需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

从肺腺癌细胞系生成肿瘤类器官培养物

298 次观看

⸱

DOI：

10.3791/70387

⸱

2026年6月12日

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Genetics and Development of Complex Phenotypes, School of Life Sciences, Fudan University, 2Shanghai Key Laboratory of Lung Inflammation and Injury, Department of Pulmonary Medicine, Zhongshan Hospital, 3National Demonstration Center for Experimental Biology Education, School of Life Sciences, Fudan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍一种快速、纯净且经济高效的方法，用于从A549细胞系建立肿瘤类器官，适用于初步实验和教学目的。

摘要

本文介绍了一种从 A549 人肺腺癌细胞系生成细胞系来源的肿瘤类器官（CDTOs）的实验方案。该方案包括将二维扩增的 A549 细胞包埋于 Matrigel 中，并在三维培养基中进行长期培养。经优化，推荐接种密度为 500 个细胞/µL，可支持稳定的类器官形成。所获得的 CDTOs 通过苏木精和伊红（H&E）染色及免疫荧光（IF）进行了表征。类器官中肺腺癌标志物甲状腺转录因子 1（TTF-1）、黏附蛋白 E-钙黏蛋白（ECAD）以及细胞骨架蛋白角蛋白 7（KRT7）均呈高表达。此外，紧密连接蛋白 Zona Occludens 1（ZO-1）的表达显示肿瘤类器官的极性出现紊乱。本方案提供了一个技术简便、成本低廉且完全由肿瘤细胞构成的肺腺癌类器官研究平台。其操作简单、可重复性强，也适用于本科阶段的实验教学，可在有限的实验课时内帮助学生掌握基本的三维肿瘤类器官培养技术。

引言

类器官是 体外 源自干细胞的自组织三维（3D）结构，在相当程度上能够模拟真实器官的生物学复杂性1类器官的细胞可能来源于诱导性多能干细胞或组织来源的细胞，后者包括正常的干细胞/祖细胞、已分化细胞以及肿瘤细胞2与传统的二维培养系统和动物模型相比，类器官能够更接近地模拟人体的生理特征，同时提供更高的实验灵活性。因此，类器官技术已广泛应用于药物开发3，个体化医学4和疾病建模5.

大量研究已为多种癌症建立了类器官模型，包括结直肠癌6、前列腺癌7、胰腺癌8、胃癌9、肝癌10、胆道癌11、乳腺癌12以及神经内分泌肿瘤。然而，肿瘤类器官研究面临的主要挑战之一是维持其纯度。例如，一项关于非小细胞肺癌的研究显示，在所建立的类器官中仅有17%为完全肿瘤性类器官，这是因为肿瘤样本通常含有正常细胞与恶性细胞的混合物，在培养前难以完全分离13。这种不纯问题可能导致非肿瘤细胞过度生长而淘汰肿瘤细胞，干扰药物敏感性试验的结果读取，并导致分子分析结果不准确，例如在RT-qPCR或Western blot检测中，肿瘤细胞的RNA和蛋白质会被不可控比例的污染细胞所稀释。

为解决这一问题，研究人员探索了选择性培养基的设计，利用肿瘤细胞对某些生长因子的依赖性降低的特性，从而抑制正常细胞的生长，同时促进肿瘤细胞的扩增14。此外，细胞分选或单克隆鉴定等策略也正在被开发，用于构建纯化的肿瘤类器官。

本方案描述了生成 利用已报道具有部分癌干细胞样特性以及增强的克隆形成能力、增殖潜能和致瘤性的 A549 人肺腺癌细胞系构建的细胞系来源肿瘤类器官（CDTOs） 体外15. 所获得的CDTOs维持了谱系特异性生物标志物甲状腺转录因子1（TTF-1）的表达16，黏附蛋白E-钙黏蛋白（ECAD）17以及细胞骨架蛋白角蛋白7（KRT7）16 并表现出肿瘤类器官特有的生理特征。该模型易于建立，且含有明确的癌细胞组分，适用于刚进入肿瘤类器官研究领域的研究人员，或在原代肿瘤类器官培养中面临肿瘤特性丢失问题的研究者。 潜在应用包括初步的药物敏感性测试18，肿瘤微环境研究19以及三维培养技术的教育培训。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

实验室的室温为22–24 °C，记为RT。建议使用水平转子离心机。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 建立原代 A549 类器官

