本方案详细介绍了在自由活动的小鼠中，利用微型显微镜（miniscope）对下丘脑神经元进行体内钙成像，以研究社交状态操控（社交隔离与社交重聚）过程中下丘脑神经元的活动。该方法能够以单细胞分辨率成像下丘脑神经元活动，揭示社交需求与社交满足的神经表征，从而推动对社交稳态机制的深入研究。
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本文内容
摘要
摘要
脊椎动物的社会行为通过下丘脑神经回路受到严密调控。近期研究发现，特定分子标记的下丘脑神经元类型能够以稳态方式编码社会需求。本文中，我们详细描述了一种分步操作方案，用于开展 体内 使用头戴式微型显微镜（miniscope）在自由活动小鼠的下丘脑内侧视前核（MPN）进行钙成像。该方法可在社会隔离与重聚过程中对神经元群体动态进行纵向记录，从而在单细胞分辨率下实现对社会需求与社会满足感的机制研究。具体而言，成年小鼠通过立体定位注射将表达基因编码钙指示剂的腺相关病毒（AAV）注入MPN，随后植入梯度折射率（GRIN）透镜和miniscope基板。术后恢复后，小鼠适应miniscope成像装置，并接受定时的社会隔离与重聚处理，期间进行神经元活动成像。钙信号与动物行为同步，以便后续分析。本方案提供了全面的操作指南 体内 使用微型显微镜在小鼠执行社交行为期间对其下丘脑进行钙成像。该方法可轻松扩展应用于其他深部脑区及不同行为情境下的成像研究。此技术将细胞水平的神经活动与社交行为相联系，推动了对自由活动动物复杂行为神经基础的理解。
引言
维持社会联系的能力对动物的生存至关重要1,2,3。长期的社会隔离会引发焦虑、认知缺陷和代谢变化，而重新团聚则可恢复社会互动和社会需求4,5,6。短期社会隔离后社会行为的反弹现象表明存在一种稳态调节机制7，类似于饥饿8,9或口渴10,11,12的调控机制。然而，介导社会稳态的神经基础仍不清楚。
最近的研究表明，下丘脑中不同的神经元群体分别编码社交需求与社交满足7。在体钙成像显示，内侧视前核（MPN）中一群基因定义的谷氨酸能神经元在个体隔离期间被激活（MPNIsolation ....
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方案
所有实验程序均经西湖大学动物伦理委员会批准，动物实验方案编号为#25-076-LD-9。所有实验均遵循西湖大学实验动物资源中心的指导原则进行。本实验方案中使用的所有仪器和材料均列于材料表中。
1. 病毒注射手术
- 注射卡洛芬（5 mg/kg） 皮下注射镇痛剂，并将小鼠置于含2-3%异氟烷的麻醉诱导舱中。
注意：麻醉成功诱导的标志是脚趾夹捏反射消失且呼吸平稳、深沉。 - 2–3 分钟后，或待动物翻正反射消失时，迅速将其转移至立体定位仪。将动物的鼻部固定于麻醉面罩，并在整个手术过程中以 1–1.5% 异氟烷维持麻醉图1B氧流量通常设定在0.8–1.2 L/min之间。
注意：监测动物的呼吸频率及其他生理体征。若动物呼吸频率增加，并出现胡须颤动及其他苏醒迹象，应将异氟烷浓度提高至2-3%。 - 通过立体定位仪的门齿杆固定小鼠的门齿，拧紧鼻夹以固定头部。
- 将两个耳棒小心插入外耳道，直至其稳固就位，确保头部固定稳定且 rigid（刚性）图1B).
注意：（1）位置不当压迫颈部组织可能导致呼吸困难或固定不稳。（2）若动物在固定过程中出现呼吸费力或挣扎迹象，应立即松开并重新调整耳杆....
