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方法文章

一步法重叠PCR快速合成CRISPR系统单导向RNA DNA模板

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DOI：

10.3791/70369

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2026年4月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cytology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, 2Translational Medicine Institute, the First People's Hospital of Chenzhou, Hengyang Medical School, University of South China, 3National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention & Ministry of Education Key Lab of Rare Pediatric Diseases, Institute of Cell Biology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China

本文内容

摘要

一种使用四种引物的一步法重叠PCR可实现DNA模板的快速、低成本制备 体外 sgRNA转录。采用优化的引物比例（50:5:1:50）可在5小时内生成高质量的sgRNA，并通过功能验证证实其有效性 体外 在HEK293T细胞中的检测与编辑活性

摘要

CRISPR-Cas 系统革新了基因组编辑技术；然而，传统的单导向 RNA（sgRNA）制备方法通常涉及耗时的克隆步骤或昂贵的商业合成试剂盒。本文介绍了一种优化的一步法重叠 PCR 策略，可快速、低成本地合成用于 sgRNA 表达的 DNA 模板 体外 sgRNA转录。利用四个部分重叠的引物，覆盖T7启动子、靶点特异性引导序列和sgRNA骨架序列，通过单轮PCR反应组装全长模板，无需克隆步骤。系统性实验优化确定了最佳引物比例（AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50），在琼脂糖凝胶电泳验证下，可最大限度减少非特异性副产物，同时提高全长产物的产量。该方法已成功拓展用于生成模板 金黄色葡萄球菌 Cas9（saCas9）sgRNA，展示了超越单一系统的跨体系适用性 Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）。尽管sgRNA的直接化学合成具有纯度高、可通过化学修饰增强稳定性以及降低脱靶效应等优势，但对于需要大量sgRNA的高通量应用或大规模筛选而言，其成本仍然过高，难以普及。 体外 切割实验表明，使用该方法生成的引导RNA所达到的编辑效率与获得的效率相当 通过 传统的质粒载体克隆方法。此外，将这些sgRNA与蛋白质组装成核糖核蛋白复合物，并递送至HEK293T细胞 通过 电穿孔在靶位点处导致可检测的插入缺失突变形成，证实了其功能活性 体内成本分析表明，与商业合成试剂盒相比，该方法显著降低了模板制备成本，同时将周转时间从数天缩短至数小时，为从事基因研究的实验室提供了一种经济便捷且可扩展的技术方案。

引言

CRISPR–Cas 系统源自细菌和古菌中的适应性免疫机制，通过实现对多种生物体基因组的精确编辑，彻底改变了基因工程领域1,2。该系统的一个关键组分是单导向RNA（sgRNA），这是一种嵌合RNA，可引导Cas核酸酶靶向特定的基因组位点；其模块化设计使得通过修改约20个核苷酸的前间隔序列即可实现重新靶向3。除SpCas9外，具有不同特性的其他Cas核酸酶也已被广泛采用。金黄色葡萄球菌Cas9（saCas9）体积更小，有利于腺相关病毒（AAV）递送，从而拓展了递送方式的选择4。每种系统都需要特定的向导RNA结构，因此一种通用的合成方法显得尤为理想3。

生成功能性引导RNA的传统方法包括基于质粒的克隆、商业化的sgRNA合成试剂盒或sgRNA的直接化学合成5,6。基于质粒的克隆需要多个耗时耗力的步骤——限制性酶切、连接、转化和菌落筛选——通常耗时超过48小时2,4,6。商业化sgRNA试剂盒虽然流程简化（<5小时），但在高通量应用中成本仍然过高，每反应通常需花费35至45美元。sgRNA的直接化学合成具有高纯度、可通过化学修饰增强稳定性以及降低脱靶效应等优势7；然而，对于需要数百条sgRNA的高通量应用或大规模筛选而言，其成本过高（每条sgRNA通常需200至280美元），难以承受。

相比之下，本文所述的一步法重叠PCR方法使用标准引物可在5小时内完成模板合成，每个sgRNA的成本约为5–8美元，显著降低了时间和材料成本。此外，该方法产生的sgRNA的编辑效率与基于质粒克隆方法所产生的sgRNA相当，这一点已通过实验验证 体外 切割实验。这些方法的比较如图所示。 图1.