  1. 细胞准备与 A549 细胞收获
    1. 准备一个含有 70% 汇合度 A549 细胞的 6 cm 培养皿。将 TrypLE 和 PBS 预热至 37 °C。根据实验设计和表 1计算所需细胞数量和 Matrigel 体积。
      1. 在冰上解冻至少两个孔所需的 Matrigel 分装样品（建议留有冗余），解冻时间不少于 60 分钟。准备聚苯乙烯或经组织培养处理（TC-treated）的培养板，以确保形成的凝胶穹顶保持半球形。
      2. 新鲜配制 2D 培养基（含 10% 胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基）和 3D 培养基（人肺腺癌类器官培养基）。3D 培养基可使用商业试剂盒制备，或参照 Hans Clever 实验室 Sachs, N. 等人的方法20。
        注意：一个 6 cm 培养皿经消化后通常可获得约 5,000,000 个细胞。应根据实验设计减少接种细胞数量。用于共聚焦成像的玻璃底培养板不适合 Matrigel 形成理想的三维结构。
    2. 吸除旧的 2D 培养基，用 1 mL PBS 洗涤细胞一次，以去除残留血清。吸除 PBS 后，加入 1 mL 预热的 TrypLE，于 37 °C 孵育 4 分钟。
    3. 在显微镜下观察细胞。当细胞胞质回缩、细胞间连接消失时，加入等体积（1 mL）的新鲜 2D 培养基以终止酶反应。
    4. 轻柔吹打使贴壁细胞脱离并重悬于培养液中。将细胞悬液转移至 1.5 mL 离心管中，在室温下以 300 × g 离心 3 分钟，收集细胞沉淀。
    5. 弃去上清液，用 1 mL 2D 培养基重悬细胞沉淀。取 10 µL 细胞悬液稀释至 100 µL，使用血细胞计数板计数细胞数量。根据步骤 1.1.1 计算所需体积，并使用预先润洗过的吸头将其吸出至 1.5 mL 离心管中。
  2. 将收获的细胞接种至 Matrigel 中
    1. 准备冰浴，并将移液器吸头在 -20 °C 冰箱中预冷 1 分钟，尽可能使用低吸附吸头。确保 Matrigel 分装样品中无晶体残留，且吸头插入溶液时不会产生气泡。
    2. 将含有 收获细胞的离心管在室温下以 300 × g 离心，弃去上清液。将离心管置于冰上。使用预冷的移液器吸头缓慢吸取所需体积的 Matrigel，加入冰上的细胞沉淀中。仅使用移液器的第一档，在冰上缓慢吹打重悬细胞。如需观察，请勿将样品离开冰浴超过 10 秒。
    3. 使用预冷的移液器吸头，并始终保持混合物处于冰上。将一份混合液缓慢加至每个孔的中央。加样时缓慢退出移液器吸头，仅使用第一档以避免产生气泡。
      注意：混合物应在孔中央形成穹顶状的三维结构。每处理下一孔前应重新混匀混合液。如有可能，避免使用边缘孔，并在这些孔中加入 PBS。
    4. 将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 40 分钟，使凝胶完成聚合。Matrigel 固化后，沿孔壁小心加入 3D 培养基，并继续在 37 °C 下培养。
      注意：加样过程中应避免产生气泡。若产生气泡，请勿使用该部分混合物。
    5. 培养期间，每 3 天更换一次 3D 培养基，或在培养基颜色由粉红色变为黄色时及时更换。每次换液时在倒置显微镜下观察类器官生长情况，并通过拍照记录形态变化，以监测结构发育进程。
      注意：类器官应致密且具有复杂折叠结构，直径大于 30 µm，而不应出现解体或碎片化现象（如 5000 个细胞/µL 所示）（图 1D）。

