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表面鱼和洞穴鱼种群中Astyanax mexicanus的脑与肠道解剖

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DOI：

10.3791/70412

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2026年2月24日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, UPR- Medical Sciences Campus, 2Molecular Sciences Research Center

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于分离和提取表面栖息型及洞穴适应型Astyanax mexicanus完整脑组织和肠道组分的实验方案。该方案可适用于后续多种分析应用，包括转录组学、代谢组学以及肠道微生物组分析。

摘要

硬骨鱼类被用于回答从发育、遗传学到神经科学等多个领域的研究问题，近年来还被用于理解肠-脑轴的复杂性，甚至在更广泛的背景下研究肠-脑-肝轴。墨西哥盲鱼（Astyanax mexicanus）由于存在形态和生理上明显不同的生态型，包括栖息于河流的表层鱼和适应洞穴生活的盲眼洞穴鱼，因此在比较生物学和发育进化研究中得到越来越多的应用。对洞穴生境的适应伴随着形态特征、行为特征以及肠道微生物多样性的一系列变化，这些变化在实验室条件下也能被观察到。这为研究微生物组、代谢活性、神经适应与复杂行为输出之间的相互作用提供了可能。目前，可通过透明化大脑的全脑图谱分析和肠道微生物测序来检测与表层鱼和洞穴适应表型相关的细菌多样性，从而探究上述相互作用。然而，大多数此类研究都需要完整、精细解剖并妥善保存的全器官和组织，以便后续实验处理。本实验方案详细描述了一种分步解剖大脑和肠道的方法，适用于表层鱼和洞穴鱼两种生态型，可完整取出并分离全脑及腹部器官。

引言

动物模型，包括脊椎鱼类，是研究相对简单且易于操作的系统中生物学现象和复杂病理的重要工具。例如，斑马鱼（Danio rerio）是最广泛使用的硬骨鱼类模型之一，已有大量方法用于研究其发育、遗传学、生理学和行为，在生物医学和神经行为科学领域具有重要意义1,2,3,4,5,6,7,8。目前使用斑马鱼的一大优势在于，已有多种方法可用于研究功能缺失型突变系中器官和组织的组织学与病理学，且存在详细的分步解剖操作方案3,9,10。

然而，在过去几十年中，出现了多种其他适合回答不同类型科学问题的硬骨鱼类模型，涉及进化生物学11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21、衰老相关的生物学机制2,22、毒理学23,24以及其他领域25,26。一个典型的例子是墨西哥盲鱼（Astyanax mexicanus），这是一种源自墨西哥东北部的硬骨鱼类，其祖先为栖息于河流表层的有眼鱼类，目前已发现超过30个种群的无眼洞穴型盲鱼（图1）12。

洞穴鱼已演化出一系列形态学特征，包括眼睛退化12,27色素丧失28，感觉系统的扩展17,29,30，以及脂肪储存增加12,31，使其能够在恶劣的洞穴环境中生存。这些鱼类还演化出一系列行为特征，包括睡眠时间的减少19,20焦虑32，群游行为33和攻击行为13,18,19,20,29,34,35,36,37，与其祖先的表层鱼类相比。这些性状的适应很可能是遗传变异和环境压力共同作用的结果35,36,28，包括河流与洞穴之间的生境差异。一个日益有用的模型可用于探究遗传变异对形态和行为性状适应的影响16,18,19,20,35,38,39 以及最近关于肠道微生物群多样性的研究14,15，对于可能需要采集脑、肠道、肝脏等器官的研究问题，有必要制定一种可供广泛科研群体使用的标准化大体解剖学解剖方案。尽管全脑解剖及器官解剖在 A. mexicanus 此前虽已有相关研究，但尚缺乏一种一站式、全面的方法，以帮助研究者高效地完成此类解剖操作。这对于许多研究项目至关重要，尤其是那些需要采集样本用于代谢组学分析的项目。40，宏基因组学41或全器官成像16,38我们的目标是消除该模型在后续处理中获取器官时的故障排除障碍，使科研社区的用户能够无缝专注于自身研究。

在本实验方案中，我们概述了一种针对成年地表鱼及帕琼洞穴鱼（Astyanax mexicanus物种）进行脑组织和胃肠道解剖的逐步操作方法。该方法可适用于多种后续实验流程，包括肠道微生物组分析、组织代谢组学以及用于光片显微镜全脑成像的脑组织透明化处理。本技术也可在同一标本上同步应用。