重叠延伸PCR（OE-PCR）为DNA片段的连接提供了一种快速且无需连接酶的策略8。该方法已通过使用重叠引物被改进用于sgRNA模板的合成。在使用四个部分重叠引物的一步反应中，会发生竞争性结合：外侧引物（AF1和Tracr-R）界定扩增边界，而内侧引物（AF2和AF3）必须稀释，以确保从两端有序地向中心延伸。尽管存在这一理论框架，但影响组装效率的一个关键参数——最佳引物比例——尚未得到系统研究。此外，此类OE-PCR方法在不同CRISPR系统中的广泛适用性仍有待深入探索。

为解决这些局限性，本研究设计并优化了一种一步法重叠PCR技术用于sgRNA模板的合成，并对其进行验证。通过系统性的实验设计确定了最佳引物比例，并利用琼脂糖凝胶电泳筛选出可产生单一、正确大小产物的反应条件。在完成优化后，该方法在两种广泛应用的CRISPR系统（SpCas9和saCas9）中评估其通用性，均成功实现了模板的扩增。通过功能性验证使用 体外 切割实验表明，使用该方法生成的sgRNA所达到的效率与获得的效率相当 通过 基于质粒的克隆

为进一步在细胞环境中评估其功能，将 SpCas9 sgRNA 与 Cas9 蛋白结合形成核糖核蛋白（RNP）复合物，并递送至 HEK293T 细胞中 通过 电穿孔。通过T7内切酶I（T7EI）检测法评估内源性位点的基因组编辑效果，琼脂糖凝胶上的切割条带模式表明可检测到插入缺失（indel）的形成。 体内综上所述，这些结果表明，该方法能够稳定地生成高质量且具有功能性的sgRNA模板。以下方案以SpCas9为例详细描述了实验操作流程，并提供了可用于适配其他Cas核酸酶的引物模板。

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方案

使用商业化提供的 HEK293T 细胞系（ATCC CRL-3216）符合南华大学郴州市第一人民医院伦理委员会关于人源性细胞系使用指南的规定。所用试剂、软件和设备列于材料表中。

1. 设计sgRNA靶序列

  1. 使用现有的在线工具（例如 CRISPRscan、CHOPCHOP 或 Broad Institute CRISPick）确定目标基因组区域3。
  2. 访问 CHOPCHOP 网络服务器 https://chopchop.cbu.uib.no/3,9。
  3. 输入目标基因信息，并选择合适的 CRISPR/Cas 系统（例如，针对 CRISPR/Cas9 的 EGFR）（图 2A）。
  4. 查看输出结果表格，包括排序、目标序列、基因组位置、链方向、GC 含量（%）、自互补性、预测的脱靶位点（MM0、MM1、MM2、MM3）以及效率评分（图 2B）。
  5. 选择具有高靶上效率和低预测脱靶活性的向导 RNA 序列。
  6. 记录最终的 sgRNA 目标序列用于引物设计（例如，EGFR 目标序列："CTTAATTCCTTGATAGCGACGG"）（图 2B）。

2. 四种重叠引物的合成与制备

  1. 设计四个带有重叠区域的寡核苷酸引物（AF1、AF2、AF3、Tracr-R），如下所示（图 3A）：
    AF1：5′–TTCTAATACGACTCACTATAG
    [靶序列]GTTTTAGAGCTAGAAATAG–3′
    AF2：5′–GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT
    TAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC–3′
    AF3：5′–GGCTAGTCCGTTATCAACTTG
    AAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT–3′
    Tracr-R：5′–AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC–3′
    注意：将 AF1 引物中的 [target seq] 替换为 步骤 1.6 中获得的序列。
  2. 以 25 nmol 规模合成引物，并采用标准脱盐法纯化。
  3. 用无核酸酶水重悬干燥引物，使其储存浓度为 100 µM。在室温下以 5000 × g 离心 1 分钟。

