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采用酶消化法与密度梯度分离法从Lewis大鼠中分离与纯化胰岛组织

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DOI：

10.3791/70414

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2026年4月3日

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1Center for BioNanoengineering, Houston Methodist Research Institute, 2School of Medicine and Health Sciences, Tecnologico de Monterrey, 3Department of Applied Science and Technology, Politecnico di Torino, 4Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Surgery, Houston Methodist Hospital, 6Department of Radiation Oncology, Houston Methodist Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种标准化的方法，用于Lewis大鼠胰岛的手术获取、酶消化及密度梯度纯化，可高效获得高纯度的胰岛，直接用于移植或后续实验研究。 体外 研究。

摘要

胰岛对于临床胰岛移植以及旨在阐明糖尿病机制和进展的临床前研究至关重要。然而，这些领域的进展常常受限于高质量胰岛的可获得性，因为新兴的治疗策略需要更大规模、更纯净且更标准化的胰岛制备物。本文介绍了一种高通量、标准化的实验方案，用于从Lewis大鼠中手术获取胰腺、酶消化及密度梯度纯化胰岛。该方法结合了导管内胰腺灌注、特定酶混合物、多个胰腺组织的合并消化以及基于密度的分离步骤，在最大化产量的同时减少胰岛碎片化，并消除了常规手工挑选的需要。胰岛产量通过两种互补方法进行定量：一种是在临床环境中常用的基于分样 aliquot 的传统计数法，另一种是半自动化的全样本成像定量法。在一次代表性实验中，从12个胰腺中分离得到的手动计数结果为每个胰腺约3,300个胰岛当量（IEQ）和2,700个绝对胰岛（总计约39,600 IEQ），其大小分布为：62%（50–100 µm）、17%（100–150 µm）、10%（150–200 µm）、5%（200–250 µm）和6%（>250 µm）。该标准化流程可提高实验可重复性，支持大规模研究，并为临床前模型提供稳定、高质量的胰岛来源。 关键词：胰岛分离，胰岛当量，密度梯度纯化，导管内灌注，酶消化，Lewis大鼠，糖尿病，胰岛移植>250 µm）。相比之下，全样本自动化分析报告的总IEQ为16,350（每胰腺1,362 IEQ），凸显了基于分样定量的固有变异性。通过二苯硫腙染色检测，样本纯度为98%，胰岛活力维持在98%。 体外 在分离后的第3天和第7天进行功能评估，通过静态葡萄糖刺激胰岛素分泌实验显示，在16.7 mM葡萄糖刺激1小时后，胰岛素释放量增加10倍。总体而言，该方案提供了一种可重复且高效的途径，用于制备高纯度、功能完整的胰岛，制备物可直接使用，无需额外纯化。胰岛在体外培养中可维持强劲功能长达七天，为大规模实验提供了操作灵活性 体外 检测以及 在体 移植研究

引言

胰岛移植是一种可行的策略，可恢复1型糖尿病（T1D）患者体内的内源性胰岛素生成1。除了T1D之外，胰岛生物学在2型糖尿病（T2D）中也日益重要；T2D的特征是β细胞功能进行性障碍和丧失，同时也适用于因慢性胰腺炎、胰腺肿瘤或外伤性损伤而接受部分或全胰腺切除术的患者。在这些情况下，获取高质量的胰岛对于推进细胞治疗、建立β细胞衰竭模型、研究胰岛-免疫及胰岛-间质相互作用，以及开发新兴的再生方法至关重要2。因此，稳定且可重复的胰岛分离流程对于支持多种胰腺内分泌疾病领域的机制研究和转化开发具有关键意义。

尽管胰岛仅占胰腺质量的不到2%，但其在葡萄糖稳态中发挥着远超其体积的重要作用。胰岛本身对缺氧、酶过度消化、氧化应激和机械剪切力具有高度敏感性，使其在分离过程中极易受到损伤3,4,5即使温度、氧合或组织处理存在细微偏差，也可能因β细胞抗氧化防御能力有限且代谢需求较高，而损害其刺激-分泌耦联功能或触发凋亡6,7因此，在临床和实验环境中，大多数常规方案均强调在收获后的24-48小时内尽快进行后续使用。8,9,10,11,12. 尽管如此 "即用型" 该框架虽能减少退化，但限制了实验的灵活性，阻碍了纵向研究，并增加了获取足够数量胰岛以用于大规模实验的难度 体外 检测或 体内 移植实验

在啮齿类动物模型中，由于Lewis大鼠具有近交系遗传背景、稳定的免疫特征以及可重复的生理特性，因此被广泛用于胰岛研究14。不同品系在胰岛产量、反应性及耐受性方面的差异已有充分记载。De Groot等人的研究表明，与其他品系相比，Lewis大鼠胰岛表现出更优的葡萄糖刺激性胰岛素分泌能力，突显其在功能、代谢及移植研究中的适用性15。其他研究也证实了其在免疫学及同种/异种移植研究中的可靠性14,15,16。然而，在不同实验室之间，胰岛产量、纯度和功能的变异性仍然是一个重大障碍。这种变异性很大程度上源于酶混合物、经导管灌注技术、胰腺处理、消化时间以及纯化策略的不一致17。

为解决这些局限性，我们开发了一种可重复的、分步操作的实验方案，用于从Lewis大鼠中进行胰岛的手术获取、酶消化及密度梯度纯化。该工作流程经过优化，旨在最大化胰岛产量、减少碎片化，并保持其功能活性。尤为重要的是，该方案确立了明确的评估标准，包括胰岛当量（IEQ）、随时间变化的活性、纯度以及葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力，使研究人员能够可靠地区分成功与不理想的胰岛分离结果18,19,20。通过提高胰岛产量和存活时间，该方案增强了实验的灵活性，并可能减少所需供体动物的数量，从而支持更符合伦理且可扩展的实验设计。

与许多传统方法不同，本方法表明，Lewis大鼠胰岛在体外培养中可维持长达7天，且保持良好的存活率和功能，从而扩展了其在长期in vitro研究中的应用价值。该方案进一步采用了一种简化的批量处理策略，单次可同时处理多达30个胰腺，实现统一消化，减少样本间差异。由于内分泌纯度可达98%，该方法无需耗时的手工挑选，同时降低了微生物污染的风险。与常产生不纯或机械完整性受损样本的单步法或整体消化法相比13，这一高通量工作流程能够稳定获得大量洁净、适合移植的胰岛，可用于in vitro检测、代谢谱分析以及in vivo移植研究。