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结果
神经元群体的鉴定
我们在C57BL/6J小鼠的MPN中表达了GCaMP病毒并植入了GRIN透镜。手术后，小鼠单独恢复，并在至少一周内与同笼小鼠重新合笼。随后，在钙成像实验前3天，小鼠再次单独饲养。成像期间，首先记录10分钟的隔离基线，然后记录与先前同笼小鼠进行社交重聚的10分钟。社交重聚前后（每个时期各300秒）记录的钙活动用于ROC分析（详见第7节）。
在MPN区域中鉴定出两类具有独特活动模式的神经元群体，分别对应社交隔离和重聚时期。MPNIsolation神经元在社交隔离期间表现出持续性活动，并在重聚时迅速被抑制，而MPNReunion神经元则呈现相反的活动模式（图4）。此处展示了一个典型的MPNIsolation神经元（图4A）和一个典型的MPNReunion神经元（图4B
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讨论
本方案详细介绍了将在体微型显微镜钙成像与社交行为范式相结合的整合方法，用于评估下丘脑神经元的活动特征。该方法可在自然社交互动过程中实现对深部脑区结构的长期、细胞分辨率的钙成像。下文将讨论该方法的关键步骤、方法学意义、局限性以及未来应用潜力。
本方案的成功依赖于一系列精细且相互关联的手术与实验操作。首先，立体定位病毒注射的精确性至关重要。病毒滴度、注射速度以及注射后的停留时间均需优化，以实现高效且靶向的病毒表达，同时尽量减少组织损伤和病毒回流。随后，GRIN透镜的植入是整个操作成功面临的主要技术挑战。使用玻璃移液管预先切割组织、以极慢速度植入透镜以及严格控制出血，是减少组织受压、防止炎症反应并提高信号质量的关键步骤。最后，基板安装与焦平面调整可确保最佳成像范围，从而增加可成像的神经元数量。术中实时成像以及根据经验抬高微型显微镜以补偿水泥收缩，也是关键技巧之一。
在行为检测中，社会隔离与重聚范式的设计能够有效产生社会需求和社会满足的内部状态。在隔离初期6小时内以及经过数天隔离后的社会重聚期间进行钙成像，可揭示不同.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益或利益冲突。本手稿的编辑过程中使用了ChatGPT，但所有作者均进行了仔细且详尽的校对。
致谢
我们感谢Catherine Dulac教授对微型显微镜实验初期培训的支持，以及Yang Sun在手术操作中的帮助。本工作得到了西湖大学启动资金、NOMIS基金会、哈佛大学谭-杨自闭症研究中心、D.L.获得的Jane Coffin Childs医学研究奖以及D.L.获得的Charles A. King信托博士后奖学金的资助。我们感谢刘实验室所有成员对本文稿提出的宝贵意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AAV2/9-hSyn-jGCaMP7f-WPRE-pA | Taitool | S0587-9 | 病毒载体，手术 |
| 可吸收止血明胶海绵 | FUKANGSEN | FKS-A | 手术 |
| 聚维酮碘溶液（10%碘化聚维酮）500 mL | HYNAUT | Q13702855HNW002 | 手术 |
| 行为视频摄像机 | DAHENG | MER2-160-227-U3C | 行为学 |
| 卡洛芬 | MCE | HY-B1227 | 手术 |
| 数字立体定位仪 | RWD | 68803 | 手术 |
| 乙醇（75%） | 国药集团化学试剂有限公司 | 801769610 | 手术 |
| 眼膏 | FODU | H37022025 | 手术 |
| Inscopix 数据处理软件（IDPS） | Inscopix | 1000-006551 | 数据分析 |
| 异氟烷 | RWD | R510-22-10 | 手术 |
| Kwik-Sil 粘合剂套装（2个装） | World Precision Instruments | KWIK-SIL | 手术 |
| 微型钻头 | RWD | 78001 | 手术 |
| MP-1000 微电极拉制仪 | RWD | MP-1000 | 手术 |
| 多功能动物麻醉系统 | RWD | TAIJI-IE | 手术 |
| 纳升微量注射泵 | RWD | R-480 | 手术 |
| nVista 3.0 迷你显微镜 | Inscopix | 1000-004323 | 成像 |
| 眼科镊 | RWD | F12006-10 | 手术 |
| 手术剪 | RWD | S14001-15 | 手术 |
| ProView 植入套件 | Inscopix | 1000-004238 | 手术与成像 |
| 树脂粘固剂（Super-bond） | Sun Medical | Super bond C&B | 手术 |
| 基板盖套装（5个装） | Inscopix | 1050-004639 | 成像 |
| 基板套装（5个装） | Inscopix | 1050-004638 | 成像 |
| GRIN透镜套装（5个装），直径0.6 mm，长度7.3 mm | Inscopix | 1050-004626 | 手术与成像 |
| 立体定位显微镜 | Murzider | MSD205A | 手术 |
| 无菌生理盐水 | QIDUKELIN | R1B25071902 | 手术 |
参考文献
- Beery, A. K. Frank Beach award winner: Neuroendocrinology of group living. Horm Behav. 107, 67-75 (2019).
- Krause, J., Ruxton, G. D. Living in groups. , Oxford University Press. (2002).
- Riters, L. V., Kelm Nelson, C. A., Spool, J. A.
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重印与许可
