冠状动脉旁路移植术患者冠状动脉内膜剥脱组织的单细胞核分离

摘要

采用优化的解离方案对冠状动脉内膜切除术组织样本进行处理，以分离单个细胞核。通过三种互补方法验证分离细胞核的完整性：台盼蓝排斥染色法评估细胞膜完整性，DAPI标记共聚焦显微镜观察确认细胞核形态，流式细胞术定量细胞核得率与纯度。

摘要

动脉粥样硬化是一种慢性、进行性炎症性疾病，其特征是动脉壁内斑块的积聚。在斑块形成的过程中，某些病变会变得不稳定，被称为高风险斑块，可能引发心肌梗死（MI）。动脉粥样硬化斑块由平滑肌细胞、内皮细胞、免疫细胞、脂肪细胞和坏死细胞组成，这些细胞均可能导致斑块破裂。研究动脉粥样硬化斑块内的细胞异质性对于深入理解斑块不稳定的潜在机制至关重要。本文介绍了一种可重复性高的实验方案，用于从接受冠状动脉旁路移植术（CABG）患者的冠状动脉内膜剥脱组织中分离并验证细胞核。所有组织在收获前均保存于湿冰上的 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基中，以维持细胞完整性。组织样本经精细剪碎后，在裂解缓冲液中使用微型研杵轻柔破碎，以裂解细胞并释放细胞核。通过台盼蓝排斥实验，在倒置显微镜下评估所分离细胞核的完整性和得率。DAPI染色可用于共聚焦显微镜下完整细胞核的可视化，而流式细胞术则提供基于荧光的定量分析，用于评估细胞核分离得率并验证细胞核群体。与传统的单细胞解离分离方法相比，细胞核分离可减少细胞应激，维持天然的转录组环境，从而避免基因表达的改变。本方法获得的高质量细胞核样品适用于后续应用，如单细胞核RNA测序（snRNA-seq）。

引言

动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）是全球导致死亡和残疾的首要原因，尽管治疗手段已取得重大进展，其疾病负担仍未减轻¹。动脉粥样硬化是一种累及动脉壁的慢性炎症性疾病，由多种细胞群体之间复杂而动态的相互作用驱动，这些相互作用共同调控疾病从早期无症状阶段悄然进展为严重影响生活质量的心血管（CV）事件²。

在中型和大型动脉中，巨噬细胞内胆固醇沉积物的积聚是动脉粥样硬化的典型特征³。动脉粥样硬化斑块由脂肪酸、胆固醇、炎性细胞、钙、纤维蛋白、平滑肌细胞、内皮细胞以及内皮下层的细胞碎片组成⁴。动脉粥样硬化斑块分为两类：低风险斑块和高风险斑块。高风险斑块的特点是容易引发后续心血管事件，通常通过斑块侵蚀或破裂等机制实现⁵。

高危斑块的特征包括较大的脂质核心、大量炎性细胞、较少的平滑肌细胞、薄的纤维帽、微钙化、斑块内出血、新生血管以及坏死核心⁶。临床上对高危斑块的检测主要通过非侵入性和侵入性成像技术进行，分别为冠状动脉计算机断层扫描血管造影（CCTA）和光学相干断层成像（OCT）^7,

方案

本研究经U. N. Mehta心脏病学与研究中心人类伦理委员会（EC/Approval/26/Cardio/14/12/2024）和古吉拉特生物技术大学（GBU_IHEC/2023/006）批准，并遵循其指导方针进行。所有参与者在样本采集前均签署了知情同意书。本研究纳入接受冠状动脉旁路移植术合并冠状动脉内膜剥脱术的患者。手术切除后，立即将内膜剥脱组织置于无血清的RPMI培养基中，于4 °C保存，并在约12小时内通过冻存管运送至实验室。有关本方案所用全部材料的详细信息，请参见材料表。

1. 细胞核分离

注意：所有步骤均需在冰上进行，并使用无菌材料。所有缓冲液均需新鲜配制。

1. 用无血清RPMI培养基清洗组织一至两次，以去除血液污渍和碎片。使用无菌镊子将组织转移至无菌培养皿中，并记录重量。
2. 使用手术刀（10号）将组织切成小块 ∼1 mm³ 在大小上。
3. 通过将以下成分依次加入无核酸酶水中，配制 1 mL 裂解缓冲液：10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、10 mM NaCl、3 mM MgCl₂（各成分均使用 1 M 储存液）、0.1%（v/v）Nonidet P-40。添加顺序如下：先加入无核酸酶水，然后依次加入 Tris-HCl、NaCl、MgCl₂....