方案

所有操作均经休斯敦卫理公会研究所动物护理和使用委员会（IACUC，方案编号 #IS00007362）批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》及《动物福利法》进行。
​注意：本方案中使用的所有材料和仪器均可在材料表中找到。

1. 收集与分离日前的准备工作

  1. 在生物安全柜内以无菌条件配制以下溶液（见表1），并将所有溶液于4 °C保存至使用前。
    青霉素-链霉素冲洗液（Pen-Strep）。
    洗涤培养基。
    淬灭缓冲液。
    胰岛培养基。
    克雷布斯缓冲液。
  2. 通过高压灭菌对工具和设备进行灭菌。
    1. 高压灭菌胰腺摘取手术包：手术单、纱布、鼠齿组织镊、平镊、精细弯头镊、一把皮肤剪、显微解剖剪、两个小型止血钳和一个弯头止血钳。
      ​注意：若将有两名手术操作者，则需高压灭菌两套胰腺摘取手术包。
    2. 高压灭菌胰腺清洗手术包：精细弯头镊和显微解剖剪。
    3. 高压灭菌一张30 cm × 30 cm的铝箔片。
    4. 根据待处理胰腺的数量，高压灭菌1–6个600 mL和1 L烧杯（见表2）。
    5. 高压灭菌一个500 µm筛网。
    6. 高压灭菌两根14 G脊髓穿刺针，以防其中一根被未消化的胰腺组织堵塞。
    7. 为每个所需的50 mL注射器高压灭菌一个注射器管（见表3）。
  3. 准备用于消化的水浴装置。
    1. 向配有轨道摇床的水浴锅中加入经高压灭菌的超纯水，直至水位高出平台3/4英寸。
    2. 加入3 mL抗菌溶液，并保持盖子关闭以尽量减少污染。

2. 收获与分离当天的准备工作

  1. 准备梯度注射器。
    1. 将之前配制并用于后续步骤及“胰岛纯化”步骤5.2中的胰岛梯度溶液1.108 g/cm³、1.096 g/cm³和1.069 g/cm³从4 °C冰箱中取出，室温平衡约1小时。
      ​注：所需梯度液体积取决于待处理胰腺的数量；请参考表3，确保所选梯度溶液有足够解冻体积。
    2. 预先装填并标记装有1.096 g/cm³和1.069 g/cm³梯度液的50 mL注射器。
      1. 剧烈混合1.069和1.096 g/cm³密度梯度溶液。
      2. 根据表3确定适当体积，将其装入配有手术软管和16 G针头的50 mL注射器中。
      3. 填充完成后，盖上针帽以保持无菌状态，并将注射器置于一旁，供后续“胰岛纯化”步骤5.5使用。
    3. 将1.108 g/cm3梯度液保持在室温下，待后续使用。
  2. 配制工作解离培养基（WDM）酶溶液，并分装至用于灌注的注射器和已灭菌烧杯中。
    1. 在生物安全柜内无菌操作，所有溶液均置于冰上保存。
    2. 将胶原酶、嗜热菌蛋白酶和DNase I分装样品置于冰上解冻。
    3. 在无菌的1 L烧杯中，使用WDM稀释酶试剂，使其终浓度分别为：胶原酶0.15 mg/mL、嗜热菌蛋白酶5 µg/mL、DNase I 0.1 mg/mL（见表2）。
    4. 轻轻旋转混合WDM溶液10次。切勿使用移液器混合；通过轻柔旋转以保护酶活性。
    5. 使用16 G针头快速将10 mL WDM酶溶液逐个装入10 mL注射器中，随后更换为带帽的25 G × ½英寸针头，用于后续胰腺灌注。
    6. 用已灭菌的铝箔包裹装填好的注射器，并置于冰上备用。
    7. 根据表2，将多余的WDM等量分装至无菌600 mL烧杯中，用于盛放收获的胰腺。每个烧杯用无菌铝箔覆盖，并置于冰上（见表2）。
  3. 准备细胞培养工作区。
    1. 开启轨道水浴摇床，设定转速为130 rpm，温度为37 °C。胰腺收获期间保持此状态。
    2. 将以下物品置于生物安全柜内紫外灯下照射1小时以进一步灭菌：
      无菌500 µm筛网。
      无菌1 L烧杯。
      注射泵。
    3. 确保细胞培养箱设定为25 °C、5% CO2。
    4. 将离心机预冷至4 °C，加速度和减速度均设为9。
  4. 收集胰腺收获所需材料，并前往手术室。
    1. 指定胰腺清洗人员：
      1. 准备一个大号冰桶，用于盛放所需数量的600 mL WDM烧杯及胰腺冲洗液（见表1和表2）。
      2. 每处理6个胰腺，准备1个无菌培养皿。
      3. 准备1把无菌显微解剖剪和2把小型弯头精细镊子。
    2. 指定胰腺收获人员：
      1. 准备一套无菌手术包。
      2. 准备无菌外科手套。
      3. 准备一个冰盒，内含已用灭菌铝箔密封的预装10 mL WDM注射器。
  5. 在手术室内，准备胰腺收获工作站。
    1. 开启玻璃珠灭菌器，每次动物操作之间将手术器械浸入灭菌器中1分钟进行灭菌。器械可通过浸入无菌1x PBS中快速冷却。
    2. 在显微镜视野下方放置吸水垫，以吸收可能滴落的血液或泄漏的WDM酶溶液。
    3. 调节显微镜，使目镜与物镜组合总放大倍数为6.3倍。
    4. 打开手术包，采用无菌技术佩戴无菌外科手套。
    5. 开始进行手术收获。
  6. 在手术室内，准备胰腺清洗工作站。
    1. 向100 mm培养皿中加入足量青霉素-链霉素溶液，使其填充约一半体积（约6 mL），用于浸没分离出的胰腺，并将培养皿置于冰上。
    2. 打开手术包，采用无菌技术佩戴无菌外科手套。
  7. 在手术室内，准备安乐死舱。
    1. 将储液托盘放入一个空的、清洁且可重新密封的大鼠笼中。
    2. 向托盘中注入约一半体积的异氟烷。
    3. 将带孔托盘置于储液托盘上方，防止大鼠放入时液体溢出。
    4. 用笼盖密封安乐死舱顶部。
  8. 开始进行胰腺收获。

