在小鼠肝纤维化模型中绘制肝星状细胞形态

摘要

本方案介绍了一种全面的成像流程，用于在完整肝组织中可视化并建模肝星状细胞的形态。该方法结合利用小鼠遗传学对成纤维细胞进行荧光标记， 原位 基于肝脏灌注的组织制备，以及改良的iDISCO组织透明化方法，以实现光学透明。

摘要

组织驻留成纤维细胞是多种组织中纤维化过程的细胞驱动因素。在肝脏中，肝星状细胞（HSCs）作为具有独特“星状”形态的驻留周细胞，在肝损伤时活化为促纤维化的肌成纤维细胞，进而形成肝纤维瘢痕。尽管数十年的研究已阐明了HSC活化的主要信号通路，但由于成像与分析技术的局限性，其独特的树突状形态的功能意义仍不明确。本方案介绍了一种全面的成像流程，用于在完整肝组织中可视化并建模HSC的形态。该方法结合利用小鼠遗传学对HSC进行荧光标记， 原位 基于肝脏灌注的组织制备方法，以及改良的iDISCO组织透明化技术，实现对厚度达数厘米的组织样本的光学透明化。透明化后的样本通过优化的共聚焦显微镜平台进行成像，并利用定制化的分析流程对图像数据集进行处理，从而在单细胞分辨率下实现单个肝星状细胞（HSCs）的三维重建。该技术流程共同实现了在复杂肝脏微环境中HSC形态的可重复性定位，包括其树突状突起及其与邻近细胞的空间关系。除肝脏外，该流程还可适用于其他器官中的成纤维细胞，如肺、肾、肠道和心脏，其中定居的间充质细胞在疾病中表现出类似的促纤维化作用。因此，该研究框架为开展跨器官比较研究建立了方法学基础，可用于探究纤维化疾病中成纤维细胞的结构-功能关系及其治疗脆弱性。

引言

纤维化，即组织的病理性瘢痕形成，是几乎所有慢性器官疾病的最终共同通路，在工业化国家约40%的死亡中起重要作用¹。在肝脏中，纤维化由慢性损伤引起，例如病毒性肝炎、酒精使用，或日益常见的代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD），后者目前影响美国30-40%的成年人。肝脏的慢性损伤及其导致的进行性纤维化显著增加了终末期肝病（如肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌）的风险^2,3,4,5。

肝星状细胞（HSCs）在肝脏稳态和纤维化发生过程中起核心作用。在健康肝脏中，HSCs 处于静息状态，储存维生素 A，并参与肝细胞的稳态维持以及整个肝脏的正常功能^6,7。HSC 耗竭实验明确证实了这一点：在健康肝脏中几乎完全去除 HSCs 会导致肝脏质量下降，并严重限制肝脏再生能力^7,8。当肝脏受损时，HSCs 被激活转化为类似肌成纤维细胞的细胞，这些细胞增殖、迁移至损伤区域，并过....

方案

本研究中使用的所有小鼠实验均已获得西奈山医学院机构动物护理和使用委员会的批准。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 生成带有 tdTomato (TdT) 标记的造血干细胞（HSC）的小鼠

1. 建立 Tg(lox-stop-lox-TdTomato) 与 Tg(Lrat:Cre) 繁殖鼠（Jackson Laboratories 品系编号 #007914）²⁰ 和突变小鼠资源 & 研究中心（MMRRC）品系 #069595²¹-JAX，分别）。
   注意：预计3周后产仔。应使用LratCre雌性小鼠进行育种，因已在雄性生殖系中检测到部分Cre表达。
2. 收集尾巴组织并对F1代小鼠进行基因型鉴定，以筛选出在肝星状细胞中特异性表达TdTomato荧光蛋白的Tg(Lrat:Cre);Tg(LSL-TdT)小鼠。

2. 原位 肝脏灌注与固定

1. 术前准备
   1. 通过混合 2 mL 氯胺酮、1 mL 赛拉嗪和 7 mL 水制备用于小鼠麻醉的氯胺酮/赛拉嗪混合液。
      注意：氯胺酮为管制药品，实验室使用需具....

结果

小鼠肝脏灌注和固定的成功表现为肝脏呈现均匀的浅米黄色，反映出血液被有效清除且固定液充分渗透（图1A，B）。灌注不当会导致出现暗红色或棕色的血凝块区域，这些区域会降低组织的光学清晰度，并在样本相应部位产生较高的背景信号（图1C）。

在组织透明化过程中，组织样本从灌注到二抗孵育阶段均保持浅米色外观。与之前步骤相比，组织样本在二抗孵育后颜色变得更白。当样本在DBE中孵育时，可达到完全的光学透明（图2）。此时组织呈透明状，具有坚硬的玻璃样质地，便于进行高分辨率的深层组织成像。

使用针对TdTomato标记的HSCs的抗体染色的透明化样本，在共聚焦显微镜下可保持强烈且稳定的荧光信号。抗体渗透不完全或抗体不兼容会导致最终图像中出现高背景信号¹⁷。拼图扫描可快速评估标记覆盖范围并捕获.......

