$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
本研究无需伦理批准，因为未涉及人类受试者或临床样本。所有涉及细胞系的操作均按照机构生物安全指南和规定进行。本研究使用的前列腺上皮细胞系来自经认证的商业供应商。
注意：本研究中使用的所有试剂、仪器和软件均列于材料表中。本研究的流程图见图1。
1. 活性成分筛选
- 访问TCMSP数据库。
- 在搜索框中选择"Herb name"，输入"Huangbo"，然后点击"Search"。
- 点击“OB”筛选条件，设置为“≥30”，并应用筛选。
- 点击“DL”筛选条件，设置为“≥0.18”，并应用筛选。
- 将筛选结果复制到Excel电子表格中。
- 采用相同的筛选方法，获取"Cangzhu"的活性成分。
- 将所有数据集导入Microsoft Excel（2019版），以Excel格式合并化合物列表，去除重复的活性成分。
- 通过标准化化合物名称并识别相同条目，去除重复的活性成分；当多个记录对应同一化合物时，仅保留一个代表性条目。
- 建立"Huangbo"、"Cangzhu"与活性成分之间的关联关系。
2. 获取活性成分对应的作用靶点
- 访问TCMSP数据库。
- 在搜索框中选择"化学名称"，输入活性成分，然后点击"搜索"。
- 复制每种活性成分对应的作用靶点名称。
- 去除重复的靶点名称，并建立活性成分与靶点名称之间的对应关系。
- 访问UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）18，获取每个靶点名称对应的官方基因符号，并进行系统性替换。
3. 疾病靶点的获取
- 访问 GeneCards 数据库（https://www.genecards.org）19。
- 在搜索框中输入“前列腺炎”，然后点击搜索图标，以获取相关基因列表。
- 按相关性评分从高到低对基因进行排序。
- 以 Excel 格式导出相关基因。
- 选择评分 ≥1 的靶点作为与前列腺炎相关的靶点。
4. 药物活性成分-靶点-疾病调控网络构建的准备工作
- 获取与活性成分相关的靶点和与前列腺炎相关的靶点之间的交集，并将其定义为EMP治疗前列腺炎的作用靶点。
- 建立EMP中活性成分与治疗靶点之间的关联关系。
- 创建一个名为"Network"的Excel文件，前三个列分别命名为"Node1"、"Node2"和"Net"。
- 将EMP与药物之间的关联关系粘贴至"Node1"和"Node2"列中，所有行的"Net"列均填入"drug"。
- 将药物与活性成分的关联关系粘贴至"Node1"和"Node2"列中，所有行的"Net"列均填入"ingredient"。
- 将EMP治疗前列腺炎的活性成分-靶点关联关系填入"Node1"和"Node2"列中，所有行的"Net"列均填入"target"。
- 将EMP治疗前列腺炎的治疗靶点填入"Node1"列中，"Node2"列填入"prostatitis"，所有行的"Net"列均填入"disease"。
- 将Excel文件"Network"另存为txt格式文件。
- 创建一个名为"Type"的Excel文件，前两列分别命名为"Node"和"Type"。
- 在"Node"列中填入"EMP"，并在对应的"Type"列中填入"formula"。
- 在"Node"列中填入"Huangbo"和"Cangzhu"；所有行的"Type"列均填入"drug"。
- 将活性成分填入"Node"列中，所有对应行的"Type"列均填入"ingredient"。
- 将EMP治疗前列腺炎的治疗靶点填入"Node"列中，对应的"Type"列均填入"target"。
- 将与前列腺炎相关的靶点填入"Node"列中，所有对应行的"Type"列均填入"disease"。
- 将Excel文件"Type"另存为.txt格式文件。
5. 可视化 "药物-活性成分-靶点-疾病" 通过 Cytoscape 构建调控网络
- 启动 Cytoscape。
- 转到“文件 > 导入 > 从文件系统导入网络”，然后打开“network.txt”文件。