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方案

本方案根据波多黎各大学分子科学中心和医学科学校区经IACUC批准的方案2024-0004和A790125进行。

1. 解剖前准备

  1. 若使用Sylgard培养皿（SP培养皿）进行解剖，需确保在操作前已准备好培养皿，因为其固化可能需要数天时间。
  2. 制备SP培养皿时，使用Sylgard 184与Elastomer 184按10:1的比例混合。将200 g Sylgard 184基础剂与20 g固化剂加入一次性杯子中混合均匀。将混合物倒入培养皿中，填充至培养皿深度的三分之一至二分之一。轻敲培养皿以去除气泡，盖上盖子。确保培养皿填充充分并置于水平面上。静置固化至少1周。42.
    注意：若采集样本用于16S rRNA测序或宏基因组学分析，请勿使用SP培养皿。应使用经灭菌的一次性培养皿，并在层流罩内遵循无菌操作技术。若进行无菌操作，建议使用70%乙醇和杀菌性洗涤剂清洁层流罩，并最好用杀菌性紫外C灯照射15分钟。上述步骤应在将已消毒和高压灭菌的材料/工具放入层流罩之前完成。
  3. 在解剖显微镜两侧放置纸巾。将一侧指定用于存放废弃物（如多余的器官组织），另一侧用于放置灭菌的解剖工具。裁剪小块纸巾，用于在每次解剖之间清洁工具。
  4. 配制1 PBS并将其置于冰水浴中预冷备用，以便在需要时清洗区域或样本以提高可视性。根据具体实验方案，可选择不使用1 PBS。
    注意：例如，在采集用于宏基因组测序的样本时，不建议使用43若在此类方法中使用1 PBS，建议收集1PBS样本进行测序，以筛查可能的污染。
  5. 将SP（或一次性无菌培养皿）置于显微镜下，并确保所有工具均已备齐（解剖工具包、用于冰上组织收集的微量离心管等）。
  6. 将1 PBS和已标记的微量离心管置于附近的冰桶中。手边准备一支塑料滴管用于1 PBS。
  7. 在附近设置鱼类安乐死操作区。准备一个冰浴装置，将冰水混合物放入带有塑料格栅的容器中，并加入鱼类原培养系统或原鱼缸中的水。
    注意：根据下游实验方案（样品后续处理需求），也可使用MS-222。

2. 成年表面鱼和洞穴鱼的大脑解剖

  1. 将鱼置于冰水混合物中实施安乐死。确保鱼体无任何运动，沉入底部，且无鳃盖运动。所需时间取决于鱼的大小。较大的鱼停止鳃盖运动所需时间更长。
    注意：幼鱼停止鳃盖运动（安乐死）约需 2–5 分钟，成年鱼和大型鱼可能需要约 10–15 分钟。不同形态类型之间存在差异。某些洞穴鱼种群相较于表层鱼种群，麻醉/安乐死所需时间可能更长。养殖与实验方案建议在不同种群中验证麻醉和安乐死程序，因为不同形态和种群之间的反应可能存在差异11。
  2. 将鱼转移至 SP（或在超净台内使用一次性灭菌培养皿），用移液器滴加冰浴的 1× PBS 进行清洗（图 1）。
  3. 用解剖刀在鳃后约 2 mm 处切断，将头部与身体分离（图 2）。此操作可保护部分中脑，并便于后续解剖后对脑组织的操作，避免损伤。用纸巾将身体部分移至废弃物区域，随后放入生物危害袋，并置于生物危害废物容器中以待处理。
  4. 使用精细镊子或止血钳牢固夹持鱼头后部。用显微剪从口缘向头后部及鳃部剪开（图 3）。
  5. 在另一侧重复上述操作。去除下颌骨，然后使用第二把精细或超细镊子彻底清理腹面。
    注意：应沿鳃的内侧轮廓进行操作。
  6. 此时，继续用止血钳牢固夹持鱼头，或使用 T 形针将鱼头固定在 SP 上（如使用），注意从口部尖端小心固定。
  7. 使用超细镊子或剪刀将双眼分离。将镊子或剪刀尖端插入眼球边缘，然后轻柔地拉出或剪除眼球（图 4）。
    注意：此步骤不适用于洞穴鱼（应刮除眼部皮肤）。
  8. 在头部顶部从前往后划一条经过两眼之间的正中矢状线，将头部分为左右两部分。随后使用显微剪沿该线浅层剪开（图 5）。
  9. 用精细镊子小心地开始将头部两侧分开，特别注意不要损伤下方结缔组织中嵌入的脑组织。当脑组织暴露后，用超细镊子的尖端将脑组织从颅骨中分离（图 6）。
    1. 避免用力拉扯镊子导致脑组织受压破裂。若仍有残留，应通过后脑或脊髓部位夹持，以保持脑组织完整性。
    2. 若脑组织仍附着于头骨一侧，使用超细镊子小心地将脑组织从颅骨床分离：将镊子尖端轻轻插入脑组织后方，轻柔抬起。全程避免拉扯，以防断裂。
  10. 脑组织取出后，使用超细镊子轻柔清理，去除任何脂肪或周围组织。将脑组织放入微量离心管或适合后续实验流程的储存容器中。此时可保留完整脑组织，或采集脑部亚区（如端脑、视顶盖、嗅球）（图 7）。
  11. 端脑分离：为获取端脑，使用超细镊子在端脑与视顶盖交界处的基部夹取，并将端脑从其余脑组织中分离。转移至相应的储存管中。
  12. 若用于宏基因组学分析，将采集的样本在液氮中速冻，并储存于 -80 °C。操作时将微量离心管浸入液氮中 5 秒即可。

