评估雷公藤内酯对Aβ1-42小鼠模型海马区Gephyrin、Collybistin及自噬的影响

摘要

本方案描述了聚集型Aβ1-42诱导的类阿尔茨海默病小鼠模型的建立，以及雷公藤内酯对海马区抑制性突触相关蛋白、PI3K/Akt/GSK-3β信号通路和自噬相关标志物影响的评估。

摘要

阿尔茨海默病与突触功能障碍相关，但目前仍缺乏标准化的操作流程，用于评估候选干预措施对Aβ诱导的病理条件下抑制性突触相关蛋白及自噬相关信号通路的影响。本方案描述了一种建立Aβ1-42诱导的类阿尔茨海默病小鼠模型的工作流程，并评估雷公藤内酯对海马区Gephyrin、Collybistin、PI3K/Akt/GSK-3β信号通路及自噬相关标志物的影响。成年C57BL/6J小鼠接受双侧脑室内注射在聚集诱导条件下制备的Aβ1-42，随后每日腹腔注射雷公藤内酯，联合或不联合PI3K抑制剂LY294002。通过莫里斯水迷宫实验评估空间学习与记忆能力。采用苏木精-伊红染色和Aβ免疫组织化学方法评估海马神经元损伤和Aβ沉积情况，并通过Western blot分析海马组织裂解液中Gephyrin、磷酸化Gephyrin、Collybistin、PI3K/Akt/GSK-3β信号通路蛋白、LC3-II/I和p62的表达水平。关键操作要点包括标准化的Aβ1-42制备、精确的立体定位注射、一致的行为学测试条件、盲法选取感兴趣区域，以及标准化的图像和密度分析。采用该工作流程，Aβ1-42处理导致小鼠出现空间学习与记忆障碍、海马神经元损伤、Aβ沉积、Gephyrin和Collybistin表达降低、PI3K/Akt/GSK-3β信号通路改变，以及LC3-II/I和p62积累增加。雷公藤内酯部分逆转了上述行为学、组织学和分子水平的变化，而LY294002可削弱其作用效果。该方案可用于评估Aβ诱导的海马分子改变及候选干预措施的效果，但需注意该模型无法完全模拟人类阿尔茨海默病的慢性、多因素进展过程。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，其特征为认知功能下降、记忆障碍和行为异常，是老年人群中痴呆的主要病因之一。尽管已有大量研究指出，β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积、tau蛋白病变、突触功能障碍、神经炎症以及蛋白质稳态失衡在AD发病机制中起重要作用，但Aβ相关毒性作用与抑制性突触蛋白破坏之间的分子机制仍不完全清楚^1,2,3,4。抑制性突触功能障碍可能破坏神经元环路中兴奋与抑制之间的平衡，从而导致网络不稳定和认知功能损害。然而，在Aβ诱导的类AD病理条件下，调控抑制性突触相关支架蛋白的细胞内信号事件仍需进一步阐明⁵。

Gephyrin 是一种主要的突触后支架蛋白，能够锚定并稳定突触后位点上的抑制性神经递质受体，包括甘氨酸受体和γ-氨基丁酸A型受体⁶。Collybistin 由 ARHGEF9 基因编码，是一种鸟苷酸交换因子，可与 Gephyrin 相互作用，并促进抑制性突触组分的聚集及膜定位⁷。因此，Gephyrin 与 Collybistin 之间的功能相互作用对于抑制性突触的组织、维持和可塑性至关重要。该蛋白复合物的破坏可能损害抑制性神经传递，并导致认知功能缺陷。值得注意的是，Gephyrin 的稳定性及其在突触处的聚集可受到磷酸化依赖性机制的调控。已有研究报道，Aβ 寡聚体相关信号通路可影响糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等激酶的活性，后者可能促进 Gephyrin 在丝氨酸270位点的磷酸化，从而影响 Gephyrin 的聚集与降解。这些发现提示，激酶介导的 Gephyrin 调控可能是 Aβ 相关病理与抑制性突触功能障碍之间的重要分子联系^8,9。

PI3K/Akt 通路是一条关键的细胞内信号通路，参与调控神经元存活、突触可塑性、蛋白质稳态以及自噬过程。Akt 活性可通过抑制性磷酸化抑制 GSK-3β，从而调节参与神经元功能和突触稳定性的下游底物。PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路的失调已被证实与阿尔茨海默病（AD）相关的神经元损伤有关，可能同时导致突触功能障碍和异常蛋白质降解^10,11。另一方面，自噬是一种重要的细胞内降解通路，负责清除受损的细胞器和错误折叠的蛋白质。自噬-溶酶体功能障碍与阿尔茨海默病中 Aβ 的积聚、tau 蛋白病变以及神经元损伤密切相关¹²。然而，仅凭 LC3-II/I 的变化无法区分自噬小体生成增加与自噬降解受阻；因此，还需结合 p62 等其他标志物，以更准确地评估自噬相关通量的变化。综上所述，这些研究结果提示有必要在同一实验体系中同时检测 PI3K/Akt 活性、GSK-3β 介导的 Gephyrin 调控以及自噬相关标志物。