2. 类器官的固定、包埋与切片

  1. 在第6–9天准备类器官培养物。从细胞培养板中移除培养基。用1 mL冷的PBS轻轻吹打以解离类器官，并将其转移至预先用5% BSA润洗过的1.5 mL离心管中，以防止粘附。将类器官置于冰上依靠重力自然沉降，然后小心移除上清液。
  2. 加入1 mL冷的PBS重悬沉淀。让类器官在冰上依靠重力自然沉降至少5分钟，然后小心移除上清液。若部分类器官未能完全沉降，可在4 °C下以200 × g短暂离心1分钟以收集。此步骤将重复多次，统称为“小洗”。
  3. 进行两次小洗以去除残留的Matrigel。若仍有Matrigel残留，可在洗涤时向冷PBS中添加终浓度为10 mM的EDTA。
    ​注意：将样品转移至通风橱中。加入足量4%多聚甲醛（PFA）以完全覆盖类器官，在冰上固定1小时。弃去固定液，并进行两次小洗。随后进行步骤4.1的免疫荧光染色。
  4. 待类器官沉降至管底后，弃去上清液，并将样品置于70–75 °C金属浴中预热5分钟，以避免在步骤2.7中琼脂糖过快凝固。
  5. 配制3%（w/v）琼脂糖溶液于1× PBS中，放入微波水浴中加热至完全溶解且透明。避免煮沸，以防体积损失或琼脂糖浓度改变。
  6. 迅速将固定的类器官重悬于30–50 µL的3%琼脂糖中，确保分布均匀，然后在冰上冷却20–30分钟直至完全凝固，过程中避免产生气泡。
  7. 待琼脂糖-类器官混合物凝固后，用针头小心将琼脂糖块从管中取出，并转移至已标记的组织包埋盒中。
  8. 将含有琼脂糖块的包埋盒依次浸入梯度乙醇溶液（30%、50%、70%[可在4 °C保存过夜]、80%、90%、95%、100%、100%）中进行脱水。每一步均在20 rpm振荡平台上孵育30分钟。
  9. 使用前将石蜡块在65 °C烘箱中预熔化。将脱水后的含琼脂糖包埋类器官转移至二甲苯中进行透明处理。浸入两次，每次15–20分钟，以去除残留乙醇。
  10. 将组织包埋盒依次转移至第一缸石蜡浴中45分钟，再转移至第二缸石蜡浴中另45分钟。
  11. 将组织包埋盒和金属模具置于包埋仪的熔化石蜡室中。从包埋盒中取出类器官或组织样本，并将其置于金属模具中央。将模具放置于冷台上，以固定样本方向。
  12. 将组织包埋盒置于金属模具上方，加入额外熔化石蜡，然后在冷台上冷却至少60分钟。待石蜡块完全凝固后，取下金属模具，并将石蜡包埋的类器官块在4 °C保存，直至切片。
  13. 使用切片机对石蜡包埋的类器官块进行切片。确保每张切片厚度均匀，以便后续染色与成像。
  14. 将切下的切片置于维持在40 °C的水浴中，使其漂浮并充分展开石蜡带。确保每张切片展开为单一、无皱褶的平整层；丢弃任何折叠或重叠的切片。
  15. 通过将载玻片以轻微倾斜角度插入切片下方并垂直提起的方式，将展开的切片贴附于防脱载玻片上。使用铅笔在载玻片上标记，以在后续处理过程中保持样本可识别性。

3. 苏木精和伊红（H&E）染色

  1. 将含有组织或类器官切片的载玻片置于60 °C烘箱中烘烤1–2 h，以确保切片充分粘附并去除残留石蜡。
  2. 依次将切片浸入二甲苯I中15 min、二甲苯II中15 min进行脱蜡，然后通过梯度乙醇系列（100%、100%、95%、90%、80%和70%）逐级水化，每级5 min。随后用双蒸水（ddH₂O）冲洗载玻片两次，每次5 min。
  3. 用苏木精染色5 min，流水冲洗1–2 min，然后在1%酸性乙醇中分化2 s。再次用自来水冲洗1–2 min，接着在1%氨水中漂白细胞核5 s，最后再用自来水冲洗1–2 min。
  4. 通过70%、80%、90%和95%的梯度乙醇系列对切片脱水，每级3 min，然后在基于乙醇的伊红染液中复染10 min。
  5. 用无水乙醇冲洗切片两次，每次5 min。
    注意：使用基于乙醇的伊红染液时，染色前应确保已完成至95%乙醇的脱水步骤。若使用水溶性伊红，则应在脱水前进行染色。
  6. 将切片浸入二甲苯中两次，每次5 min以透明化处理，并将切片保存于二甲苯中直至封片。
  7. 从二甲苯中取出载玻片后立即使用中性树胶封片剂进行封片，注意避免产生气泡。
  8. 封片后的载玻片在室温下空气干燥30–60 min，然后在光学显微镜下观察。
    注意：在二甲苯透明后立即封片可防止氧化，确保光学清晰度。