讨论

本方案描述了一种可重复且可调整的样品制备流程，可实现完整肝组织中造血干细胞（HSC）形态的三维可视化与定量分析。该流程整合了遗传性荧光细胞标记、 原位 肝脏灌注及改良的iDISCO+透明化方法可实现大体积组织的单细胞分辨率成像，同时保留肝脏微环境的空间结构。

该方法成功的关键步骤之一是高效的肝脏灌注。灌注不完全可能导致血液和脂质滞留，从而造成透明效果差以及自发荧光增强^23,24,25。成功插入导管后，可见血液回流（图1A）。若无血液回流，应使用注射器将1×PBS注入导管接头，以避免灌注过程中气泡进入肝脏，否则会阻塞血管并妨碍肝脏进一步灌注。将导管插入门静脉过深、接近肝叶时，可能导致整个肝脏灌注不完全。将导管插入门静脉是一个技术难度较高的步骤，容易意外穿破静脉和/或周围组织。一旦发生穿刺损伤，应保持门静脉导管原位，并迅速在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗RFP抗体，兔源，预吸附	Rockland	600-401-379
四室35 mm玻璃底培养皿，带20 mm微孔，#1.5盖玻片	Cellvis	D35C4201.5N
AnaSed注射液（赛拉嗪注射液）	Akorn, Inc.	NDC 593990110-20	20 mg/mL
锥形离心管：50 mL	Falcon	352098
棉签	Medline	MDS202000
带锁扣的弯止血钳	Fisher Scientific	16-100-117
Cy3标记的AffiniPure驴抗大鼠IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	712-165-153
精细手术剪，4.75" 弯头，尖端锐利/钝	Roboz Surgical Instrument	728501
二苄基醚（DBE），98%	Sigma Aldrich	108014
二氯甲烷（DCM），  ≥99.8%	Sigma Aldrich	270997
二甲基亚砜（DMSO），≥99.9%	Sigma Aldrich	D8418
驴抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647标记	ThermoFisher Scientific	A31573
驴血清	EMD Millipore	S30
肉桂酸乙酯，99%	Sigma Aldrich	112372
超精细显微解剖剪；24 mm刀片	Fisher Scientific	NC9232515
F4/80单克隆抗体，大鼠源	ThermoFisher Scientific	14-4801-82
Fiji	NIH
镊子	Fisher Scientific	NC9214139
甘氨酸	Bio-Rad	1610718
肝素钠盐	Chem-Impex	29984
Hybaid杂交炉	Triad Scientific	Maxi 14
过氧化氢，30%	Sigma Aldrich	31642
Imaris 10.2.0 软件	Oxford Instruments
ImarisFileConverter 10.2.0 软件	Oxford Instruments
ImarisViewer 11.0.0	Oxford Instruments
静脉导管	Exel International Inc.	EXE 26751
氯胺酮盐酸盐注射液	Dechra	B8U4	100 mg/mL
LAS X 4.4.0.24861 软件	Leica
Leica Stellaris 8 共聚焦显微镜	Leica
甲醇，HPLC级	Fisher	A452-2
多功能旋转仪	Scientific Industries, Inc.	Model 151
针头（27G × 1/2"）	BD	305109
多聚甲醛，粉末，95%	Sigma Aldrich	158127
蠕动泵	Gilson	Model Minipuls 3
蠕动泵管，MasterFlex	Thermo Scientific	96400-16	内径3.1 mm × 长7.6 m，过氧化物固化的硅胶精密泵管，L/S 16规格，1/8 in接头
磷酸盐缓冲液（PBS）	Cytiva	SH30256.01	无菌，pH 7.0–7.2，不含钙、镁
碘化丙啶，≥94.0%（HPLC）	Sigma Aldrich	P4170
剃须刀片	American Line	66-0362
摇床平台	VWR	Model 200
叠氮化钠，≥99.5%	Sigma Aldrich	S2002
缝合线	Ethicon	J109T
注射器（1 mL）	BD	309628
Triton X-100	Sigma	T9284
Tween-20	Thermo Scientific	J20605-AP
螺口小瓶，带实心盖和铝衬垫，预组装	Sigma Aldrich	27470-U	体积7 mL，琥珀色玻璃小瓶，外径 × 高17 mm × 60 mm，螺纹规格15-425