3. 胰腺的收获

  1. 将大鼠逐只放入麻醉盘上方的安乐死舱内，通过快速过量吸入异氟烷实施安乐死。
    注意：大鼠所需的安乐死时间会有所变化，尤其是在异氟烷逐渐挥发的情况下。
  2. 确认每只大鼠均无脉搏和呼吸。
  3. 采用不干扰腹腔的二次确认方法验证安乐死效果（例如心脏穿刺）。
    注意：其他主要安乐死方法亦可接受；但优先推荐异氟烷过量法，因为快速安乐死可最大程度减少胰岛缺氧。
  4. 用70%乙醇喷洒每只大鼠腹部的毛发，使其贴服，防止手术区域出现松散毛发。
  5. 将已实施安乐死的大鼠仰卧置于显微镜下，头部远离操作者。确保上腹部位于显微镜视野范围内。

手术解剖图，用于教学目的的腹部结构定位及手术器械示意。
图 1：大鼠胰腺的手术暴露及经导管灌注。 胰腺暴露及经乏特壶腹（Sphincter of Oddi）进行灌注的关键步骤示意图。（A） 已处死的Lewis大鼠，腹腔已打开。（Aa） 胆总管和肝静脉的夹闭位置。（B） 十二指肠的放大视图，止血钳标记出乏特壶腹区域。（Bb） 灌注针置于主胰管内。请点击此处查看该图的高清版本。

  1. 取出胰腺（胰腺取出操作者角色）：
    1. 使用皮肤剪刀从耻骨联合处开始，向两侧肋骨方向做“V形”切口，以进入腹腔（见图1A）。
    2. 使用平头镊子将小肠和大肠向动物左侧推开，以清理腹腔“操作区域”。
    3. 使用平头镊子和弯止血钳展开十二指肠，确保胆总管和门静脉位于显微镜视野中。
    4. 将肝脏向头侧推开，并用弯止血钳夹住胆总管和肝静脉。夹闭位置应距离肝脏约1-2 mm（见图1Aa）。
      ​注意：步骤3.6.1–3.6.4和3.6.8可通过直接观察完成。其余所有步骤均需在显微镜下进行，以确保对精细组织的准确操作。
    5. 在显微镜下，使用平头镊子和平头止血钳，轻柔地移动十二指肠内容物，以清除奥狄括约肌区域。
      ​注意：确保十二指肠内容物已从预定的针头插入部位移开。
    6. 使用平头止血钳在奥狄括约肌两侧约5 mm处轻柔夹闭十二指肠，以隔离奥狄括约肌周围区域。注意施加最小压力，以保持组织完整性（见图1B）。
    7. 使用无菌WDM注射器，小心地将针头穿过十二指肠壁，经奥狄括约肌进入主胰管，以便进行灌注（见图1Bb）。
      1. 一旦针头穿过奥狄括约肌，立即以约500 μL/s的速度持续加压灌注7–10 mL WDM至胰腺，直至胰腺完全膨胀。
        ​注意：确保针尖斜面朝上，且针头方向与胰管平行，以尽量减少组织损伤。插入后应立即开始注射，这有助于扩张括约肌和胰管，便于针头推进。当位于脾脏附近的胰尾明显被灌注时，表明胰腺已完全膨胀。
    8. 按以下顺序轻柔解剖，将胰腺从周围结构中游离并切除：脾脏、胃、大肠、十二指肠和肠系膜。
      ​注意：使用钝性分离技术以最小化组织损伤。应按顺序操作，以保持解剖方位，并减少血管和导管连接处的张力。
      1. 从十二指肠上移除两个平头止血钳。
      2. 使用平头镊子夹住脾胰韧带（连接胰腺与脾脏），并施加轻柔牵引。
      3. 使用精细弯头解剖镊子，小心地游离并分离胰腺与邻近脾脏的附着组织。
      4. 用精细弯头镊子提起胰腺组织，同时用平头镊子施加轻柔反向牵引，将胰腺从胃部分离。
      5. 然后使用平头镊子施加稳固牵引力，将大肠从胰腺上撕脱分离。
      6. 用平头镊子提起小肠，并使用精细弯头镊子将肠系膜从胰腺上解剖分离。
      7. 用平头镊子轻柔提起已灌注的胰腺，使用精细解剖剪刀切断胰腺与结缔组织之间任何残留的连接。
    9. 立即将切除的胰腺转移至含有冰冻冲洗液的培养皿中，并立即开始下一个胰腺的取出操作，此时胰腺清洗操作者应同步开始胰腺清洗。
  2. 清洗胰腺（胰腺清洗操作者角色）：

脂肪组织、血管和淋巴结组织解剖示意图；采用颜色编码以识别不同组织。
图2：灌注后大鼠胰腺的清理。胰腺在去除非必需组织前后的逐步示意图。（A）解剖后立即获得的灌注胰腺，可见邻近的脂肪组织、淋巴结和结缔结构。（B）带有主要解剖标志标注的灌注胰腺。（C）去除多余组织后的清洁胰腺，显示消化前的最终形态。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用精细的弯镊和精细解剖剪，小心地从灌注过的胰腺上剪除淋巴结、脂肪组织、肠系膜以及大血管（如存在，请参见图2）。
  2. 将清理后的胰腺转移至一个无菌的600 mL烧杯中，烧杯内含25 mL冷WDM。用无菌铝箔覆盖烧杯，以在从手术操作区转移到细胞培养操作区的过程中保持无菌状态。
    1. 每处理6个胰腺后更换一次培养皿中的冲洗液，以防止污染。
    2. 记录第一个胰腺置于冰上时的时间，该时间将用于记录冷缺血时间。
  1. 获取并清洗完所有胰腺后，应立即在细胞培养工作区进行消化步骤。