3. 引物浓度优化及一步法重叠 PCR 合成 sgRNA 模板

  1. 根据表1配制不同AF2和AF3浓度的引物混合物。保持AF1和Tracr-R浓度为10 µM。
  2. 根据表2在0.2 mL无核酸酶的离心管中配制PCR反应体系。使用高保真DNA聚合酶。
  3. 用移液器轻轻吹打混匀5次，勿涡旋振荡。在5000 × g离心1分钟。
  4. 采用表3中描述的循环条件进行PCR扩增。

4. DNA模板的电泳与回收

  1. 通过将 2 g 琼脂糖溶解于 100 mL 1× TAE 缓冲液中制备 2% 琼脂糖凝胶。冷却至 50–60 °C，加入 5 µL 核酸染料，倒入模具成胶。
  2. 室温下静置 30 分钟，使凝胶完全凝固。
  3. 上样 10 µL PCR 产物与 2 µL 6× 上样缓冲液的混合物，并设置 100 bp DNA Marker。
  4. 以 100 V 电压电泳运行 30–40 分钟。
  5. 在紫外光下观察结果。确认条件 9（AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50）产生一条约 120 bp 的单一条带（图 4A）。
  6. 使用优化后的引物浓度：AF1 10 µM，AF2 1 µM，AF3 0.2 µM，Tracr-R 10 µM。
  7. 用无菌手术刀切下目标条带。紫外照射时间应限制在 ≤30 秒。
    注意：凝胶切片可在 −20 °C 保存最多 1 周，或立即进行后续操作。

5. DNA 模板的纯化

  1. 根据制造商说明书，使用凝胶回收试剂盒纯化 DNA10。
  2. 用 20–30 µL 预热（60 °C）的无核酸酶水洗脱 DNA。
  3. 测定 DNA 浓度。典型产量：15–50 ng/µL；A260/A280：1.8–2.0。
    注意：纯化的 DNA 可在 −20 °C 保存长达 1 年。

6. 体外 sgRNA的转录与纯化

  1. 使用 T7 RNA 合成试剂盒（表 4）配制转录反应体系。在冰上操作11。
    注意：使用无 RNase 的耗材，并对所有表面进行去污染处理。
  2. 在 37 °C 下孵育 16 小时。
  3. 加入 1 µL DNase I，在 37 °C 下孵育 15 分钟。
  4. 使用 RNA 纯化试剂盒纯化 sgRNA12。
  5. 用 30–50 µL 无核酸酶水洗脱。
  6. 定量 sgRNA。预期产量：700–900 ng/µL；A260/A280：1.9–2.1。
    注意：sgRNA 可在 −80 °C 下保存长达 1 年。

7. 体外 验证sgRNA活性的切割实验

  1. 准备并纯化目标 DNA，将其浓度调整至 60 ng/µL13。
  2. 配制切割反应体系（表 5）——在不加入 DNA 的情况下，于 25 °C 预孵育 30 分钟。设置阴性对照。
  3. 加入 1 µL 目标 DNA。
  4. 在 37 °C 下孵育 2 小时。
  5. 加入 4 µL 的 6× 上样缓冲液以终止反应。
  6. 将反应产物在 2% 琼脂糖凝胶中以 100 V 电泳 30–40 分钟。
  7. 在紫外光下观察结果，确认切割效果（例如，617 bp → 414 bp + 203 bp）（图 4C）。

8. sgRNA 引导的 Cas9 编辑的细胞验证

  1. 按1:2的摩尔比混合Cas9蛋白和sgRNA，制备核糖核蛋白（RNP）复合物。取10 µL Cas9（4 mg/mL）、280 µL sgRNA（60 ng/µL）和200 µL DMEM混合，室温孵育15分钟。
  2. 将HEK293T细胞培养至约80%汇合度，收集细胞并调整至每份样品3 × 106个细胞。
  3. 将RNP复合物与细胞混合，室温孵育10分钟。
  4. 转移至2 mm电穿孔杯中，在115 V、4 ms条件下施加单次脉冲（575 V/cm）。立即加入10 mL完全培养基，并转移至6孔板中。
  5. 在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。
  6. 从处理组和对照组细胞中提取基因组DNA，测定浓度。
    注意：DNA可在−20 °C保存长达6个月。
  7. 通过PCR扩增目标位点（表6和表7）。
    注意：EGFR的预期产物大小为617 bp。
  8. 在2%琼脂糖凝胶上验证PCR产物，切取正确条带并定量DNA。
  9. 进行异源双链形成（表8和表9）。
  10. 加入1 µL T7内切酶I，在37 °C孵育15分钟，随后在85 °C灭活10分钟。
  11. 加入上样缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上电泳。
  12. 在紫外光下观察，确认插入缺失（indel）的形成（617 bp → 414 bp + 203 bp）（图4D）。