雷公藤甲素是从雷公藤（Tripterygium wilfordii）中分离出的一种生物活性二萜三环氧化合物，已被报道具有抗炎、免疫调节和神经保护作用¹³。既往研究表明，雷公藤甲素可改善阿尔茨海默病（AD）样模型的认知功能，并保护与抑制性突触相关的蛋白质。然而，雷公藤甲素处理、PI3K/Akt通路激活、GSK-3β介导的Gephyrin磷酸化、Collybistin表达以及自噬相关蛋白变化之间的机制关系尚未完全阐明^14,15。在Aβ1-42诱导的AD样小鼠模型中，雷公藤甲素是否通过PI3K/Akt/GSK-3β相关机制调控海马区Gephyrin和Collybistin的表达，目前仍不清楚。

与慢性转基因阿尔茨海默病（AD）模型（如 APP/PS1 或 5xFAD 小鼠）以及基于tau蛋白病变的模型相比，脑室内注射聚集态 Aβ1-42 能够相对快速且技术上易于操作地诱导 Aβ 相关的海马损伤和认知功能障碍。当实验目标为评估 Aβ 诱导的短期神经毒性、海马分子变化以及干预措施对特定信号通路的影响时，该方案尤为适用。然而，该模型无法再现人类 AD 中慢性淀粉样蛋白生成、tau 病理、血管改变、神经免疫复杂性或年龄依赖性进展等特征。因此，通过本方案获得的研究结果应被解读为 Aβ 诱导的 AD 样病理变化，并应在慢性转基因模型、tau 相关模型或人源神经元系统中进行理想验证。尽管已有研究证实 Aβ 病理、PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路、抑制性突触相关蛋白以及自噬相关异常与 AD 样病理相关，但目前极少有实验方案能在单一的 Aβ1-42 诱导干预模型中整合行为学检测、海马组织学评估、Aβ 免疫组织化学、抑制性突触相关蛋白分析、激酶信号通路检测以及自噬相关标志物的检测。这一方法学上的空白限制了对候选化合物是否通过特定细胞内信号通路调控抑制性突触相关蛋白变化的可重复性评估。

本实验方案的目的是提供一种可重复的工作流程，用于评估在经雷公藤内酯处理（同时或不同时使用PI3K抑制剂LY294002）的Aβ1-42诱导的阿尔茨海默病样小鼠模型中，海马区Gephyrin和Collybistin的表达及其相关调控机制。本研究的创新之处在于整合了立体定位注射Aβ1-42、药理学调控信号通路、Morris水迷宫测试、组织学与免疫组织化学分析，以及对抑制性突触相关蛋白、PI3K/Akt/GSK-3β信号通路和自噬相关标志物的Western blot分析。本研究的工作假说为：Aβ1-42诱导的阿尔茨海默病样病理将伴随PI3K/Akt信号通路功能受损、GSK-3β相关Gephyrin磷酸化改变、海马区Gephyrin和Collybistin表达降低，以及自噬相关蛋白的异常积聚；而雷公藤内酯治疗可在一定程度上逆转这些行为学与分子层面的异常。

方案

所有动物实验程序均经湖北医药学院医学伦理委员会批准，并按照机构动物护理和使用指南（编号：SYXK2019-0031）进行。涉及动物、Aβ1-42、雷公藤内酯、LY294002、多聚甲醛、二甲苯、乙醇及化学发光试剂的所有操作，均须佩戴适当的个人防护装备，包括实验服、手套和护目镜。动物尸体、脑组织、Aβ污染耗材、多聚甲醛废弃物、二甲苯废弃物以及ECL污染材料应分别收集，并依照机构生物安全和化学废弃物处理规定进行处置。图像分析使用ImageJ软件完成。免疫组织化学分析中，图像被转换为8位灰度图，或进行颜色解卷积以分离DAB阳性染色信号。同一实验中的所有图像应用相同的阈值。测量阳性染色区域面积、感兴趣总区域面积及积分密度。对于蛋白质印迹实验，采用凝胶分析工具在扣除背景后测定条带强度。目标蛋白水平以β-actin为内参进行标准化，磷酸化蛋白则以其对应的总蛋白水平为基准进行标准化。

本研究中使用的试剂和设备列于材料表中，包括产品名称、生产厂家、目录号或型号以及通用描述。

动物与实验分组
48只成年C57BL/6J小鼠，包括24只雄性和24只雌性，年龄为10-12周，体重22-28 g，购自湖北医药学院动物实验中心。小鼠饲养于特定病原体阴性环境中，温度为22 ± 2 °C，可自由摄取高压灭菌水和标准啮齿类动物饲料。经过1周的适应性饲养后，将小鼠随机分为四组：对照组、Aβ1-42诱导的AD样模型组、雷公藤内酯处理组以及LY294002联合雷公藤内酯共处理组，每组12只小鼠。各组间尽可能均衡分配雄性和雌性小鼠。

将Aβ1-42肽溶解于无菌生理盐水中，配制成终浓度为10 µg/µL的溶液。为制备诱导聚集状态的Aβ1-42，将该溶液置于循环水浴中37 °C孵育7天，使用前轻轻混匀，并在注射期间置于冰上保存。本实验所用的制备条件参考了既往发表的Aβ42聚集方法。在本研究中，实际注射用的Aβ1-42批次的聚集状态未通过硫黄素T荧光、SDS-PAGE/蛋白质印迹或透射电子显微镜进行独立表征。因此，本方案中“聚集态Aβ1-42”指的是在诱导聚集的孵育条件下制备的Aβ1-42。

为建立模型，小鼠按每10克体重0.04 mL的剂量通过腹腔注射10%戊巴比妥钠进行麻醉。通过观察足底回缩反射和角膜反射消失来确认麻醉效果充分。随后将每只小鼠固定于立体定位仪上，剃除头部毛发并用碘伏或75%乙醇消毒。沿中线做切口以暴露颅骨，在体视显微镜下确定前囟位置，并调整颅骨使前囟与后囟位于同一水平面。