4. 胰腺消化

  1. 暂停轨道摇床的转动，将装有胰腺的带盖烧杯固定到水浴装置的指定支架中。
  2. 迅速重新启动设定为130 rpm的轨道摇床，并开始计时10分钟以进行消化（见图3A）。
    注意：将此时间点记录为冷缺血期的结束。在实验室记录中登记每次胰岛收获及其相应的总冷缺血时间。
  3. 在第5分钟时，手动顺时针方向旋转烧杯，再逆时针旋转，以促进组织解离。
  4. 在第8分钟时，从冷藏处取出终止液，并转移至生物安全柜中，以备立即使用（见表1）。
  5. 在第10分钟时，迅速将烧杯转移并浸入冰中，以减缓酶活性（见图3B）。
    注意：从此步骤起，所有组织、细胞和溶液均需在冰上操作，以保持其活性，直至步骤4.20使用室温密度梯度时为止。
  6. 将烧杯外壁及托盘转移至生物安全柜内。
  7. 按1:1比例向烧杯中的溶液加入终止缓冲液，以停止消化反应（每烧杯约75–100 mL）。
  8. 使用配备14 G脊髓穿刺针的50 mL注射器，轻柔且反复地抽吸和排出组织悬液，以解离较大的组织碎片（见图3C）。
  9. 将悬液转移至200 mL锥形管中。
  10. 用5 mL洗涤液冲洗烧杯，并将冲洗液倾入含有胰岛消化物的200 mL锥形管中，以收集残留的消化物。
  11. 在4 °C条件下，以200 × g离心5分钟。确保使用适当的离心瓶适配器和缓冲垫以保证安全。
  12. 小心倾去上清液，并用之前相同的14 G脊髓穿刺针将沉淀重悬于100 mL洗涤液中。
  13. 将悬液通过置于无菌600 mL烧杯上的无菌500 µm筛网过滤，以去除任何未消化的大块组织。
    注意：若胰腺灌注和清洗操作得当，则筛网上残留的脂肪组织极少，且无未灌注的胰腺组织。
  14. 用10 mL洗涤液冲洗筛网，以回收截留的组织。
  15. 将滤液转移至新的200 mL锥形管中。
  16. 在4 °C条件下，以200 × g离心5分钟。
  17. 倾去上清液，并使用10 mL移液管将沉淀重悬于100 mL洗涤液中。
    注意：为尽量减少细胞损失，应在接触胰岛前用含FBS的缓冲液预润湿移液管头。
  18. 在4 °C条件下，以600 × g 离心5分钟。
  19. 小心吸走上清液，获得干燥的沉淀。
  20. 将离心机温度设定为22 °C，为后续梯度分离做准备。
    注意：可通过在无样品条件下以2000 × g运行15分钟来加快升温过程。

5. 胰岛纯化

  1. 参考表3确定所需50 mL锥形管的数量。
    注意：参考表3将总沉淀物体积均匀分配，确保每个梯度管中分装约2–3 mL的组织消化沉淀物。若后续观察到胰岛条带分离较弱，可使用额外的梯度管以提高分离分辨率。
  2. 使用密度为1.108 g/cm³的梯度溶液预润湿一支10 mL血清移液管尖端，防止胰岛黏附于尖端内壁。
  3. 根据每2 mL沉淀物体积加入15 mL的1.108 g/cm³梯度溶液，使用已预润湿的10 mL血清移液管重悬各组织沉淀物。尽管总体积超过10 mL，但较小口径的移液管有助于更精确地混匀并有效解离沉淀物。轻柔混匀至悬液均匀。
  4. 小心将15 mL细胞悬液沿每支50 mL锥形管底部缓慢加入，避免接触管壁，以确保形成清晰的梯度层。
  5. 使用预装好的梯度注射器，依次叠加10 mL密度为1.096 g/cm³的梯度溶液，随后叠加10 mL密度为1.069 g/cm³的梯度溶液。
  6. 使用注射泵以5 mL/min的速度逐层加入各梯度溶液，将16 G针头尖端紧贴管内壁，防止梯度混合。
  7. 在22 °C条件下以700 × g离心15分钟，离心机加速度设为3，减速度设为0，以防止梯度混合。
    注意：由于减速度时间较长，整个离心过程约需45分钟。需密切监控时间，因胰岛必须及时收集，以防梯度混合及潜在的细胞损伤。如有需要，应按重量（而非体积）配平对侧平衡管，以补偿密度差异。取出离心管后，将离心机温度重置为4 °C，并将加速度和减速度均设为9，以备后续步骤使用。
  8. 离心后，识别位于1.069–1.096 g/cm³与1.096–1.108 g/cm³梯度层之间的界面处的胰岛层（见图3D）。
  9. 使用经洗涤液预润湿的巴斯德移液管，小心吸除并弃去顶层收集到的任何组织。
  10. 润湿另一支巴斯德移液管，收集胰岛层，并转移至预先冷却的含有5 mL洗涤液的200 mL锥形管中。
  11. 用洗涤液将预先冷却的200 mL锥形管体积补至200 mL。
  12. 以600 × g离心5分钟，倾去上清液。
  13. 使用预润湿的10 mL血清移液管尖端，将沉淀物重悬于30 mL洗涤液中。
  14. 使用预润湿的10 mL血清移液管将重悬液转移至新的50 mL锥形管中，以利于胰岛更好地沉淀。
  15. 用20 mL洗涤液冲洗同一支200 mL锥形管，并将冲洗液转移至含有剩余胰岛的50 mL锥形管中。
  16. 在4 °C条件下，以300 × g将含胰岛和洗涤液的50 mL锥形管离心5分钟。
  17. 倾去上清液，并将胰岛沉淀物重悬于50 mL胰岛培养基中（见表1）。
    ​注意：若采用手动定量法计数胰岛，可在本步骤中取100 μL等分试样。
  18. 将胰岛均匀铺种至未经组织培养处理的100 mm培养皿中，每处理五只Lewis大鼠胰腺使用一个培养皿。
    1. 根据公式（胰腺数量 ÷ 5 × 10 mL）计算所需总胰岛培养基体积。
    2. 将胰岛沉淀物重悬于计算所得培养基体积的一半中，然后将悬液均匀分配至确定数量的培养皿中。
    3. 用剩余一半的计算培养基冲洗含有残留胰岛的50 mL锥形管，并将冲洗液加至相同培养皿中，使每皿终体积达到10 mL（见图3E）。
  19. 在5% CO₂环境中25 °C下过夜孵育。每隔24小时，沿每个培养皿侧壁加入3 mL胰岛培养基，然后轻轻旋转混匀以更新培养液。
  20. 进入胰岛计数步骤（步骤6）。

