本方案描述了重组人SLFN14核糖核酸酶的制备及其通过质量光度法进行的化学计量分析。
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摘要
摘要
核糖核酸酶是一类特异性的RNA结合蛋白，能够催化RNA的切割，并参与包括基因调控在内的多种生物学过程。然而，由于重组蛋白表达存在挑战，许多人类核糖核酸酶的结构、功能及调控机制仍缺乏充分表征。本方法介绍了一种高效的技术流程，用于人源SLFN14（SLFN14）核糖核酸酶的瞬时表达、纯化及化学计量分析。在HEK293悬浮细胞中表达带有Flag标签的重组SLFN14蛋白，并采用快速的两步纯化流程进行分离：首先通过抗Flag亲和层析，随后进行低分辨率的尺寸排阻层析。质量光度法（mass photometry）是一种高灵敏度的单分子检测技术，结果显示，在生理盐浓度条件下，SLFN14与细胞内RNA结合形成稳定的同源二聚体；而在高盐条件下，RNA发生解离，但同源二聚体结构仍得以维持。所获得的重组人源SLFN14蛋白适用于后续的结构研究及定性生化分析。该快速制备重组人源蛋白并进行样品表征的方法，可广泛应用于其他哺乳动物核糖核酸酶及RNA结合蛋白的制备，适用于生物物理与生化特性分析。
引言
SLFN14（Schlafen 14）是一种研究尚不充分的核糖核酸酶，也是一种哺乳动物宿主限制性因子1,2,3。人类SLFN14蛋白属于由六个成员组成的SLFN基因调控因子家族，在免疫、抗病毒活性、化学敏感性以及细胞分化过程中发挥重要作用4,5,6,7,8。目前对SLFN基因调控因子作用机制的理解仍不完整；然而，许多家族成员具有核糖核酸酶活性，这对翻译调控至关重要7,9。SLFN核糖核酸酶通过蛋白同源二聚化被激活，形成一个复合的RNA结合裂隙，能够有效切割底物RNA10,11。为了防止细胞内发生非特异性RNA切割，大多数SLFN核糖核酸酶主要以单体形式存在，并依赖各家族成员特异的分子信号来激活....
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方案
涉及HEK293细胞培养的实验应在符合批准的机构生物安全规程的生物安全二级（BSL-2）条件下进行。
1. 在哺乳动物细胞中瞬时表达 SLFN14Myc-Flag
- 将哺乳动物HEK293悬浮细胞以0.5 × 106 个细胞/mL的密度接种至预热的无血清培养基中，最终体积为320 mL，置于通气带挡板的1 L锥形瓶中。
- 于37 °C、125 rpm、8% CO2、75–80%湿度条件下培养24–32小时。
- 使用台盼蓝染色和细胞计数仪检测细胞密度是否达到1.2–1.8 × 106 个细胞/mL，且细胞活力高于90%19。
- 将40 mL培养物分装至八个锥形管中。
- 在20–25 °C条件下，以400 × g离心5分钟收集细胞。
- 弃去培养上清液。
- 将每个细胞沉淀轻轻重悬于38 mL预热的无血清转染培养基中，最终体积为304 mL。
注意：步骤1.1中所述原始培养体积中剩余的16 mL将由步骤1.12所述的转染混合物补充。 - 将细胞转移至一个新的通气带挡板的1 L锥形瓶中。
- 在锥形管中，将编码重组SLFN14Myc-F....
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结果
用于瞬时表达全长重组人SLFN14Myc-Flag蛋白的哺乳动物载体如图1所示。一个两步纯化流程展示了从HEK293细胞中分离SLFN14Myc-Flag蛋白的过程（图2A）。一个具有代表性的成功变性凝胶电泳结果展示了纯化后的SLFN14Myc-Flag蛋白（图2B）。亲和层析步骤依赖于SLFN14蛋白C端Flag标签与偶联了抗Flag抗体的树脂之间特异性的高亲和力相互作用，从而实现大部分样品的纯化。随后的尺寸排阻层析步骤则去除了用于从抗Flag亲和树脂上洗脱SLFN14Myc-Flag蛋白时过量使用的3xFlag肽，并将重组蛋白保存在适用于质量光度测定的储存缓冲液中。通过具有高质量参数（包括R2值为1.00，MME为0.3%）的校准曲线计算出纯化后SLFN14Myc-Flag蛋白的分子质量（
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讨论
该蛋白质生产方案的性能和多功能性依赖于多个关键步骤。为了最大化重组蛋白的产量，我们采用HEK293细胞，因其对外源质粒DNA具有高效的摄取能力，并可在悬浮培养中达到较高的细胞密度，从而充分利用培养基体积23。在本大规模转基因递送方案中使用PEI转染试剂，因其与其他常用试剂相比，能够在相对较低的成本下实现较高的转染效率17。转染后的细胞仅短时间孵育，以促进重组蛋白的过表达，同时限制核酸酶固有的细胞毒性效应。当过表达的重组基因引发严重细胞毒性甚至细胞死亡时，将转染后的孵育时间从48小时缩短至24小时可能更为有利。在蛋白酶抑制剂存在条件下快速进行细胞裂解、裂解液澄清及蛋白捕获，可最大限度减少重组蛋白的降解。然而，对于蛋白酶敏感性蛋白，上述各步骤的孵育时间可缩短一半。为提高样品纯度，采用特异性抗Flag抗体进行样品纯化。在任何溶剂可及的末端或内部环区插入八氨基酸残基的Flag序列，可为多种不同蛋白提供一种通用的蛋白捕获策略。为进一步提升样品纯度以满足定量生物化学研究（如酶动力学）的需求，可将低分辨率脱盐柱替换为高分辨率分析型尺寸排阻色谱柱，或利用上游.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Pillon实验室成员对本文稿的审阅。本工作由美国国立卫生研究院外部研究计划、国家普通医学科学研究所（NIGMS；R35GM147123，授予M.C.P.）资助，该资助最初授予贝勒医学院，后转移至纽约州立大学布法罗分校。C.D.M. 受美国国立卫生研究院培训基金（资助号：T32 GM159557）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 (b-Me) | Sigma | M3148-500ML | 14.3 M 储存液 |
| AcquireMP 2024 R2 | Refeyn | / | 数据采集软件 |