- 打开“样式”面板。选择“形状”，从“列”下拉菜单中选择“类型”，并将“映射类型”设置为“离散映射”。
- 为以下类别分配不同的节点形状：formula、drug、ingredient、target、disease。
- 选择“填充颜色”，从“列”下拉菜单中选择“类型”，并将“映射类型”设置为“离散映射”。
- 为以下类别分配不同的节点颜色：formula、drug、ingredient、target、disease。
- 选择“高度”和“宽度”，从“列”下拉菜单中选择“类型”，并将“映射类型”设置为“离散映射”。
- 为以下类别分配不同的节点大小：formula、drug、ingredient、target、disease。
- 选择“标签字体大小”，从“列”下拉菜单中选择“类型”，并将“映射类型”设置为“离散映射”。
- 为以下类别分配不同的标签字体大小：formula、drug、ingredient、target、disease。
- 手动调整节点位置，以优化网络布局。
- 转到“文件 > 导出 > 将网络图像导出为文件”，并将网络保存为图像。
6. 蛋白质-蛋白质相互作用网络分析与可视化
- 访问 https://cn.string-db.org/，进入“Multiple Proteins”模块。
- 在搜索框中输入目标基因列表，选择“Homo sapiens”作为物种，然后点击“Search”。
- 结果加载完成后，点击“Continue”。
- 打开“Settings”面板，将“minimum required interaction score”设置为“high confidence (0.700)”，并勾选“hide disconnected nodes in the network”。
- 点击“Update”，然后通过“Export”菜单以 TSV 格式导出 PPI 关联数据。
- 启动 Cytoscape，进入文件菜单，选择 "Import Network from File System" 来打开您的 TSV 文件。
- 进入“Tools”菜单，然后依次选择“NetworkAnalyzer > Network Analysis > Network Interpretation > Treat the network as undirected”。
- 进入“File”菜单，选择“Export Table to the file”系统，导出网络数据。
- 进入“Style”面板，配置“Shape”、“Fill Color”、“Height”和“Width”属性。
- 通过重新定位节点来调整 PPI 网络布局。
- 进入“File”菜单，选择“Export Network Image to File”，将可视化网络导出为图像。
- 使用 WPS 打开导出的 PPI 网络数据，并按“Degree”"" 列进行降序排序。
- 选择排序后的前 20 个靶点，生成柱状图，并将图表保存为图像。
7. KEGG通路富集分析
- 打开终端或命令提示符，输入 R，然后按 Enter 键。
- 在 R 控制台中，依次运行以下命令：
install.packages(c("RSQLite", "色彩空间", "stringi", "BiocManager"))
BiocManager::install(c("org.Hs.eg.db", "剂量", "clusterProfiler", "pathview"))
- 使用 Entrez ID 转换 EMP 治疗前列腺炎靶点的基因符号 org.Hs.eg.db
- 读取 Entrez ID 并使用 clusterProfiler 软件包进行 KEGG 富集分析，参数设置为：organism = "hsa"，p值阈值 = 0.05，q值阈值 = 0.05。
- 在从获得的 KEGG 富集分析结果中剔除与人类疾病和代谢相关的通路后，根据富集基因的数量对剩余通路进行排序。
- 建立排名前15位的信号通路与靶点之间的关联。
- 准备一个两列文件，其中 "通路" 和 "目标" 关联，然后通过“文件 > 导入 > 从文件导入网络”.