结果

采集接受冠状动脉旁路移植术（CABG）患者的冠状动脉内膜剥脱组织。将组织称重后进行细胞核分离，进一步通过流式细胞术和共聚焦显微镜确认分离得到的细胞核（图1）。

台盼蓝评估细胞核分离质量
保存在RPMI培养基中的组织经称重后为247.8 mg。将组织剪碎后，使用微型研杵在裂解缓冲液中进行匀浆，以分离细胞核（图2A-C）。在完成细胞核分离并进行台盼蓝染色后，我们观察到明显的细胞核群体，未见完整活细胞，证实组织裂解有效。在显微镜下，分离的细胞核呈致密、圆形、深蓝色的结构，表明细胞核成功分离。此外，悬浮液中细胞核浓度约为4,033 个/µL（图2D）。相比之下，钙化斑块组织获得的细胞核产量较低，质量也较差。显微镜下还观察到样本中存在不规则的聚集体和碎片，提示在重度钙化样本中有效释放细胞核存在困难（

讨论

本方案描述了一种优化的人类冠状动脉内膜剥脱术组织细胞核分离工作流程。此处所述的细胞核分离方案专门设计用于克服从晚期冠状动脉粥样硬化斑块中获取存活且完整细胞所面临的关键限制。与依赖强烈酶消化和机械解离的传统单细胞RNA测序（scRNA-seq）方法^21,30不同，我们优化的方案采用含有非离子型去污剂（Nonidet P-40）的裂解缓冲液进行温和的机械匀浆，选择性释放细胞核，同时保持其结构完整性³¹。该方法在分析冠状动脉组织方面具有多项关键优势。首先，非离子型去污剂能有效破坏细胞膜，同时保持核膜完整，从而实现细胞核与细胞质成分、脂滴及细胞外碎片的清晰分离，避免这些杂质污染样本并阻碍微流控捕获系统^32,33。其次，通过避免酶消化，我们防止了在晚期粥样硬化病变中特别丰富的脆弱细胞群体的选择性丢失，这些细胞通常会被传统的蛋白水解处理所破坏

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 μm 细胞筛	Miltenyi Biotech	130-098-463
30 μm 细胞筛	Miltenyi Biotech	130-098-458
牛血清白蛋白	HiMedia	TC546-25G
离心机	MPW	NA	https://mpw.pl/en/offer/mpw-352r
光学显微镜	Nikon	NA	Nikon Eclipse Ts2 倒置显微镜 (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2)
共聚焦显微镜	Nikon	NA	Nikon Ti2-E 倒置共聚焦显微镜 (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series)
盖玻片	HiMedia	BG011C
CRYOCHIL 广口样本瓶	Tarsons	883191
DAPI	Sigma	D9542-5MG
DPBS	Gibco (Thermofischer)	10010-023
离心管（15 mL）	Tarsons	546021
流式细胞仪	BD Biosciences	663029	BD FACSLyric (3L12C 仪器 CEIVD)
血细胞计数板	Axibio	CCB 100
微量离心管（1.5 mL）	Tarsons	500010C
微量离心管（5 mL）	Tarsons	500050
MgCl₂	Sigma	M1028-100ML
微型研磨棒	Tarsons	160020
NaCl	Sigma	S9888-500G
NP-40	HiMedia	MB143-100ML
无核酸酶水	Gibco (Thermofischer)	W4502-1L
RNase 抑制剂	Sigma	333540201
RPMI 1640	Gibco (Thermofischer)	11875093
载玻片	Riviera	72910135
Tris-HCl	Sigma	T2194-100ML
台盼蓝	Sigma	302643-25G