使用以下相对于前囟的坐标进行双侧侧脑室注射：前后方向，−0.50 mm；内外方向，±1.00 mm；背腹方向，自颅骨表面向下−3.00 mm。使用微量注射器以缓慢速度（2 µL/min）向每侧脑室注射2 µL聚集态Aβ1-42溶液。注射过程保持恒定低速，以减少组织损伤和反流。注射完成后，针头留置约5分钟，然后缓慢撤出。对照组小鼠在相同坐标位置，采用相同的手术操作，注射等体积的无菌生理盐水。注射结束后，用缝线或伤口夹闭合头皮切口，并将小鼠置于加温的恢复笼中直至恢复意识。术后每日监测小鼠的恢复情况、体重变化、伤口愈合、理毛行为、运动活性以及疼痛或痛苦的迹象。

在立体定位注射后2周，模型被认为稳定时开始药物干预。雷公藤内酯用含有4%丙二醇的生理盐水溶解，每日腹腔注射一次，连续给药30天。雷公藤内酯治疗组每日给予0.2 mg/kg的雷公藤内酯，而LY294002联合雷公藤内酯共治疗组则每日同时给予雷公藤内酯和PI3K抑制剂LY294002（0.3 mg/kg），连续30天。对照组和Aβ1-42诱导的AD样模型组以相同注射方案给予等体积的溶剂对照溶液¹⁶。

莫里斯水迷宫实验
在末次给药后24小时，采用莫里斯水迷宫检测空间学习和记忆能力。水迷宫由一个圆形水池组成，池中注满水，水温维持在22 °C ± 1 °C。水池周围放置了视觉提示物，并在整个实验过程中保持不变。在定位航行阶段，隐藏平台固定于目标象限内。每天测试前，小鼠在测试房间内适应约30分钟。

空间导航测试持续进行6天。每次试验中，将小鼠轻轻放入水中，使其面朝池壁，从其中一个起始象限开始，允许其在最多60秒内寻找隐藏平台。若小鼠在60秒内找到平台，则允许其在平台上停留15秒；若小鼠在60秒内未能找到平台，则将其引导至平台，并让其在平台上停留20秒，以促进空间记忆的巩固。每只小鼠每天进行4次试验，使用自动视频追踪系统记录逃避潜伏期、游泳距离和游泳速度。

第7天进行探针试验，移除平台。将小鼠从原平台对侧的象限放入水中，允许其自由游泳60秒。记录小鼠穿越原平台位置的次数以及在目标象限停留的时间百分比。每次试验结束后，将小鼠擦干并放回预热的笼子中，以防止低体温^17,18。

组织采集
行为学测试结束后，小鼠通过腹腔注射10%戊巴比妥钠（剂量为0.04 mL/10 g体重）进行深度麻醉。每组随机选取8只小鼠用于海马组织蛋白提取。将小鼠大脑迅速在冰上取出，并在冰冻表面上分离双侧海马组织。海马样本置于预先标记的冻存管中，立即在液氮中速冻，随后于−80 °C保存，直至进行蛋白提取。

每组剩余的四只小鼠用于组织学和免疫组织化学分析。在深度麻醉下，小鼠经心脏灌注磷酸盐缓冲液，直至肝脏变苍白，随后灌注4%多聚甲醛。小心取出脑组织，并在4 °C条件下用4%多聚甲醛后固定24小时。固定后，脑组织被送至病理实验平台进行石蜡包埋及后续切片。多聚甲醛操作均在化学通风橱中进行，含多聚甲醛的废弃物按照机构化学废弃物处理要求单独收集。

苏木精-伊红染色
将包埋在石蜡中的脑组织切成包含海马的4 µm冠状切片。切片在60 °C下烘烤1小时，用二甲苯脱蜡两次，每次10分钟，然后依次通过梯度乙醇溶液（100%、95%、85%和75%）水化，最后用蒸馏水冲洗（每步5分钟）。水化后，切片用苏木精染色10分钟，流水冲洗，必要时用酸性乙醇分化（2秒），再用流水返蓝。随后，切片用伊红复染5分钟，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明两次，每次5分钟，最后用中性树胶封片。

在光学显微镜下观察海马形态。使用20×放大倍数和相同的成像参数，从各组动物的相同海马亚区获取图像。由一位对分组情况设盲的研究人员，通过图像分析软件，根据神经元密度、细胞核固缩以及排列紊乱程度来评估神经元损伤¹⁹。

Aβ免疫组织化学
进行Aβ免疫组织化学时，石蜡切片的脱蜡和复水步骤如苏木精-伊红染色所述进行。抗原修复采用pH 8.0的EDTA抗原修复缓冲液，在微波炉中高温加热切片，每次3分钟，共两次。切片随后冷却至室温，并用PBS洗涤三次，每次5分钟。室温下使用3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶活性，随后再用PBS洗涤三次，每次5分钟。使用5%正常山羊血清在室温下封闭非特异性结合位点，持续30分钟。切片在4 °C条件下与抗Aβ的一抗在PBS中按1:200稀释后孵育过夜。孵育结束后，切片用PBS洗涤三次，每次5分钟，然后在室温下与HRP标记的二抗孵育60分钟。PBS洗涤后，加入DAB底物显色，并在显微镜下监测显色过程。当出现可见的棕黄色阳性染色时，用蒸馏水终止反应。切片经苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。所有组别的切片均在相同显微镜设置下，于20×放大倍数下采集同一海马亚区的图像。使用图像分析软件对Aβ免疫染色进行定量分析。所有图像的阳性染色阈值保持一致，Aβ沉积量计算为每个显微视野中阳性染色面积占总细胞数的比例。