| 腺苷-5'-三磷酸二钠盐三水合物 (ATP) | Chem-Impex International | 00015-100G | 调节溶液至 pH 7.0 |
| 抗Flag M2亲和凝胶 | Millipore | A2220 | 抗Flag亲和树脂 |
| 盐酸苄脒水合物 | Sigma | B6506-25G | 蛋白酶抑制剂 |
| 广谱蛋白标准品 (10-250 kDa) | Bio-Rad | P7719S | 预染蛋白标准品 |
| Countess 3 | Invitrogen | A49862 | 自动细胞计数仪 |
| DiscoverMP v2024 R2 | Refeyn | / | 数据分析软件 |
| 杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液 | Corning | 21-031-CV | 1x 储存液 |
| DYKDDDDK 肽 | Thermo Fisher Scientific | A36805 | 3xFlag 肽 |
| FreeStyle 293-F 细胞 | Thermo Fisher Scientific | R79007 | 哺乳动物悬浮细胞 |
| Geniust M 核酸酶 DMF 版本 | Santa Cruz | sc-391121B | 通用核酸酶 |
| HyClone CDM4HEK293 培养基 | Cytiva | SH3085802 | 无血清生长培养基 |
| HyClone SFM4Transfx-293 培养基 | Cytiva | SH3086002 | 瞬时转染培养基 |
| Immersol 518F | Zeiss | 4Y00-R0DY-1007-3BF3 | 浸油 |
| 异丙醇 | Macron Fine Chemicals | 3032-02 | |
| Laemmli 样品缓冲液 | Bio-Rad | 1610737 | 2x 储存液 |
| 亮抑酶肽 | VWR | J580-25MG | 蛋白酶抑制剂 |
| 氯化镁六水合物 (MgCl2) | Fisher Scientific | M33-500 | |
| MassFerence P1 | Refeyn | MP-CON-41033 | 500x 校准品储存液 |
| MassGlass UC 样品制备试剂盒 | Refeyn | MP-CON-21022 | 载玻片和垫圈 |
| 微型 Bio-Spin 柱 | Bio-Rad | 7326204 | 空的聚丙烯离心柱 |
| Milli-Q IQ 7000 系统 | Millipore | ZIQ7000T0C | Ⅰ型超纯水 |
| Mini-Protean TGX 免染凝胶 | Bio-Rad | 4568086 | 4-15% SDS-PAGE |
| Minitron 带湿度、冷却和 CO2 控制 | Infors | 72175 | 培养摇床 |
| MP 校准工具包 | Refeyn | MP-CON-21019 | 校准工具、软头镊子、磁铁 |
| 纳米光度计 | Implen | NP80 | 紫外-可见分光光度计 |
| 旋转混合器 | Clay Adams Brand | 421105 | |
| 抑肽酶 A | Santa Cruz | sc-45036B | 蛋白酶抑制剂 |
| 苯甲基磺酰氟 (PMSF) | Research Products International | P20270-25.0 | 蛋白酶抑制剂 |
| 聚碳酸酯摇瓶 | Duran Wheaton Kimble | WPFBC1000S | 带通气孔和挡板的烧瓶 |
| 聚乙烯亚胺 (PEI) 分子量 40,000 | Polysciences | 24765 | 转染试剂 |
| Qubit 4 荧光计 | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | |
| Qubit RNA 高灵敏度检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q32852 | 使用RNA特异性染料进行定量 |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Fisher Scientific | LC6065 | Coomassie G-250 |
| SLFN14 表达质粒 DNA | Origene | RC226257 | 人源带标签ORF克隆 |
| 氯化钠 (NaCl) | Millipore | 1.37017 | |
| Tris, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | J60202.K2 | 1 M 缓冲液储存液 |
| 三(2-羧乙基)膦盐酸盐 (TCEP) | Gold Biotechnology | TCEP10 | TCEP |
| 吐温 X-100 | VWR | M143-1L | 去垢剂 |
| 台盼蓝染色液 | Thermo Fisher Scientific | T10282 | 0.4% 储存液 |
| 吐温 20 | VWR | 0777-1L | 去垢剂 |
| TwoMP | Refeyn | MP-PRO-00001 | 质谱光度计 |
| Zeba 40K 脱盐柱 | Thermo Fisher Scientific | A57759 | 尺寸排阻色谱 |
参考文献
- Pisareva, V. P., Muslimov, I. A., Tcherepanov, A., Pisarev, A. V. Characterization of novel ribosome-associated endoribonuclease slfn14 from rabbit reticulocytes. Biochemistry. 54 (21), 3286-3301 (2015).
- Li, M., et al.
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