4. 整体免疫荧光染色

  1. 从步骤2.4继续。向沉淀中加入1 mL封闭和透化溶液（5% BSA + 0.3% Triton X-100），室温孵育60分钟，或在4 °C作为暂停点孵育1–2天。
  2. 在封闭和透化溶液中按照制造商推荐的比例稀释一抗和二抗。短暂洗涤一次后，向沉淀中加入200 µL稀释后的一抗，4 °C孵育过夜。
  3. 短暂洗涤3次，向沉淀中加入200 µL稀释后的二抗，室温孵育60分钟。
  4. 随后再进行3次短暂洗涤。加入15 µL封片剂重悬沉淀，将含有类器官的封片剂滴加到载玻片上。缓慢盖上盖玻片，并用指甲油密封盖玻片边缘。切勿手动按压盖玻片，应让封片剂依靠表面张力自然铺展。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本方案的一般流程包括将2D培养的A549细胞扩增至对数生长期（补充图1A），然后接种至3D Matrigel中以形成类器官（图1A）。细胞在Matrigel中包埋后开始增殖并自我组装，主要形成单克隆类器官（图1B）。其致密且复杂的形态在传代过程中保持一致（补充图1C）。相比之下，大多数此类结构呈球形，并随着持续培养而增大；其中一部分自初始即贴附于培养板底部，形成2D克隆（图1C）。这种贴壁生长形态在高血清条件下更为常见，例如在添加10% FBS的DMEM培养基中培养的类器官（补充图1B）。为评估接种密度对克隆形成效率（CFE）和类器官大小的影响，设置了50–5000个细胞/µL的密度梯度（图1D）。图1E、F...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

该方案描述了一种优化的A549肺腺癌细胞系来源肿瘤类器官的生成方法 技术简单性、可重复性以及教育适用性。三个关键参数决定其成功： 初始细胞状态、培养基配方以及 基质成分。此外，不建议培养时间超过 14天。以下是关键参数和故障排除方法。

初始细胞状态
为尽量减少基因漂变和克隆选择，细胞保持在较低的传代次数（<20代）。在对数生长期（70%–80%融合度）收获细胞，以确保最佳的类器官形成能力。细胞计数时，确认收获的细胞为单细胞悬液，因为细胞聚集团块会影响后续检测中的定量结果，尽管通常不会干扰克隆形成；持续存在的团块需通过40 µm细胞筛过滤去除。