海马体蛋白提取与蛋白质印迹分析
将冷冻的海马体组织置于冰上，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的预冷RIPA裂解缓冲液进行匀浆。匀浆液在冰上孵育30分钟，并间歇涡旋震荡，以确保充分裂解。随后在4 °C条件下以12,000 × g 离心15分钟，收集上清液用于蛋白分析。使用BCA蛋白检测试剂盒按照制造商说明书测定蛋白浓度。简言之，将BSA标准品和蛋白样品设为复孔，与BCA工作液混合后，在37 °C孵育30分钟，用酶标仪在562 nm波长下测定吸光度。根据标准曲线计算蛋白浓度，并在电泳前将所有样品调整至相同的最终浓度²⁰。

每个海马组织样本中的20 µg总蛋白经12% SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上。电泳过程在浓缩胶阶段以80 V进行，在分离胶阶段以120 V进行。蛋白通过湿转法在4 °C、100 V条件下转移90分钟至经甲醇活化的PVDF膜上。转膜完成后，膜在室温下用5% BSA封闭1小时。随后，膜在4 °C下与以下一抗孵育过夜：Gephyrin（1:1000稀释）、磷酸化Gephyrin（1:500稀释）、Collybistin（1:1000稀释）、PI3K（1:1000稀释）、Akt（1:1000稀释）、磷酸化Akt（1:1000稀释）、GSK-3β（1:1000稀释）、磷酸化GSK-3β（1:1000稀释）、LC3（1:1000稀释）、p62（1:1000稀释）以及β-actin（1:5000稀释）。用TBST洗涤后，膜在室温下与HRP标记的二抗孵育1小时（1:5000稀释）。使用ECL化学发光底物显影蛋白条带，并通过化学发光成像系统采集图像。采用图像分析软件对条带强度进行定量。总蛋白表达水平以β-actin为内参进行归一化处理。高分辨率、未裁剪的Western blot图像已包含在补充材料中。

统计数据
采用统计分析和图形生成软件进行统计分析。数据以均值 ± 标准差（SD）表示，具体说明见图注。行为学测试和图像定量分析由对分组情况设盲的研究人员完成。Morris水迷宫训练阶段的逃避潜伏期采用双因素重复测量方差分析（two-way repeated-measures ANOVA）进行分析，分组和训练天数作为两个因素。探针试验数据、组织学定量、免疫组织化学定量以及Western blot条带密度分析均采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行检验。统计学显著性定义为 p < 0.05。标准显著性标记如下：*p < 0.05，**p < 0.01，以及 ***p < 0.001。确切的样本量已在相应图注中注明。实验组中雄性和雌性小鼠分布均衡。然而，未进行按性别分层的统计分析，因为本研究的设计和统计效能不足以检测性别特异性效应。此局限性已在讨论部分予以说明。

结果

Aβ1-42诱导的AD样小鼠出现学习和记忆障碍，以及雷公藤内酯治疗后的部分改善

为建立Aβ1-42诱导的阿尔茨海默病样小鼠模型，将聚集态Aβ1-42立体定位注射至C57BL/6J小鼠双侧侧脑室。模型建立后，小鼠分别接受溶剂、雷公藤内酯或雷公藤内酯联合PI3K抑制剂LY294002治疗。随后采用莫里斯水迷宫实验评估小鼠的空间学习和记忆能力。

在为期6天的位置导航阶段，所有组别的逃避潜伏期均逐渐缩短，表明小鼠通过重复训练掌握了空间学习任务（图1A）。然而，Aβ1-42诱导的AD样小鼠的逃避潜伏期始终长于对照组小鼠，尤其在后期训练中更为明显，提示其空间学习能力受损。与Aβ1-42诱导的AD样模型组相比，雷公藤内酯处理显著缩短了逃避潜伏期，而联合使用LY294002则削弱了该改善作用。这些结果表明，雷公藤内酯部分改善了Aβ1-42诱导的空间学习障碍，而该效应可被PI3K抑制所减弱。

典型的游泳轨迹进一步支持了这些行为变化（图1B）。对照组小鼠在平台位置周围表现出更直接、以目标为导向的搜索模式，而Aβ1-42诱导的类阿尔茨海默病小鼠则表现出分散且效率较低的游泳路径。接受雷公藤内酯处理的小鼠搜索行为得到改善，其轨迹更集中于目标区域。相比之下，同时接受LY294002和雷公藤内酯处理的小鼠，其搜索效率低于仅接受雷公藤内酯处理的小鼠。在移除平台后的探针试验中，Aβ1-42诱导的类阿尔茨海默病小鼠穿越原平台位置的次数少于对照组小鼠，表明其空间记忆保持能力受损（图1C）。雷公藤内酯处理增加了穿越平台位置的次数，而联合LY294002处理则减弱了这一效应。类似地，与对照组小鼠相比，Aβ1-42诱导的类阿尔茨海默病小鼠在目标象限中停留的时间百分比较低；经雷公藤内酯处理后该百分比升高，而在联合LY294002处理后再次降低（图1D）。