胰腺细胞分离过程；消化前/后、离心、显微镜观察；实验研究。
图3：胰腺消化及分离胰岛的纯化。 从胰腺混合消化到胰岛纯化的各个连续步骤的代表性图像。(A) 酶消化前的灌注后混合胰腺组织。(B) 酶消化后的胰腺碎片。(C) 机械处理后的均匀组织悬液。(D) 密度梯度离心管在离心前（左）和离心后（右），梯度界面处可见胰岛层带，已用圆圈标出。(E) 收集后第0天胰岛的明场图像。 请点击此处查看该图的放大版本。

6. 胰岛计数

  1. 进行人工胰岛定量。
    1. 在步骤 5.16 中，使用 200 μL 移液器和普通的 200 μL 吸头，从胰岛悬液中吸取三份 100 µL 的等分试样。
      ​注意：取样测量时，应通过移液混匀确保胰岛在培养基中均匀悬浮。
    2. 将每份等分试样分别转移至含有 1 mL 1× PBS 的 2 mm × 2 mm 带网格的培养皿中。
    3. 在倒置显微镜下计数胰岛，并使用目镜测微尺插片按直径对胰岛进行分类记录。
      ​注意：并非所有胰岛均为圆形；计数过程中应统一采用水平或垂直方向的测量值。
    4. 使用标准换算表计算 150 µm 胰岛当量（IEQ）的总数（见表 4）。
      注意：比较各样本的 IEQ。若各等分试样的 IEQ 差异超过 30%，则采用最接近的等分试样数值的平均值。

7. 安全注意事项

  1. 在适当情况下，所有外科手术和组织操作均应在生物安全柜内的无菌条件下进行。操作试剂和组织时，全程使用个人防护装备（PPE），包括护目镜、实验服、手套和外科口罩。
  2. 在无菌条件下使用适当的外科器械和个人防护装备进行胰腺采集。按照机构指南操作异氟烷及其他麻醉剂，以防止吸入暴露。
  3. 按照机构生物安全规程处置动物组织、锐器和生物危害废物。除非另有说明，酶试剂和生物材料应保持在冰上，以维持其活性和生物活性。

结果

以下结果代表采用所述方法进行的一次典型胰岛分离实验，共并行处理了十二个Lewis大鼠的胰腺。

产量与尺寸分布

手动分装计数与IEQ转换

按照“胰岛计数”部分第6.1步所述，从混合的胰岛悬液中分别取两份独立的100 µL等分试样，并按直径范围（50–100 µm、100–150 µm、150–200 µm、200–250 µm、250–300 µm、250–300 µm）进行计数。根据标准当量表将计数结果转换为胰岛当量（IEQ；以150 µm为参考），并推算至整个悬液总体积（见图4A）。在本次测试分离实验中（n = 12），每胰腺获得3330 IEQ，中位胰岛直径位于50–100 µm范围内。重复等分试样的计数结果在各直径区间内的一致性为18.8%（变异系数），表明虽存在中等程度变异，但在采用人工计数方法时属预期范围。在此前进行的14次胰岛分离实验中，该方法平均每胰腺获得1353 IEQ（标准差607）。

全自动整板定量分析

为评估手动IEQ的基准，使用显微镜在D1采集明场图像，并进行拼接以生成全皿复合图像（4×物镜；曝光时间1/100秒）。采用Fiji软件及自定义代码进行自动尺寸测量与对象定量，设定预定义的尺寸阈值为50–600 µm。首先对图像进行预处理，以减少背景波动并增强对比度均匀性。根据胰岛结构与周围组织之间的强度差异识别胰岛，生成二值化对象掩膜。对相邻或部分接触的胰岛进行分离，以避免对象数量低估。排除指定尺寸范围以外的对象，以去除碎片和非胰岛组织。针对每个保留的对象，提取包括面积以及x轴和y轴直径在内的形态计量参数。随后按直径对胰岛进行分组，并将每组尺寸区间内的胰岛数量乘以相应的转换系数，计算IEQ。自动尺寸分析共检测到98,832个对象，其平均x轴和y轴直径分别为117 µm和116 µm，估算总IEQ为16,350，与D0时手动测量的IEQ具有高度相关性（Spearman r = 0.937，p = 0.0048；见图4A-C）。

胰岛细胞脱落

在纯化后2小时以及第1天（D1）使用“自动化全板定量”中的相同方法获取全板图像，以评估早期胰岛稳定情况（“脱落”现象）。从2小时到D1，目标物计数变化了0.9%，胰岛当量（IEQ）变化了-6.11%（见图4D）。对D0与D1胰岛直径的配对比较显示，中位数显著减少了2 µm（Wilcoxon符号秩检验，p = 0.0136，n = 2820）。然而，这一变化幅度较小，不太具有生物学或临床意义。

胰岛大小分析；手动与自动分布的柱状图及Spearman相关性图。
图 4：胰岛大小分布、相关性及早期脱落的定量评估。 通过手动和自动分析获得的胰岛测量结果的图示总结。(A) 基于标准化胰岛当量（IEQ）大小区间的手动定量结果得到的第0天（D0）胰岛大小分布。(B) 通过相同标准化IEQ大小区间的自动图像测量确定的第1天（D1）胰岛大小分布。(C) 手动D0与自动D1在IEQ大小区间内计数的相关性。(D) 同一培养板在D0与D1之间胰岛直径分布的自动测量箱线图。请点击此处查看该图的高清版本。

纯度（内分泌与外分泌成分）

二苯硫卡腙（DTZ）染色

在第1天（D1），取一份胰岛样品（n = 451）在室温下用DTZ染色30秒，并立即使用明场显微镜成像（4×物镜；曝光时间1/20秒）。在Fiji软件中去除背景像素，使剩余的像素面积对应于胰岛的总面积。通过较深的颜色对比识别出DTZ阴性的外分泌组织区域，使用套索工具手动选择这些区域，每个感兴趣区域的面积自动以像素为单位记录。内分泌纯度计算为DTZ阳性像素占胰岛总像素的百分比，结果纯度为98.56 ± 0.38%（图5A）。