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结果

通过琼脂糖凝胶电泳分析，一步法重叠PCR方案成功应用时会产生一条大小符合预期的单一、清晰的DNA条带。

引物比例不佳，特别是内引物（AF2 和 AF3）浓度过高时，会产生比预期产物更大的额外条带，表明存在非特异性扩增或引物二聚体形成，同时出现对应于不完全组装中间产物的微弱条带（图 4A，条件 1、4、7 和 10）。这些非最佳条件可作为阴性对照，以便与优化条件进行比较（图 4A，条件 9）。

使用优化后的引物比例（AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50，对应的工作浓度分别为 10 µM、1 µM、0.2 µM 和 10 µM），组装的sgRNA DNA模板在SpCas9中表现为一条约120 bp的清晰条带（图4B）。

通过功能验证来评估sgRNA的有效性 体外

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讨论

一种简化且经济的sgRNA DNA模板合成方案 通过 描述了一种一步法重叠PCR策略。该方法无需质粒构建与克隆步骤，将模板制备时间从数天缩短至约5小时。该策略的关键在于引物比例的系统性优化，确定为50:5:1:50（AF1:AF2:AF3:Tracr-R），对应的工作浓度分别为10 µM、1 µM、0.2 µM和10 µM。该比例可最大限度减少非特异性副产物，并提高全长产物的得率，支持后续应用 体外 转录和基因编辑应用。通过以下方式验证了使用该方法产生的sgRNA的功能： 体外 切割实验以及在哺乳动物细胞环境中使用HEK293T细胞进行研究。

组装过程基于PCR过程中引物的竞争性结合。定义模板边界的外侧引物（AF1和Tracr-R）维持在较高浓度（10 µM），以驱动扩增反应。内侧引物（AF2和AF3）则使用较低浓度（分别为1 µM和0.2 µM），以促进跨越重叠区域的连接。内侧引物浓度过高会导致提前启动引物结合并从不完全产物上延伸，从而产生非特异性扩增产物（图4A）。...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了湖南省卫生健康委员会卫生科研项目（资助编号 W20243264）、湖南省自然科学基金（资助编号 2023JJ50368）、湖南省教育厅重点研究项目（资助编号 24A0607）以及郴州市第一人民医院创新团队项目（资助编号 CX202103）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 bp DNA LadderTIANGENMD109电泳用DNA大小标记物
2Taq Plus MasterMixCWBIOCW2849MPCR扩增试剂
50 bp DNA LadderTIANGENMD108小片段DNA大小标记物
6DNA上样缓冲液TIANGEN1109565电泳样品上样缓冲液
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TIANGENDP219从琼脂糖凝胶中纯化DNA
Agarose I Thermo Scientific 17850琼脂糖凝胶制备
Broad Institute CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/publicsgRNA设计工具
离心机HENGNUO2-16R样品离心
认证铜胎牛血清Umedium, 北京百泰派克生物科技有限公司3023A细胞培养添加剂
CH3CO2H上海阿拉丁生化科技股份有限公司A758682TAE缓冲液配制试剂
CHOPCHOPhttps://chopchop.cbu.uib.no/sgRNA设计工具
CO2培养箱Thermo Scientific51032874哺乳动物细胞培养用培养箱
CRISPRscanhttps://www.crisprscan.org/sgRNA设计工具
DMEM（杜氏改良伊格尔培养基）凯基生物KGL1211-500细胞培养基
dsDNaseThermo Scientific EN0771转录后去除DNA模板
ECM 830 方波电穿孔系统BTXECM830细胞电穿孔
EDTA Na2BioSharpBS108TAE缓冲液配制试剂
电热恒温水浴锅上海森信实验仪器有限公司DKD8温度控制孵育
电泳仪 Trophoresis六一DYCP-31BN琼脂糖凝胶电泳
凝胶成像分析系统上海嘉鹏ZF-258凝胶可视化与成像
GenCRISPR SpCas9金斯瑞Z03624-GMP-2.5基因组编辑用Cas9核酸酶
基因组DNA提取试剂盒TIANGENYDP304基因组DNA分离
HiScribe T7 高产率RNA合成试剂盒NEBE2040SsgRNA体外转录
MiniAmp热循环仪Thermo Scientific A37834PCR扩增
NanoDrop 2000c 分光光度计Thermo Scientific 2000c核酸定量
核酸染料（如GeneRed）TIANGENRT211琼脂糖凝胶中DNA的可视化
使用Q5 Quick-Load高保真2X预混液进行PCRNEBM0578高保真PCR扩增
引物（AF1、AF2、AF3、Tracr-R）GenScriptsgRNA模板组装用寡核苷酸
Tris碱BioSharpBS083TAE缓冲液配制试剂
VAHTS RNA纯化磁珠VAHTSN412-01RNA纯化