- 使用“设置节点形状和颜色”以区分通路与靶点风格面板
- 手动调整布局，并将网络导出为图像。
8. 药物制备
注意：方剂EMP由15 g Phellodendri Chinensis Cortex （黄柏）和15 g Atractylodis Rhizoma （苍术）组成。采用水提醇沉法提取该方剂，所得提取物用于后续的细胞实验20。
- 将药物用10倍质量的水浸泡1小时。
- 煎煮1小时，然后用纱布过滤，得到煎液。
- 再次加入10倍质量的水，煎煮30分钟，用纱布过滤，得到煎液。
- 再加入一次10倍质量的水，煎煮30分钟，用纱布过滤，得到煎液。
- 合并三次滤过的煎液，再用滤纸过滤混合液。
- 减压浓缩煎液至原体积的10%。
- 冷却浓缩液，边搅拌边缓慢加入乙醇至乙醇体积分数达75%， 随后 密封，于4 °C静置12小时。
- 离心处理混合液，收集上清液。
- 继续进行减压蒸馏。
- 最后，使用真空冷冻干燥机对产物进行冻干。
注意：冻干粉末可在–20ºC下保存最多3个月，此为安全的暂停点。如需继续实验，可根据需要将粉末用适当的溶剂重新溶解。
9. 细胞复苏与培养
注意：购买的细胞以干冰运输方式递送至实验室。实验开始前，预先配制角质形成细胞无血清培养基（K-SFM），添加人重组表皮生长因子（rEGF）至终浓度为 5 ng/mL，牛垂体提取物至终浓度为 50 µg/mL，并加入 1% 青霉素-链霉素。
- 启动水浴锅，并将温度调节至 37 °C。
- 从干冰中取出细胞，立即放入水浴中振荡，直至完全解冻。
- 向细胞中加入 5 mL K-SFM 培养基，轻轻混匀，然后离心（4 °C，500 × g，5 分钟）。
- 弃去上清液，将沉淀重悬于完全 K-SFM 培养基中。
- 将细胞转移至 T-25 培养瓶，并放入细胞培养箱中。
注意：细胞培养箱的环境参数维持在 37 °C、5% CO₂ 以及 ≥ 95% 的相对湿度。
10. 细胞传代培养
注意：当细胞融合度达到80–90%时进行传代，传代比例为1:2至1:3。
- 吸弃培养基上清液，随后用不含钙和镁的 PBS 洗涤细胞两次。
- 加入 2 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，静置 3 分钟以进行酶解消化。
注意：本实验涉及危险试剂的使用，包括脂多糖（LPS）、氯仿、乙醇和 TRIzol 试剂。所有涉及危险化学品的操作均应在经认证的化学通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、手套和眼部防护装置）。生物材料的操作应遵循机构的生物安全指南。
- 加入添加了 10% 胎牛血清的 K-SFM 培养基以终止消化反应。
- 将细胞混合液转移至 15 mL 离心管中，离心（4 °C，500 × g，5 分钟），并弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于完全 K-SFM 培养基中，随后转移至新的培养瓶中。
11. 通过 MTS 实验确定药物处理的最大浓度
注意： 每种药物浓度均进行5次技术重复实验。
- 消化处于对数生长期的RWPE-1细胞。
- 用完全K-SFM培养基重悬细胞，通过计数确定细胞浓度。
- 用完全K-SFM培养基将细胞悬液调整至密度为1 × 105 cells/mL 。
- 每孔加入100 µL细胞悬液，分装至96孔板中。
- 将96孔板放入细胞培养箱中进行培养。
- 培养24小时后，待细胞完全贴壁，吸除并弃去培养基。
- 更换为含不同浓度EMP溶液的完全K-SFM培养基。
- 将96孔板重新放入细胞培养箱中继续孵育24小时。
- 吸除培养基，用PBS洗涤细胞两次。
- 每孔加入100 µL完全K-SFM培养基，再于细胞培养箱中孵育4小时。
- 每孔加入10 µL MTS溶液，孵育1小时后测定490 nm处的吸光度（OD值）。
- 以空白对照组（在完全培养基中培养且未接受LPS刺激或药物处理的细胞）为基准，计算各处理浓度下的细胞增殖率。
注意： 对细胞增殖无显著影响的最高浓度定义为高剂量处理组，其一半浓度为中剂量处理组，四分之一浓度为低剂量处理组。
12. 细胞干预
- 消化处于对数生长期的RWPE-1细胞。
- 用完全K-SFM培养基重悬细胞，并通过细胞计数确定细胞浓度。
- 用完全K-SFM培养基将细胞悬液调整至密度为5 × 105 个细胞/mL。
- 每孔加入2 mL细胞悬液，接种于6孔板中。
- 将培养板放入培养箱中孵育12小时，以促进细胞贴壁。