存活率与功能表现

葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）

在每个时间点（第1天、第3天、第7天），手工挑选15个大小匹配的胰岛，分别放入已准备好的四份24孔板中的各个孔内。胰岛在Krebs缓冲液中于37 °C、5% CO2条件下孵育，并采用低-高-低葡萄糖刺激方案：首先在低葡萄糖浓度（2.8 mM，60分钟）下孵育，随后在高葡萄糖浓度（16.7 mM，60分钟，见表1）下孵育。在每次孵育结束时收集流出液组分，并使用大鼠胰岛素ELISA试剂盒测定胰岛素浓度。刺激指数定义为高葡萄糖条件下胰岛素分泌量与低葡萄糖条件下的比值。第1天、第3天和第7天的刺激指数分别为9.37、8.34和6.7，组间差异无统计学意义（图5B）。

活/死染色

在第1天、第3天和第7天，手工挑选15个胰岛，并根据制造商说明书使用活/死细胞活力检测试剂盒进行染色。简言之，胰岛在活/死染色液中于25 °C孵育30分钟，随后在一致的显微镜设置下成像，以确保各时间点之间的可比性（4倍物镜；曝光时间1/30秒，Texas Red和GFP滤光片）。采用基于Python的脚本，利用scikit-image进行胰岛分割和荧光强度测量，以量化活力。通过合并绿色和红色荧光通道，应用Li阈值法生成二值掩膜，并使用分水岭分割法分离相互接触的胰岛。通过面积对目标进行筛选，以排除碎片和伪影。对于每个胰岛，活力定义为活细胞积分密度（绿色像素）占总积分密度（绿色加红色像素）的百分比。结果显示，第1天活力为68 ± 9%，第3天为98.2 ± 0.6%，第7天为100%。经70%乙醇处理10分钟的阳性对照样本活力为2.7 ± 7.2%（见图5C-F）。

细胞形态学研究；显微镜图像；GSIS柱状图；D1-D7荧光分析，PS检测结果。
图5：胰岛纯度、活力及功能反应性的评估。 随时间变化的分离胰岛特征的代表性图像与定量汇总。(A) 使用二氮杂菲（DTZ）染色的胰岛代表性10×明场图像，显示红色染色的内分泌胰岛和未染色的外分泌组织。(B) 第1、3、7天高糖/低糖（HG/LG）刺激指数的葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）数值。(C-E) 第1天(C)、第3天(D)和第7天(E)胰岛的活/死荧光图像。(F) 经乙醇处理的阳性对照胰岛的活/死荧光图像。请点击此处查看该图的放大版本。

(A) 洗涤培养基
组分终浓度用量 (mL)
RPMI 1640-500 mL
胎牛血清10%50 mL
青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)1%5.5 mL
HEPES25 mM12.5 mL（来自1 M储备液）
L-谷氨酰胺2 mM5 mL（来自200 mM储备液）
(B) 胰岛培养基
组分终浓度用量 (mL 或 g)
RPMI 1640，无葡萄糖-500 mL
胎牛血清10%50 mL
青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)1%5.5 mL
HEPES20 mM11 mL（来自1 M储备液）
丙酮酸钠1 mM5.5 mL（来自100 mM储备液）
葡萄糖5.5 mM2.75 mL（来自200 g/L储备液）
(C) 青霉素-链霉素冲洗液
组分终浓度用量 (mL 或 g)
生理盐水溶液，0.9%-500 mL
青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)2%10 mL
(D) 终止缓冲液
组分终浓度用量 (mL 或 g)
HBSS -500 mL
胎牛血清20%100 mL
HEPES (1 M)2.50%2.5 mL
(E) 克雷布斯缓冲液
组分终浓度用量 (mL 或 g)
dH2O-975 mL
NaCl115 mM6.72 g
NaHCO324 mM2.02 g
KCl5 mM0.3728 g
HEPES (1 M)25 mM25 mL
MgCl21 mM0.0952 g
BSA0.10%1 g
CaCl22.5 mM0.2775 g

表1：溶液列表。 胰岛分离与纯化方案中所用全部溶液的组成及配制详情。每个小节列出了各溶液的组分、终浓度、配制体积和目录编号。A) 用于消化和纯化过程中冲洗和洗涤组织的洗涤液。B) 胰岛培养基，用于胰岛分离后的维持与活性保持。C) 青霉素-链霉素冲洗液，用于灭菌和冲洗收获的胰腺。D) 淬灭缓冲液，用于终止酶消化反应并维持细胞活力。E用于葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）实验的克雷布斯缓冲液。

胰腺数量胶原酶（15.38 mg/mL）嗜热菌蛋白酶（1 mg/mL）DNA酶（100 mg/mL）工作缓冲液使用的600 mL烧杯数量每烧杯体积
304.5 mL2.25 mL450 µL450 mL525 mL
243.6 mL1.8 mL360 µL360 mL425 mL
203 mL1.5 mL300 µL300 mL325 mL
162.4 mL1.2 mL240 µL240 mL225 mL
121.8 mL0.9 mL180 µL180 mL225 mL
101.5 mL0.75 mL150 µL150 mL225 mL
终浓度0.15 mg/mL5 mg/mL0.1 mg/mL

表2：根据胰腺数量配制的消化酶溶液。 针对不同数量的大鼠胰腺，制备工作解离液（WDM）所需的胶原酶、嗜热菌蛋白酶和DNase I体积。每种酶的最终浓度列于表格底部。

胰腺数量50 mL 离心管数量每支注射器体积1.096 型注射器数量1.068 型注射器数量
3010 支50 mL22
248 支40 mL22
206 支30 mL22
164 支40 mL11
124 支40 mL11
102 支20 mL11

表3：根据胰腺数量进行的梯度加载。 根据处理的胰腺数量，用于胰岛纯化的50 mL锥形管数量及相应的梯度液用量。

胰岛直径     范围 (µm)胰岛颗粒     数量 (AI)IEQ 转换系数每范围 IEQ 数
50-100a* 0.167a * 0.167
101-150b* 0.648b * 0.648
151-200c* 1.685c * 1.685
201-250d* 3.500d * 3.500
251-300e* 6.315e * 6.315
301-350f* 10.352f * 10.352
> 350g* 15.833g * 15.833