参考文献

  1. Tamura, R., Kamiyama, D. CRISPR-Cas9-mediated knock-in approach to insert the GFP(11) tag into the genome of a human cell line. Methods Mol Biol. 2564, 185-201 (2023).
  2. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  3. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  4. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  5. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  6. Graf, R., Li, X., Chu, V. T., Rajewsky, K. sgRNA sequence motifs blocking efficient CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Cell Rep. 26 (5), 1098 (2019).
  7. Hendel, A., et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 33 (9), 985-989 (2015).
  8. Brunetti, L., et al. Highly efficient gene disruption of murine and human hematopoietic progenitor cells by CRISPR/Cas9. J Vis Exp. (134), e57278 (2018).
  9. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  10. Bien, H. . Qiagen QIAquick gel extraction kit (28704 and 28706), centrifuge processing. , (2015).
  11. MalagodaPathiranage, K., Banerjee, R., Martin, C. T. A new approach to RNA synthesis: immobilization of stably and functionally co-tethered promoter DNA and T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 52 (17), 10607-10618 (2024).
  12. Xiao, G., et al. Direct detection from sputum for drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using a CRISPR-Cas14a-based approach. BMC Microbiol. 25 (1), 188 (2025).
  13. Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
  14. Hu, Z., et al. Customized one-step preparation of sgRNA transcription templates via overlapping PCR using short primers and their application in vitro and in vivo gene editing. Cell Biosci. 9 (1), 25 (2019).
  15. Pan, C., et al. A new method to synthesize multiple gRNA libraries and functional mapping of mammalian H3K4me3 regions. Nucleic Acids Res. 51 (9), e52 (2023).
  16. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  17. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR guide RNA cloning for mammalian systems. J Vis Exp. (140), e57998 (2018).
  19. Basila, M., Kelley, M. L., Smith, A. V. B. Minimal 2'-O-methyl phosphorothioate linkage modification pattern of synthetic guide RNAs for increased stability and efficient CRISPR-Cas9 gene editing avoiding cellular toxicity. PLoS One. 12 (11), e0188593 (2017).
  20. Kratschmer, C., Levy, M. Effect of chemical modifications on aptamer stability in serum. Nucleic Acid Ther. 27 (6), 335-344 (2017).
  21. Maio, G., et al. Systematic optimization and modification of a DNA aptamer with 2'-O-methyl RNA analogues. ChemistrySelect. 2 (7), 2335-2340 (2017).
  22. Pasternak, A., et al. A chemical synthesis of LNA-2,6-diaminopurine riboside, and the influence of 2'-O-methyl-2,6-diaminopurine and LNA-2,6-diaminopurine ribosides on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 35 (12), 4055-4063 (2007).
  23. Shang, Z., et al. CRISPR/Cas12a with Universal crRNA for Indiscriminate Virus Detection. Molecules. 29 (24), 5842 (2024).
  24. Wang, Z., et al. crRNA scaffold remodeling controls CRISPR–Cas12a activity for enhanced performance. Nucleic Acids Res. 54 (5), 2310-2325 (2026).

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