Matrigel 支架构建
接种后，立即将培养板转移至培养箱中，以尽量减少细胞沉降和过早黏附，允许最多有10%的接种细胞发生黏附。Matrigel 液滴在添加培养基前需在 37 °C 下孵育至少 40 分钟，以确保完全凝胶化。Matrigel 在 4...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到了复旦大学教学与学习优秀实践项目、国家教学材料研究所、基础学科人才培养国家计划（编号：J1210012）以及教育部基础学科拔尖学生培养计划（编号：20211021）的支持。图1A 使用BioRender绘制（Joe, Z. (2026) https://BioRender.com/0qi2gmd）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管BiofilCFT003015
A549 [A-549] 人非小细胞肺癌细胞ZQXZbioZQ0003STR 鉴定结果：Amelogenin: X,Y；CSF1PO: 10,12； D13S317: 11； D16S539: 11,12； D5S818: 11； D7S820: 8,11； TH01: 8,9.3； TPOX: 8,11； vWA: 14。购入时支原体检测为阴性，每两周检测一次。实验所用细胞代数在购入批次P1分装后10代以内。
高级DMEM/F12培养基Gibco12634010
抗E-钙黏蛋白抗体Abcam ab231303
抗荧光淬灭封片剂YEASEN 36307ES08
抗HIF-1α抗体Abcam ab51608
生物安全柜Nuaire LABGARDNU-540
生物组织包埋机KEDEEKD-BM
牛血清白蛋白（BSA）Sigma A1933
细胞级牛血清白蛋白（BSA）Sigma A1933-100G
离心机EppendorfCentrifuge 5702 R配摆桶转子；使用中低速离心。
离心管BiofilCFT920150
柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）ZSGB-BIO ZLI-9065
冷冻切片机冷台KEDEEKD-BL
Cytation 5 细胞成像多功能
 读板仪		BiotekCytation 5
细胞角蛋白7（KRT7）兔单克隆抗体Abclonal A4357
DMEM培养基Gibco11965092
二甲基亚砜（DMSO）Solarbio D8371
驴血清SolarbioSL050
杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）Gibco11965118
Eclipse Ts2 倒置显微镜Nikon Eclipse Ts2
伊红染色液（醇溶性）Servicebio G1001
胎牛血清（FBS）NobimpexB118-500
Forma Steri-Cycle i160 CO2 培养箱Thermo Scientifici60
苏木精返蓝液Servicebio G1040
苏木精分化液Servicebio G1040
苏木精染色液Servicebio G1004
血细胞计数板SolarbioYA0810
人肺腺癌类器官培养基（3D培养基）PMO Bio HC1001
免疫组织化学（IHC）画圈笔ZSGB-BIO ZLI-93054°C 保存
激光共聚焦显微镜  FV3000OlympusFV3000常规参数范围：PMT电压：500 ± 200 V；激光透过率：5 ± 3%；偏移量：3%
手动旋转式切片机LeicaRM2235
金属浴ALLSHENGMK-3000
微波炉Galanz
指甲油Lete
中性树胶（显微镜封片介质）BeyotimeC0173
类器官特异性细胞外基质凝胶PMO Bio BM1001
磷酸盐缓冲液（PBS）WISENT 311-010-CL
过氧化物酶阻断液Beyotime P0100A
移液器Eppendorf312300063/312300020/312400083
移液器吸头Axygen14-222-692/14-222-723/14-222-869建议尽可能使用低吸附吸头。
三维摇床SCILOGEXSK-D3309-Pro低速运行。
组织漂浮水浴箱KEDEEKD-P
吐温X-100（Triton X-100）VWR92046-34-9
台盼蓝Gibco 15250061
TryPLE酶解液Gibco12605028
TTF1 重组单克隆抗体HUABIO HA720067

参考文献

  1. Huch, M., Koo, B. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. , (2015).
  2. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. , (2021).
  3. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nat Commun. , (2019).
  4. Al Shihabi, A., et al. Personalized chordoma organoids for drug discovery studies. Sci Adv. , (2022).
  5. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. , (2016).
  6. Van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. , (2015).
  7. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. , (2014).
  8. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. , (2015).
  9. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. , (2018).
  10. Guan, Y., et al. A human multi-lineage hepatic organoid model for liver fibrosis. Nat Commun. , (2021).
  11. Roos, F. J. M., et al. Human branching cholangiocyte organoids recapitulate functional bile duct formation. Cell Stem Cell. , (2022).
  12. Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nat Cancer. , (2022).
  13. Dijkstra, K. K., et al. Challenges in establishing pure lung cancer organoids limit their utility for personalized medicine. Cell Rep. , (2020).
  14. Xu, Z., et al. Establishment of novel colorectal cancer organoid model based on tumor microenvironment analysis. Life Med. , (2024).
  15. Xia, H., et al. Identification and isolation of cancer stem cells from A549 cells. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. , (2013).
  16. Nakata, J., Whittall, I., Russo, M. G., Su, S., Friedberg, J. Systematic review of lung cancer with breast metastasis. J Thorac Dis. , (2025).
  17. Kumari, P., Dash, S., Samanta, D. E-cadherin a potential biomarker in cancer and a therapeutic target. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. , (2025).
  18. Yun, W., et al. Tumor organoids may be more suitable for clinical personalized chemotherapeutic drug screening in lung adenocarcinoma. Front Cell Dev Biol. , (2025).
  19. Monleón-Guinot, I., et al. Morphological characterization of human lung cancer organoids cultured in type I collagen hydrogels a histological approach. Int J Mol Sci. , (2023).
  20. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. EMBO J. , (2019).
  21. Liu, Y., et al. Modeling lung adenocarcinoma metastases using patient-derived organoids. Cell Rep Med. , (2024).
  22. Peng, K., et al. HIF-1α promotes kidney organoid vascularization and applications in disease modeling. Stem Cell Res Ther. , (2023).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

细胞系类器官A549细胞三维细胞培养Matrigel包埋类器官形成免疫荧光染色苏木精-伊红染色肿瘤标志物表达
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。