表4：胰岛当量换算。 将胰岛直径范围转换为标准化的胰岛当量（IEQ）。该表格列出了观察到的胰岛直径区间、每个区间内的胰岛颗粒数量、各尺寸区间的相应IEQ换算系数，以及每个区间对应的IEQ贡献值。

讨论

本方案概述了一种从Lewis大鼠中分离和纯化胰岛的高通量方法。该方法的成功依赖于若干关键步骤，这些步骤共同维持胰岛的完整性和功能。其中主要包括胰腺的精确且完整的导管内灌注、灌注后胰腺的仔细清洗，以及准确的酶消化时间。稳定且完整的全器官灌注对于实现胰腺的均匀膨胀至关重要，并可确保胶原酶-嗜热菌蛋白酶-DNase混合物的均匀分布，这三种酶分别用于消化细胞外基质、增强酶的渗透性，以及降低DNA介导的黏度21,22。灌注不足会导致组织消化不完全，并造成大量胰岛丢失，因为未充分消化的组织会在筛网过滤时被去除。同样，在消化前未能充分去除脂肪或血管组织，可能引入非内分泌杂质，从而降低纯度。此外，消化时间过长会导致细胞外基质过度降解，引起胰岛解聚；而消化不足则会产生对脊髓针机械消化具有抗性的未消化组织。上述步骤是实验中最常见的技术难点，在培训和优化过程中应予以严密监控。

尽管该方法是专为Lewis大鼠设计的，但通过略微重新优化消化时间与酶的比例，很可能可将其适用于其他品系或物种23,24,25,26。某些实验室可根据所用酶批次或组织特性的具体情况，选择调整工作解离液（WDM）中胶原酶、嗜热菌蛋白酶和DNase I的比例，以优化收获率。为此，实验室应严格遵循生产商提供的酶与组织优化分步指南，并在所有情况下避免添加0.1 M EDTA、半胱氨酸、巯基乙醇、蛋白酶抑制剂、血清或白蛋白等成分，因为这些物质可能抑制胶原酶、嗜热菌蛋白酶和DNase I的酶活性27。尽管目前尚未发表酶混合液在解离前的确切有效作用时间，但已有数据表明，胰腺长时间低温保存会不利地影响胰岛的产量和功能28。根据经验，我们发现，在本方案中，当总冷缺血时间（定义为将第一个胰腺置于冰上清洗至转移至37 °C水浴的时间间隔）控制在1.5小时以内时， consistently 能够成功分离胰岛。该参数的进一步优化可能需根据最终应用需求而定。

尽管该方案具有较强的稳健性，但仍存在若干实际和技术上的局限性。首先，酶混合物（胶原酶、嗜热菌蛋白酶和DNase I）以及密度梯度对于实现高效的组织解离和胰岛分离至关重要，但其成本较高。我们选择该酶组合是基于胰腺细胞外基质的结构特征，并需在有效解离组织与维持胰岛完整性之间取得平衡。每种酶组分均发挥特定作用：胶原酶靶向纤维状胶原和基底膜胶原，以释放胰岛；嗜热菌蛋白酶作为一种中性蛋白酶，可切割非胶原基质蛋白和细胞间黏附分子，从而减少对胶原酶暴露的需求；DNase I则可降低因细胞裂解释放DNA所导致的黏稠度29,30,31。尽管市面上已有成本较低的消化酶制剂，但其纯度不稳定，可能影响酶活性13,23。由于胶原酶来源于细菌培养，额外的纯化步骤虽可降低内毒素污染，但会显著增加成本13,23。

对于胶原酶，我们推荐使用每瓶活性约为 2,000 至 4,000 Wünsch 单位的制剂，可在中等剂量下实现有效解离，同时避免消化时间过长。值得注意的是，该酶混合物应包含适当比例的胶原酶 I 型与 II 型，即胶原酶 II / 总胶原酶的比例约为 0.3–0.5。此比例可提供较强的胶原蛋白水解活性，同时限制对非胶原性细胞外基质的过度降解。此外，胶原酶混合物还应含有适量的中性蛋白酶活性（约 150,000–250,000 单位）以及 DNase，原因前文已述。

从质量控制的角度来看，每批酶应提供相关文件，证明其内毒素含量低（≤50 EU/mg 蛋白质）、酶纯度高（通过 HPLC 测定 ≥85%），并经过批次间活性验证，因为不同生产商的酶纯度和组分可能存在显著差异。最后，批次间组分的差异可能影响消化的一致性和胰岛得率，因此必须对每批酶进行内部特异性验证。该验证可通过遵循本方案中所述的标准消化条件，随后评估消化效率和胰岛形态来完成。酶性能不佳的指标包括组织解离不完全、胰岛边界不规则或粗糙，或需要过度机械剪切才能实现分离；在此情况下，可能需要对消化时间进行滴定优化。

密度梯度的选择也需考虑类似因素。我们选用了一种基于多聚蔗糖的梯度介质，这是一种非离子型、高度亲水的蔗糖-表氯醇共聚物，可形成最高达1.2 g/mL的稳定梯度，并在胰岛分离中具有长期应用历史32,33。碘克沙醇是一种经过充分验证的替代方案，针对人胰岛的研究表明，基于碘克沙醇的梯度可提高胰岛回收率，同时维持其活力与功能34,35,36,37。然而，在啮齿类动物中的研究结果尚不一致，部分研究报道使用碘克沙醇效果更优，而其他研究则显示基于多聚蔗糖的梯度在活力和功能方面表现更佳32,35。关键的是，建议使用商业化生产且经过质量控制的梯度溶液，以提高不同实验室之间的可重复性。基于多聚蔗糖的梯度介质已有市售产品，其密度适用于胰岛分离；而碘克沙醇梯度通常需实验室自行稀释配制，可能引入额外的变异性。第二个局限性在于，手术取材需要较高的技术水平，特别是经欧氏括约肌进行导管内灌注以及快速切除胰腺的操作。即使轻微的延迟或操作偏差也可能导致组织损伤、泄漏、灌注不均或延长的热缺血时间，从而影响胰岛的产量和活力。为减轻这一局限性，本方案包含了详细的步骤描述，并配有原创的彩色解剖标志图示，以帮助理解。建议新操作者在开展完整分离操作前，先熟练掌握灌注技术，并建议在实际活体取材前先在尸体标本上进行练习。