综上所述，这些行为学结果表明，双侧脑室内注射聚集态 Aβ1-42 可诱导小鼠出现空间学习和记忆功能障碍。雷公藤内酯可部分逆转这些行为学损伤，而 LY294002 则削弱了雷公藤内酯的保护作用，提示 PI3K/Akt 信号通路可能参与了该模型中观察到的行为学效应。

Aβ1-42 注射诱导了海马神经元损伤和 Aβ 沉积，而雷公藤内酯可减轻这些效应

为进一步验证Aβ1-42诱导的阿尔茨海默病样病理改变的建立，并评估雷公藤内酯对海马损伤的影响，对各组动物脑组织切片进行苏木精-伊红染色及Aβ免疫组织化学染色。

HE染色显示，对照组神经元排列密集且规则，细胞形态和核结构相对清晰（图2A）。相比之下，Aβ1-42诱导的类阿尔茨海默病小鼠出现明显的海马神经元损伤，表现为细胞排列紊乱、神经元密度降低以及核固缩增加。雷公藤内酯处理部分改善了海马神经元形态，与Aβ1-42诱导模型组相比，细胞排列更完整，核固缩现象较不明显。然而，联合使用LY294002削弱了雷公藤内酯的保护作用，表现为与雷公藤内酯处理组相比，神经元排列紊乱和损伤更为显著。

随后进行Aβ免疫组织化学染色，以评估海马区的Aβ沉积（图2B）。对照组中仅观察到极少的Aβ阳性染色，而Aβ1-42诱导的AD样模型组则显示出明显增多的棕褐色Aβ阳性信号。与模型组相比，雷公藤内酯处理组的Aβ阳性染色减少，表明雷公藤内酯可减轻该模型中的Aβ沉积。相比之下，接受LY294002联合雷公藤内酯治疗的小鼠，其Aβ阳性染色较单用雷公藤内酯治疗的小鼠有所增加。定量分析进一步证实了这些组织学观察结果。与对照组相比，Aβ1-42诱导的AD样模型组每显微视野中Aβ阳性信号面积占细胞总数的比例显著升高；经雷公藤内酯治疗后该比例下降；而在联合LY294002治疗后，该比例又部分回升（图2B）。

这些结果表明，Aβ1-42 注射诱导了海马神经元损伤和 Aβ 积累，而雷公藤内酯部分缓解了这些病理变化。LY294002 共同处理后观察到的逆转效应提示，PI3K/Akt 信号通路可能参与了雷公藤内酯的保护作用。

雷公藤甲素恢复了海马区Gephyrin和Collybistin的表达，并调控PI3K/Akt/GSK-3β信号通路

为了确定行为学和组织学变化是否伴随抑制性突触相关蛋白及其上游调控信号通路的改变，对各组小鼠的海马组织裂解液进行了蛋白质印迹分析。与对照组相比，Aβ1-42诱导的阿尔茨海默病样小鼠海马中Gephyrin蛋白表达显著降低，而磷酸化Gephyrin水平则升高（图3A）。雷公藤内酯处理部分恢复了总Gephyrin的表达，并降低了磷酸化Gephyrin的水平。相比之下，联合使用LY294002削弱了雷公藤内酯的作用，表现为与雷公藤内酯处理组相比，Gephyrin表达减少而磷酸化Gephyrin水平升高。这些结果表明，Aβ1-42诱导的病理变化不仅与海马Gephyrin蛋白丰度降低有关，还与Gephyrin磷酸化增强相关，而雷公藤内酯可部分逆转这些改变。

Collybistin 的表达模式与总 Gephyrin 相似。与对照组小鼠相比，Aβ1-42 诱导的类阿尔茨海默病小鼠海马中 Collybistin 表达降低，而雷公藤内酯处理可恢复 Collybistin 的表达。LY294002 共同处理则部分逆转了这一效应（图 3B）。这些结果表明，雷公藤内酯可维持海马中抑制性突触相关支架蛋白的表达，而该效应可被 PI3K 抑制所削弱。随后进一步检测了 PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路，以阐明 Gephyrin 磷酸化背后的分子变化。在 Aβ1-42 诱导的类阿尔茨海默病模型组中，PI3K 表达以及 p-Akt/Akt 比值较对照组降低，提示 PI3K/Akt 信号活性受损（图 3B）。模型组中 p-GSK-3β/GSK-3β 比值也降低。由于 GSK-3β 在抑制性位点的磷酸化反映其活性受到抑制，因此该比值降低提示 Aβ1-42 诱导的类阿尔茨海默病海马中 GSK-3β 活性相对增强。雷公藤内酯处理可增加 PI3K 表达，恢复 p-Akt/Akt 比值，并提高 p-GSK-3β/GSK-3β 比值。这些效应在联合使用 LY294002 后被削弱。

综上所述，这些结果表明，Aβ1-42 诱导的类似阿尔茨海默病（AD）的病理变化与海马区 Gephyrin 和 Collybistin 表达降低、Gephyrin 磷酸化水平升高以及 PI3K/Akt 介导的 GSK-3β 抑制性磷酸化受损有关。雷公藤内酯部分逆转了这些分子改变，而 LY294002 则削弱了雷公藤内酯的作用，支持 PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路参与该模型中海马区 Gephyrin 和 Collybistin 调控的观点。