- 分别用低剂量（150 µg/mL）、中剂量（300 µg/mL）和高剂量（600 µg/mL）的EMP处理细胞。
- 1小时后，向培养基中加入10 µg/mL的LPS溶液。
- 处理24小时后，收集上清液用于ELISA检测，并收获细胞用于RT-PCR分析。
注：选择LPS诱导炎症反应，因其已被证实可有效激活前列腺上皮细胞中的促炎信号通路；所选浓度（10 µg/mL）基于既往研究，显示可显著诱导细胞因子表达。
13. 总RNA的提取
注意： 为防止RNA降解，实验全程佩戴手套和口罩，并使用无RNase的移液器吸头和离心管。
- 干预处理后，用 PBS 清洗细胞两次。
- 向细胞中加入 1 mL Trizol 试剂，用移液器反复吹打以确保充分匀浆。
注意：所有操作均应在佩戴适当个人防护装备的前提下，在化学通风橱中进行。
- 将裂解液转移至 1.5 mL 微量离心管中，在室温下孵育 15 分钟。
- 随后加入 0.2 mL 氯仿，剧烈涡旋振荡样品。
- 室温静置 5 分钟后，在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 15 分钟。
- 离心后，小心地将上层无色水相转移至新的微量离心管中。
- 加入等体积预冷的异丙醇，充分混匀，然后在室温下孵育 10 分钟。
- 再次离心（4 °C，10,000 × g，10 分钟），弃去上清液，保留沉淀。
- 用 1 mL 预冷的 75% 乙醇洗涤沉淀，并通过移液轻轻重悬。
- 在 4 °C 下以 7,500 × g 进行最后一次离心，持续 10 分钟，随后去除上清液，并将 RNA 沉淀在生物安全柜中空气干燥。
- 用 50 µL 经 DEPC 处理的水溶解纯化的 RNA。
- 使用 NanoDrop 分光光度计测定 RNA 浓度、A260/A280 比值和 A260/A230 比值，以评估 RNA 纯度，并确保在进行下游分析前蛋白和溶剂污染最小化。
14. 逆转录 PCR
- 使用 1 µg 总 RNA 制备 20 µL 反转录反应体系。
- 将反应体系在 42 °C 孵育 15 分钟，随后在 95 °C 孵育 5 分钟，然后冷却至 4 °C。
- 用蒸馏水将所得 cDNA 稀释 10 倍。
- 使用稀释后的 cDNA 制备 20 µL PCR 反应体系。
- 设置 PCR 仪程序：95 °C 预变性 60 秒，随后进行 40 个循环（95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火延伸 60 秒）。
- PCR 结束后进行熔解曲线分析，记录所有目标基因和参考基因的 CT 值。
- 采用 2(-ΔΔCT) 法计算目标基因的相对表达量。
15. ELISA 检测
注意： 从储存处取出ELISA试剂盒，使用前于室温下平衡30分钟。
- 根据制造商说明书配制标准品溶液，并对标准品、生物素化抗体、酶结合物和洗涤缓冲液进行适当稀释。
- 将收集的细胞培养上清液在4 °C、10,000 × g 条件下离心10分钟，收集上清液。
- 向预包被的微孔中加入100 µL标准品稀释液和待测样品。
- 用封板膜密封微孔，于37 °C孵育90分钟。
- 弃去孔内液体，使用自动洗板机洗涤微孔。
注意：设置自动洗板机参数为每孔350 µL洗涤缓冲液，加液与吸液之间浸泡15秒，共完成5个完整洗涤循环。
- 每孔加入100 µL生物素化抗体工作液，于37 °C孵育60分钟。
- 弃去孔内溶液，按步骤15.5所述方法洗涤微孔。
- 每孔加入100 µL酶结合物工作液，于37 °C孵育60分钟。
- 弃去孔内溶液，按步骤15.5所述方法洗涤微孔。
- 每孔加入100 µL显色底物溶液，于37 °C避光孵育15分钟。
- 每孔加入100 µL终止液，轻轻混匀。
- 立即在450 nm波长下测定各孔的光密度（OD）值。
- 使用Curve Expert软件，以标准品浓度为横坐标，平均OD值为纵坐标绘制标准曲线。
- 根据样品的OD值，在标准曲线上通过插值法确定各样品的浓度。
16. 统计分析
- 运行 SPSS 软件（版本 20.0）。
- 将数据集导入 SPSS Statistics 并正确定义变量。使用 分析 > 描述统计> 探索 来计算均值和标准差（SD）。
- 使用 分析 > 比较均值 > 单因素方差分析 进行多组之间的比较。
- 直接从检验输出表格中获取 p 值，并据此进行报告。
- 所有结果均以均值 ± SD 表示，当 p < 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。