第三，为了实现最高效率，本方案需要协调的团队合作。在胰腺采集和酶消化过程中，通常需要三名经过培训的操作人员：一人进行无菌手术，一人在无菌条件下清理胰腺，另一人则在非无菌条件下负责动物的循环与安乐死。完成消化后，一旦操作熟练，后续的纯化步骤通常可由较少的操作人员完成。尽管这种协调工作在初期存在一定的后勤要求，但它能够在相对较短的时间内从多只动物中分离出大量胰岛，相较于协调性较差的工作流程，整体通量更高。尽管本方案在技术上要求较高且资源消耗较大，但这些局限性在所有胰岛分离方法中均普遍存在。通过强调标准化的消化条件、系统化的培训以及协调一致的操作，这种高通量方法可在训练有素的团队执行时，降低每次分离所需的时间和劳动投入，并获得稳定、可重复的结果。

与传统的啮齿类胰岛分离方案相比，该方法在通量、可重复性和一致性方面具有显著优势。传统的单器官消化方法严重依赖手工挑选，且常导致纯度不稳定13相比之下，我们的方案采用混合消化和密度梯度纯化方法，显著缩短了制备时间，降低了样本间差异，同时保持了胰岛的高存活率和功能响应性。分离得到的胰岛通过形态学（二苯硫腙染色）、存活率（活/死细胞检测）和功能（葡萄糖刺激的胰岛素分泌）进行了全面表征，验证了该方法的可靠性。总体而言，这一标准化操作流程能够制备出数量充足、纯度高且功能完整的胰岛，适用于后续多种应用，包括包封、移植和微生理系统建模38,39,40重要的是， 采用该技术分离的Lewis大鼠胰岛已在临床前模型中逆转糖尿病，凸显了这种可重复且可扩展方法的转化应用价值41.

披露

A.G. 是 Continuity Biosciences, LLC 的联合创始人兼首席科学顾问。A.G.、J.P-M. 和 C.Y.X.C. 是由 Continuity Biosciences, LLC 获得许可的知识产权的发明人。其他所有作者声明无竞争利益。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R01DK133610-01（A.G.，N.K.）和 NIH NIDDK R01DK132104（A.G.）、Breakthrough T1D SRA-2021-1078-S-B（A.G.）及 SRA-2022-1224-S-B（A.G.，N.K.），以及 Vivian L. Smith 基金会资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
21 G x 2 英寸 BD PrecisionGlide 针头BD305129
500 µm 黄铜框架，304 不锈钢筛网，直径 3"，深度 1"（筛号 35）McMaster-Carr34735K525
Air-Tite 无菌注射器，鲁尔锁头Fisher Scientific14-817-178
Biogel PI UltraTouch MMölnlycke42665
邦氏剪刀；直型；尖头；刀刃长度 15 mm；总长 3 1/2"RobozRS-5840
Braintree Scientific GERMINATOR 500 DRY STERILFisher ScientificNC9956482
Cell-IQ 系列 5.8 立方英尺 CO2 实验室培养箱PHCBIMCO-170AICUVHL-PA
Corning 100 mm 未经组织培养处理的培养皿Corning430591
Corning 胎牛血清，500 mL，常规型，经 USDA 安全检测（热灭活）Corning35011CV
Corning 胰岛分离梯度液 1.069（密度 1.069 g/cm3）Corning99-815-CIS需向公司特别申请
Corning 胰岛分离梯度液 1.096（密度 1.096 g/cm3）Corning99-691-CIS需向公司特别申请
Corning 胰岛分离梯度液 1.108（密度 1.108 g/cm3）Corning99-692-CIS需向公司特别申请
Covidien Tendersorb 吸水垫Fisher Scientific22-225-102
DNase I，II 型Roche10104159001
Falcon 50 mL 高透明度锥形离心管Fisher Scientific14-432-22
Fisherbrand 铝箔，标准厚度卷装Fisher Scientific01-213-100
Fisherbrand 无纺纱布海绵Fisher Scientific22-028-559
Fisherbrand 可重复使用玻璃重型低型烧杯Fisher ScientificFB101600
荧光显微镜  BZ-X810KeyenceBZ-X810
葡萄糖溶液GibcoA2494001
Halsey 微型持针器Fine Science Tools12500-12
HBSS，含钙、镁，不含酚红Gibco14025092
HEPES（1 M）Gibco15630080
止血钳，经典 Crile 型，长度 5-1/2 英寸McKesson1231217
Hudson（Ewald）持针钳RobozRS-5238
皮下注射针头，Monoject，长度 1-1/2 英寸，16 号，普通壁，无安全装置McKesson43481
L-谷氨酰胺（200 mM）Gibco25030081
Liberase T-Flex，研究级Roche5989132001
LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒，适用于哺乳动物细胞Invitrogen L3224
MATLAB 软件包MathWorkshttps://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML
NE-4000 双通道可编程注射泵SyringePumpNE-4000-US
针头，皮下注射，一次性使用，27G×1/2"（100/盒），EXLINTMcKesson408877
Nunc 细胞培养/培养皿Thermo-Scientific174926
Olympus CKX41 倒置相差显微镜OlympusCKX41-B
PBS，pH 7.4Gibco10010023
青霉素‚ 链霉素（10,000 U/mL）Gibco15140122
RPMI 1640Gibco11875093
RPMI 1640，无葡萄糖Gibco11879020
丙酮酸钠（100 mM）Gibco11360070
丙酮酸钠（100 mM 储存液）Gibco11360070
Sorval ST 16RThermo-Scientific75004381
304 不锈钢注射器针头Milipore SigmaZ117013-1EA
手术单，一次性使用，36 英寸 × 100 码Covetrus10408
手术剪刀 - ToughCutFine Science Tools14054-13
拇指式持物钳，4.5"，带齿，精细型，尖端宽度 1.3 mmRobozRS-8120
Thermo Scientific Nunc 200 mL 离心管Thermo-Scientific14-962-17
Thermo Scientific Nunc 离心瓶适配器和缓冲垫Thermo-Scientific12-565-283B
TSDUB15 15L Dubnoff 摇床水浴箱Fisher Scientific300610298
TX-400 4 × 400 mL 摆动桶转子Thermo-Scientific75003181
Tygon S-50-HLTygonAAXoooo3
超敏大鼠胰岛素 ELISA 试剂盒Crystal Chem90060

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