雷公藤内酯可减轻 Aβ1-42 诱导的阿尔茨海默病样小鼠海马区自噬相关蛋白的异常

为了确定Aβ1-42诱导的阿尔茨海默病样病理以及雷公藤内酯处理是否与自噬相关蛋白的变化有关，通过Western blot检测了海马组织裂解液中LC3和p62的表达水平。与对照组相比，Aβ1-42诱导的阿尔茨海默病样小鼠LC3-II/I比值升高，表明与自噬体相关的LC3-II积累增加。同时，模型组p62的表达也升高，提示海马区自噬相关底物发生积聚。与Aβ1-42诱导的阿尔茨海默病样模型组相比，雷公藤内酯处理降低了LC3-II/I比值和p62的表达水平。这些结果表明，雷公藤内酯可减轻Aβ1-42诱导的自噬相关蛋白异常积聚。相反，与单独使用雷公藤内酯处理相比，联合使用LY294002进一步提高了LC3-II/I比值和p62的表达水平，提示PI3K抑制可削弱雷公藤内酯对自噬相关蛋白变化的影响（图4）。

总体而言，对照组提供了行为学、组织学和分子水平的基础特征，而Aβ1-42诱导的AD样模型组证实了脑室内注射Aβ1-42可导致认知功能障碍、海马神经元损伤、Aβ沉积、抑制性突触相关蛋白减少、PI3K/Akt/GSK-3β信号通路改变以及自噬相关蛋白的累积。Aβ1-42诱导模型组与雷公藤内酯醇治疗组的比较显示，雷公藤内酯醇部分逆转了这些异常变化。雷公藤内酯醇治疗组与LY294002联合雷公藤内酯醇共处理组的进一步比较表明，PI3K抑制可削弱雷公藤内酯醇的作用效果。这些结果支持了本研究的工作假设，即雷公藤内酯醇通过PI3K/Akt/GSK-3β相关机制调节Aβ1-42诱导的AD样模型中海马区Gephyrin、Collybistin及自噬相关蛋白的变化。

数据可用性：

为重现本研究结果所需的所有原始数据均已作为补充文件1和补充文件2提供。这些文件包括原始的蛋白质印迹和凝胶图像、未裁剪的印迹数据、用于统计分析的原始数值以及生成的图表。（补充文件1和补充文件2）这些文件提供了支持图1–4中报告的定量结果的原始数据。

图1：雷公藤内酯部分改善Aβ1-42诱导的阿尔茨海默病样小鼠的空间学习和记忆缺陷。（A）Morris水迷宫定位航行阶段6天内的逃避潜伏期。（B）探针试验中代表性游泳轨迹。（C）移除平台后穿越原平台位置的次数。（D）探针试验期间在目标象限停留的时间百分比。数据以均值±标准差表示。逃避潜伏期采用双因素重复测量方差分析（two-way repeated-measures ANOVA），探针试验数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。Ctr，对照组；AD，Aβ1-42诱导的阿尔茨海默病样模型组；TP，雷公藤内酯处理组；LY，LY294002与雷公藤内酯联合处理组。每组n = 6。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：雷公藤内酯可减轻 Aβ1-42 诱导的类阿尔茨海默病小鼠海马神经元损伤和 Aβ 沉积。（A）各组小鼠海马组织切片的代表性苏木精-伊红染色图像。比例尺 = 50 µm。（B）海马区 Aβ 免疫组织化学染色代表性图像及 Aβ 阳性沉积的定量分析。比例尺 = 50 µm。数据以均值 ± 标准差表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计学分析。Ctr：对照组；AD：Aβ1-42 诱导的类阿尔茨海默病模型组；TP：雷公藤内酯治疗组；LY：LY294002 与雷公藤内酯联合治疗组。每组 n = 3。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：雷公藤内酯恢复了 Aβ1-42 诱导的 AD 样小鼠海马中 Gephyrin 和 Collybistin 的表达，并调节了与 PI3K/Akt/GSK-3β 相关的信号通路。（A）各组小鼠海马组织裂解液中总 Gephyrin 和磷酸化 Gephyrin 表达的代表性 Western blot 图像及定量分析结果。（B）海马组织裂解液中 Collybistin、PI3K、Akt、磷酸化 Akt、GSK-3β 和磷酸化 GSK-3β 的代表性 Western blot 图像及定量分析结果。Collybistin 和 PI3K 的表达以 β-actin 为内参进行标准化。磷酸化 Akt 和磷酸化 GSK-3β 分别以 p-Akt/Akt 和 p-GSK-3β/GSK-3β 的比值进行定量。数据以均值 ± 标准差表示。统计学分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。Ctr，对照组；AD，Aβ1-42 诱导的 AD 样模型组；TP，雷公藤内酯治疗组；LY，LY294002 与雷公藤内酯联合处理组。每组 n = 3。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：雷公藤内酯可减轻Aβ1-42诱导的类阿尔茨海默病小鼠海马组织中自噬相关蛋白的异常表达。 各组小鼠海马组织裂解液中LC3-I/II和p62表达的代表性Western blot图像及定量分析结果。LC3-II/I比值通过LC3-II条带强度除以LC3-I条带强度计算得出，p62表达水平以β-actin为内参进行标准化。数据以均值±标准差表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计学分析。Ctr，对照组；AD，Aβ1-42诱导的类AD模型组；TP，雷公藤内酯处理组；LY，LY294002与雷公藤内酯联合处理组。每组n = 3。请点击此处查看该图的高清版本。