鱼类解剖结构比较；两个标本置于培养皿中用于形态学研究。
图1：Astyanax mexicanus 的形态型。（A）表层鱼类。（B）帕琼洞穴鱼。比例尺：10 mm 请点击此处查看该图的放大版本。

去头鱼标本，解剖学研究，图像A与B对比，科学研究分析。
图2：头部的分离。（A）表型鱼。（B）帕琼洞穴鱼 请点击此处查看该图的放大版本。

鱼类头骨解剖、显微镜实验；骨骼结构的解剖学研究及组织分析。
图3：从分离的鱼头中取出下颌。 （A）表型鱼。（B）帕琼洞穴鱼 请点击此处查看该图的放大版本。

组织解剖实验；显微镜样品制备；培养皿中样品的特写。
图 4：从分离的鱼头中取出眼球。 在洞穴鱼中，可对区域进行刮擦以减薄组织。(A) 表型鱼。(B) 帕琼洞穴鱼 请点击此处查看该图的放大版本。

静态平衡、组织弹性测试、力施加示意图、科学图像分析。
图 5：鱼头部背侧的矢状切面。（A）表型鱼。（B）帕琼洞穴鱼。比例尺：5 mm 请点击此处查看该图的放大版本。

组织解剖实验，特写；显微观察；解剖学研究；组织学分析。
图6：头部侧部组织的分离及颅腔内脑组织的暴露。 （A）表型鱼。（B）帕琼洞穴鱼。（C、D）从颅骨床中取出脑组织。比例尺：5 mm 请点击此处查看该图的放大版本。

嗅觉与脑解剖结构示意图，标注区域：嗅球、端脑、视顶盖。
图7：A. mexicanus 脑区解剖结构。（A）表型鱼。（B）帕琼洞穴鱼。比例尺：5 mm 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 成年地表鱼和洞穴鱼的肠道解剖

