-200	在尾部采血过程中正确固定小鼠
Vortex-Genie 2	Scientific Industries, Inc.	SI-0236	稀释后涡旋PIC