补充文件 1：未裁剪的 Western 印迹图像。 用于定量的条带已标出，分子量标记在可用处一并显示。请点击此处下载该文件。

补充文件2：本文中用于统计分析的原始数值数据。 该文件包含用于生成图1–4中定量图表的原始数值数据集，包括莫里斯水迷宫行为学测量结果、Aβ免疫组织化学定量结果以及Western blot条带密度分析值。请点击此处下载该文件。

讨论

本研究的核心机制假说是：Aβ1-42诱导的病理变化抑制PI3K/Akt信号通路，减少GSK-3β的抑制性磷酸化，促进Gephyrin的磷酸化，降低海马区Gephyrin和Collybistin的表达，并导致自噬相关蛋白的积累；而雷公藤内酯则通过PI3K/Akt/GSK-3β相关通路部分逆转这些变化。本研究表明，Aβ1-42诱导的类阿尔茨海默病（AD）病理变化伴随空间学习与记忆能力受损、海马神经元损伤、Aβ沉积增加、Gephyrin和Collybistin表达下调、Gephyrin磷酸化增强、PI3K/Akt/GSK-3β信号通路异常以及自噬相关蛋白的积聚。雷公藤内酯部分逆转了这些行为学、组织学及分子水平的异常，而LY294002可削弱其作用效果。这些发现支持如下模型：雷公藤内酯至少部分通过PI3K/Akt/GSK-3β介导的Gephyrin磷酸化调控及自噬相关蛋白的变化，保护海马区抑制性突触相关蛋白。需要指出的是，Aβ1-42脑室内注射模型主要反映Aβ诱导的神经毒性及类AD病理，而非人类AD完整的慢性、多因素进展过程²¹。

Gephyrin 和 Collybistin 是抑制性突触组织的核心组分。Gephyrin 将抑制性神经递质受体锚定在突触后位点，而 Collybistin 促进 Gephyrin 的聚集及其向细胞膜的定位。因此，这些蛋白的表达减少可能破坏抑制性突触的稳定性，并导致海马网络功能受损⁸。本研究发现，Aβ1-42 降低了海马中 Gephyrin 和 Collybistin 的表达，而雷公藤内酯则恢复了这两种蛋白的水平。磷酸化 Gephyrin 的增加为 Gephyrin 的丢失提供了一种合理的机制，因为 Ser270 位点的磷酸化已被证实与 Gephyrin 的弥散、聚集减少以及蛋白不稳定相关。PI3K 表达、Akt 磷酸化以及 GSK-3β 抑制性磷酸化的平行下降提示，Aβ1-42 可能削弱 PI3K/Akt 信号通路，并可能增强 GSK-3β 活性，这与 Gephyrin 磷酸化水平升高一致。相反，雷公藤内酯恢复了 Akt 的磷酸化，增加了 GSK-3β 的抑制性磷酸化，并减少了 Gephyrin 的磷酸化，而 LY294002 则削弱了这些效应。这些结果表明，雷公藤内酯可能通过 PI3K/Akt/GSK-3β 通路调控 Gephyrin 磷酸化，从而维持 Gephyrin 和 Collybistin 的表达。然而，由于使用的是全海马裂解液，这些发现反映的是海马蛋白丰度和磷酸化水平的变化，而非突触定位的直接证据^22,23。

自噬相关异常也可能参与了本模型中观察到的分子改变。自噬对神经元蛋白质稳态至关重要，但在阿尔茨海默病（AD）中自噬降解功能受损，可导致自噬小体及病理性蛋白质底物的累积^24,25。在本研究中，Aβ1-42 增加了 LC3-II/I 比值和 p62 表达水平，提示自噬小体相关蛋白 LC3-II 及自噬相关底物的累积。雷公藤内酯可降低这两个指标，而 LY294002 可部分逆转该效应，表明雷公藤内酯可能通过 PI3K/Akt 依赖性机制缓解自噬相关蛋白的累积。结合Gephyrin、Collybistin及PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的变化，这些发现拓展了人们对雷公藤内酯神经保护作用机制的理解，提示其作用不仅限于抗炎或广义的神经保护，还可能影响Aβ相关AD样病理过程中抑制性突触相关的支架蛋白、激酶信号通路以及蛋白质稳态相关通路²⁶。

该实验方案的成功与可重复性取决于多个关键步骤。首先，在注射前应严格控制并验证 Aβ1-42 的聚集状态，因为多肽的制备方式会显著影响病理结果。其次，准确的立体定位注射至侧脑室至关重要；反流、针头位置偏差或注射速度过快可能导致 Aβ 暴露量不一致，从而产生行为学或组织学结果的差异。第三，莫里斯水迷宫测试需要稳定的视觉线索、恒定的水温，并监测游泳速度，以排除运动功能障碍对结果的干扰。第四，组织学和免疫组织化学定量分析应基于预定义的海马感兴趣区域，并采用盲法分析。最后，Western 印迹结果的可靠性依赖于等量蛋白上样、合适的凝胶浓度、高效的转膜以及使用未裁剪的印迹图像来确认条带的特异性。