  1. 按照上述方法实施安乐死。
  2. 用无绒擦拭布将鱼体擦干，然后将其置于洁净的解剖板（SP）上，并用移液器滴加冰冷的1× PBS（或根据下游应用使用系统养殖水）覆盖样本，以保持组织湿润。
  3. 使用T型针将鱼体固定在解剖板（SP）上（若使用解剖板）。
    1. 若不使用解剖板，可用止血钳从口部前端牢固夹住鱼体以进行切割操作。将T型针插入眼眶前部（盲鱼同样适用），确保其穿透至解剖板。
    2. 从尾部将T型针插入解剖板，确保鱼体在操作过程中保持静止。
      注意：若在同一标本上同时进行脑组织和胃肠道解剖，建议在将鱼体固定于板面之前，先用解剖刀迅速断头。在鳃盖（gill operculum）后方做一斜向切口，保留头部顶端结构并避开肠道。理想情况下，将头与躯干分离，并由两名经验丰富的解剖人员分别处理，以提高效率。断头后，可将前部T型针插入躯干最前端的上方位置，后部T型针则保持原位（图8）。
  4. 使用解剖显微剪，沿腹部中线从肛鳍/肛门向鳃盖（覆盖鳃部的硬质结构）方向，沿鱼体腹面弧度做半圆形切口，剪开皮肤及下方肌肉组织（图9）。
  5. 用显微剪和精细镊子去除鳃盖和胸鳍。
    注意：此步骤有助于提高去皮效率，但可能延长解剖时间，可根据实际需求选择是否省略。
  6. 从肛鳍处向上剪开皮肤及下方肌肉组织，然后向前朝鳃部方向延伸切口，根据需要扩大腹侧切口（图10）。最终形成一个可视窗口。
  7. 借助精细镊子撑开切口，暴露体腔。用精细镊子夹住皮肤边缘，轻轻提起并剥离（图11）。
  8. 切断肠道的前、后端连接，小心取出所有内脏器官——将整个胃肠道系统从体内分离，并置于解剖板（SP）的洁净区域，或一次性无菌培养皿中（图12 和 图13）。
  9. 首先使用超细镊子将肝脏与其他腹部器官分离。如需单独收集肝脏，应将其放入微量离心管中，或根据下游实验方案或需求采用适当的保存方法。小心拉伸肠道，辨认胃部以及中肠/后肠区域（图14）。
  10. 将胃部与中肠/后肠分离。
  11. 用精细镊子夹住中肠/后肠的前端和后端，轻轻拉伸，使其延展至全长。
  12. 将组织收集至微量离心管中，并按要求妥善保存。
  13. 若用于宏基因组学分析，需将收集的样本在液氮中速冻，并于-80 °C保存。具体操作为将微量离心管浸入液氮中5秒。

在培养皿中进行鱼类解剖的装置；图中步骤 A-B 展示解剖学结构保存过程。
图 8：胃肠道解剖过程中的固定针位置。（A）表面鱼类。（B）帕琼洞穴鱼 请点击此处查看该图的放大版本。

鱼类肌肉反应实验；显示用于观察肌肉刺激的解剖装置。
图9：解剖前腹部切口。 (A) 表层鱼类。(B) 帕琼洞穴鱼 请点击此处查看此图的放大版本。

解剖过程，鱼类解剖结构，实验室实验展示使用工具进行切口，用于教学研究。
图10：去除鳃盖并制作观察窗。（A）表型鱼。（B）帕琼洞穴鱼 请点击此处查看该图的放大版本。

鱼类解剖结构对比图；图A和图B，展示内部结构。
图11：去除浅层侧部皮肤和肌肉。 （A）表层鱼类。（B）帕琼洞穴鱼 请单击此处查看此图的放大版本。

Fish dissection experiment; four-step digestive system analysis; educational biology diagram.
图12器官 原位 在成年鱼体腔内，去除肌肉和皮肤后。 (A) 雌性表层鱼，腹腔暴露，移除卵子以暴露器官。B雄性表面鱼类，腹腔及器官已暴露。C) 暴露腹腔并移除卵子以显露器官的雌性帕琼洞穴鱼。D雄性帕琼洞穴鱼的腹腔及器官。黑色箭头指向消化道束所在区域。 请点击此处查看此图的放大版本。

清创过程；两个解剖的鸡胚心脏；解剖学比较；标记为 A 和 B。
图 13：从鱼体腔中取出的消化道组织束。 （A）表型鱼。（B）帕琼洞穴鱼。比例尺：10 mm 请点击此处查看此图的放大版本。

鱼类解剖比较；标注的胃、肝脏、中肠、幽门盲囊；解剖学分析。
图14：地表鱼与洞穴鱼分离的胃肠道器官。（A）地表鱼。（B）帕琼洞穴鱼。比例尺：10 mm 请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