应考虑若干局限性。首先，Aβ1-42 注射模型无法再现人类阿尔茨海默病（AD）的慢性进展过程、tau蛋白病变、血管改变或神经免疫复杂性。其次，尽管雄性和雌性小鼠在各组中分布均衡，但本研究的样本量未针对按性别分层的分析进行充分设计²⁷。第三，全海马组织裂解液无法确定Gephyrin和Collybistin的变化是否特异性地发生在抑制性突触处。第四，所提出的PI3K/Akt/GSK-3β–Gephyrin机制仍仅为关联性推测，因为并未直接调控GSK-3β活性或Gephyrin Ser270位点的磷酸化水平。最后，LC3-II/I和p62是静态的Western blot检测指标，无法完整定义自噬流的动态变化。未来的研究应采用突触体分级分离、与抑制性突触后标志物的免疫荧光共定位、GSK-3β功能获得或功能缺失策略、Gephyrin Ser270突变体构建体，以及基于溶酶体抑制剂的自噬流检测方法。此外，还需在慢性转基因AD模型、tau相关模型及人源神经元系统中进行验证，以确定该通路是否广泛参与AD病理过程¹⁴。另一项局限性在于，用于立体定位注射的Aβ1-42制备物的聚集状态未通过硫黄素T荧光、SDS-PAGE/Western blotting或透射电子显微镜进行独立验证。尽管该多肽采用了通常用于促进Aβ1-42聚集的长时间37 °C孵育方法制备，但不同批次间聚集状态的差异可能影响病理结果。未来研究应在慢性转基因AD模型、tau相关模型和人源神经元系统中进一步验证该实验流程。额外实验应包括对Aβ1-42聚集状态的直接验证、通过染料示踪或解剖学确认评估立体定位注射的准确性、突触体分级分离、与抑制性突触后标志物的免疫荧光共定位、GSK-3β功能获得或功能缺失干预、Gephyrin Ser270突变体实验，以及基于溶酶体抑制剂的自噬流检测。在考虑三氧化二砷（triptolide）的转化应用之前，还需开展剂量-效应关系及安全性研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗Gephyrin抗体	12681	Peoteintech	用于Western blot检测总Gephyrin的一抗。
抗磷酸化Gephyrin 抗体	147011	Synaptic Systems	用于Western blot检测磷酸化Gephyrin的一抗。
抗Collybistin抗体	ab316963	abcam	用于Western blot检测Collybistin的一抗。
抗PI3K抗体	27921	Peoteintech	用于Western blot检测PI3K的一抗。
抗Akt抗体	9272	Cell Signaling Technology	用于Western blot检测总Akt的一抗。
抗磷酸化Akt抗体	4060	Cell Signaling Technology	用于Western blot检测磷酸化Akt的一抗。
抗GSK-3β抗体	12456	Cell Signaling Technology	用于Western blot检测总GSK-3β的一抗。
抗磷酸化GSK-3β抗体	5558	Cell Signaling Technology	用于Western blot检测磷酸化GSK-3β的一抗。
抗β肌动蛋白抗体	66009	Peoteintech	用于Western blot归一化的上样对照抗体。
抗LC3抗体	11972	Cell Signaling Technology	用于Western blot检测LC3-I和LC3-II的一抗。
抗p62抗体	5114	Cell Signaling Technology	用于Western blot检测p62/SQSTM1的一抗。
抗Aβ1-42抗体	ab150155	abcam	用于检测Aβ1-42的一抗。
HRP标记的二抗（抗小鼠IgG）	7076S	Cell Signaling Technology	用于Western blot中鼠源一抗的二抗。
HRP标记的二抗（抗兔IgG）	7074S	Cell Signaling Technology	用于Western blot中兔源一抗的二抗。
抗Aβ抗体	GT622,	Invitrogen,	用于Aβ免疫组织化学的一抗。
Aβ1-42	9001	上海杜马科技有限公司	用于制备诱导聚集注射液的淀粉样β肽。
雷公藤内酯	BD9097	上海毕得医药	腹腔注射给予的测试化合物。
LY294002	ab120243	abcam	用于共处理组的PI3K抑制剂。
多聚甲醛	P0099	Beyotime	用于心脏灌流固定及组织后固定的固定剂。
二甲苯	108298	Merck	脱蜡和组织透明化试剂。
乙醇	100983	Merck	石蜡切片再水化和脱水试剂。
丙二醇	294004	Merck	药物溶液配制中的溶媒组分。
蛋白酶和磷酸酶抑制剂	P1045	Beyotime	裂解缓冲液添加剂，用于保护蛋白质及其磷酸化状态。
RIPA裂解缓冲液	P0013	Beyotime	用于海马组织总蛋白提取的裂解缓冲液。
EDTA抗原修复缓冲液	ab93680	abcam	用于免疫组织化学的热介导抗原修复缓冲液。
戊巴比妥钠	P3761	Sigma	用于手术和组织取材的麻醉剂。
山羊血清	ZLI-9056	ZSGB-BIO	免疫组织化学封闭试剂。
PVDF膜	ISEQ00010	Merck Millipore	用于Western blot转膜的膜材料。
莫里斯水迷宫	VX80	上海欣软信息科技有限公司	用于空间学习与记忆评估的行为学装置及视频追踪系统。
化学发光成像系统	Doc™ XR+ 1708195	Bio-rad	用于化学发光Western blot信号采集的成像系统。
立体定位仪	/	Stoelting Technology Co., Ltd	用于立体定位脑室内注射的装置。
BCA蛋白定量试剂盒	P0006	Beyotime	用于总蛋白浓度测定的比色法检测试剂盒。
酶标仪	Synergy2	Biotek	用于BCA检测吸光度读数的仪器。
ImageJ	版本 9.0.1	美国国立卫生研究院	用于组织学、免疫组织化学及Western blot条带密度分析的图像分析软件。
GraphPad Prism	版本 8.5	GraphPad Software	统计分析与图表绘制软件。