根据本方案，提取了表面鱼和帕琼洞穴鱼形态型的大脑和肠道内容物，并测量了完整肠道、端脑和视顶盖的长度，随后在两者之间进行比较（图15）。我们采用独立样本的Welch t检验进行统计分析，样本量为n = 6条表面鱼和n = 6条帕琼洞穴鱼。表面鱼的视顶盖尺寸显著大于帕琼洞穴鱼，这与先前发表的大脑配准方案结果一致16,38，其中长度在表面鱼中更大（表面鱼 = 2.53 ± 0.30 mm；帕琼洞穴鱼 = 1.82 ± 0.25 mm；t = −4.44，p = 0.00137；Cohen's d = 2.56），宽度也更大（表面鱼 = 4.29 ± 0.49 mm；帕琼洞穴鱼 = 3.17 ± 0.42 mm；t = −4.24，p = 0.00179；Cohen's d = 2.45）。两种形态型在端脑长度（p = 0.24...

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讨论

随着A. mexicanus在从进化到生物医学神经科学及微生物学等多个研究领域中作为模式生物的重要性日益增加，亟需一种标准化的器官解剖与采集方法。尽管此前已有针对某些独立结构的研究与记录，包括视顶盖16,38、成年心脏11以及其他组织11,44，但目前仍缺乏一套系统性的操作指南，以实现对该物种的表型鱼和洞穴鱼成体器官进行高效、可重复的解剖与取材。制定此类指南将为广泛使用该模型的研究群体带来显著益处，不仅提供标准化的器官采集流程，还可作为墨西哥盲鱼两种形态类型解剖学信息的一站式资源。基于上述原因，我们致力于开发并共享一套针对A. mexicanus成年个体的标准化器官解剖方案，特别考虑了在处理表型鱼和盲眼洞穴鱼样本时的操作要点，重点服务于后续实验流程的样本采集，包括全脑成像以及成年个体脑组织/肠道样本的宏基因组测序。

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披露

不存在利益冲突。所有操作均遵循 IACUC 批准的协议 2024-0004。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目5R16EY037336-02、RCMI资助项目U54 MD007600以及NIH资助项目1P20GM156713-01（波多黎各微生物组科学中心COBRE）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.0 升斑马鱼繁殖缸Tecniplasthttps://shop.tecniplastusa.com/products/1-0-liter-zebrafish-breeding-tank用于制备安乐死用冰浆。将繁殖缸半满填充冰块，然后将带孔的内缸置于其上，再加水至顶部。
4L 聚氨酯冰盘USA ScientificItem #2328-7242
生物危害废物袋Fisherbrand14-828-244
Calbiochem OmniPur PBS 10x 液体浓缩液，分子生物学级，无菌MilliporeSigma65074L
解剖显微镜 Olympus SZ51Olympus OLSZ51NPS-LED/R
解剖组织镊Fisherbrand08-953G
解剖针，100 支装Home Science toolshttps://www.homesciencetools.com/product/dissection-pins-100-pack/?srsltid=AfmBOoofk8r6_hd4nx_7bjjP2
GzkNBlnOJ3vUKor5
rFCJvVxPN9xRlpc
镊子，精细，超细尖头 MOPECAB132
组织镊，精细超细尖头MOPECAB047
止血钳，12.5 cm，直型World Precision instrumentshttps://wpiinc.com/products/var-15920-halsted-mosquito-hemostatic-forceps
珠宝匠镊，Dumont No. 5MilliporeSigmahttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f6521
Kimwipes EX-L 擦镜纸Kimberly-Clark34155
液氮由机构提供
Noyes 微型剪刀，12 cmWorld Precision instruments500228
纸巾由机构提供
带透明盖的培养皿，95 mm，15 mm，圆形FisherbrandFB0875714G
手术刀片，#22，10 片装Home Science Toolshttps://www.homesciencetools.com/product/scalpel-blades-22-10-pack/
手术刀柄 #4Surtexhttps://surtex-instruments.com/product/scalpel-handle-no-4/
虹膜解剖剪MOPECAA146
超细微型剪刀MOPECAA152
标准一次性移液管Thermo Scientific13-711-9D
无菌 Eppendorf 微量离心管 1.5 µLEppendorf05-402-25
Sylgard 184Electron Microscopy Sciences24236-10
保温瓶Lab-Line Instruments Inc.2119
超细剪刀NEWMED InstrumentsNM-DI-206023
适用于电泳和 PCR 的水Sigma-AldrichW4502-1L

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