使用流式细胞术不同门控策略的精子DNA分析结果比较

Summary

多边形门控法（PGG）和十字形门控法（CFG）是用于检测精子DNA完整性的流式细胞术方法。PGG测量DNA碎片指数（DFI）和高DNA染色指数（HDS）。CFG报告严重的DFI、轻度DFI和总体DFI。本研究旨在比较它们之间的结果和相关性。

Abstract

精子DNA完整性是确保成功受精、胚胎发育和持续妊娠的关键因素。通过流式细胞术在DNA变性和吖啶橙染色后对精子染色质结构进行评估（SCSA）被认为是评估精子DNA的金标准方法。文献中已经报道了两种基于流式细胞术的精子DNA片段化指数（DFI）评估策略：多边形分门（PGG）和十字形分门（CFG）。本研究的目的是比较PGG和CFG之间的测定结果关系，并分析它们与基础精液分析参数的相关性。使用统计分析，包括Bland-Altman图和回归分析，比较了由两种方法独立获得的数据。通过完全随机抽样方法，选择了在我院生殖中心接受生育能力评估的121名男性门诊患者。分别使用PGG和CFG通过流式细胞术检测精子DFI和相关指标。结果表明，两种方法获得的DFI值显示良好的一致性。PGG方法的DFIp与CFG方法的DFIm、DFIs和DFIc之间的相关系数分别为0.6497、0.9404和0.9667（所有p < 0.01）。高DNA染色指数（HDS）与DFIs呈现轻微负相关（r = -0.3042，p < 0.05）。畅通性运动精子的百分比与DFIp、DFIs和DFIc呈负相关（r = -0.3824、-0.3794、-0.3574，所有p < 0.05）。HDS与精液体积、精子浓度、总精子计数或PR（%）之间没有观察到显著相关性。这些发现表明，DFIs与男性生育能力更密切相关，这表明提供该参数的CFG方法可能更适合于临床评估精子DNA损伤。

Introduction

精子DNA完整性指的是精子核内DNA分子结构的完整性和功能稳定性。具体来说，它的特征是正常的染色质构型、完整的碱基序列，无断裂或氧化损伤，以及准确传递遗传信息给后代的能力。在精子发生过程中，当氧化应激增加¹，染色质重塑异常²，或精子受到环境毒素影响³时，精子DNA的完整性会受损，导致碱基错配、丢失、修饰、DNA加成和交联、单链和双链断裂等。此外，受损的精子DNA可能会损害男性生育能力，并对辅助生殖技术（ART）中的妊娠结果产生不利影响⁴，同时也会增加妊娠反复流产的风险⁵。2021年，欧洲泌尿外科协会（EAU）建议将DFI检测纳入男性生育能力评估系统⁶。

目前，精子DNA的完整性主要通过检测精子DNA碎片指数（DFI）来评估。流式细胞术精子染色质结构分析（SCSA）是评估DFI的主要方法⁷。文献中已报道了两种用于精子DFI检测的流式细胞术分选方法。一种是多边形分选法（PGG），可以同时报告两个关键指标，如精子DFI和HDS⁸。PGG是一种经典的SCSA方法，特点是检测变异系数较小，重复性较好⁹。然而，它无法区分DNA损伤的严重程度。另一种是十字形分选法（CFG），可以报告精子DNA严重损伤标记物（DFIs）、轻度损伤标记物（DFIm）以及十字形分选法的总DFI（DFIc）。DFIc等于DFIs和DFIm的总和。与当前评估精子DNA完整性的技术相比，CFG方法可以反映精子DNA损伤的严重程度¹⁰。

为了确定哪种方法更适合评估精子质量，本研究采用了PGG方法和CFG方法来测量DFI和相关参数。比较了这两种方法的结果与常规精液分析参数之间的相关性。据我们所知，这是首次分析PGG和CFG两种方法之间检测结果相关性的研究。

Protocol

本研究已获得南京医科大学附属淮安第一人民医院医学伦理委员会的批准（批准号：KY-2024-181-01）。本研究中使用的样本的患者已获得知情同意。本文工作流程的总体示意图如图1所示。使用的试剂和设备的详细信息列于材料表中。

流式细胞仪CFG的设置
酸处理后，受损DNA的精子核染色质显示单链DNA，而未受损DNA的精子核染色质保持其完整的双链结构。荧光染料丙烯酰胺橙（AO）与单链DNA结合，在488 nm激光的激发下发出红色荧光。当与双链DNA结合时，在488 nm激光的激发下发出绿色荧光。根据流式细胞仪捕获的红色和绿色荧光信号的数量，计算红色荧光与红色和绿色荧光总和的比率，这代表精子DFI。

CFG设置是根据Yang等人提供的概述实施的¹⁰。流式细胞仪应使用AO染色的正常精子测量的最低绿色荧光和最高红色荧光作为边界参考来配置（图2）。以下是CFG中每个象限的细胞特征列表：
象限Q1表示正常精子。观察到精子DNA完整，AO结合量最小，产生绿色荧光。
象限Q2中的精子具有部分断裂的DNA，在荧光显微镜下呈橙色。这种DNA可能是可修复的，这些精子被归类为具有轻度DNA断裂（DFIm）¹⁰。
象限Q3被定义为已进行减法的非特异性荧光。
象限Q4中的精子具有断裂的DNA，在荧光显微镜下呈红色，表明严重的DNA断裂（DFIs）。

提出象限Q2和Q4中的精子都含有断裂的DNA，它们的总和被定义为DFIc。

流式细胞仪PGG的设置
流式细胞仪分析的多边形门是根据Evenson等人描述的方法建立的⁸。如图3所示，与每个门相关的细胞特征如下：
P3表示具有变性DNA的细胞百分比。
P4代表具有高DNA染色性（HDS）的精子。这组精子缺乏正常的组蛋白到精蛋白交换。
位于P3和P4门之外的主要细胞群由正常精子组成，显示出减少的红色荧光，主要发出绿色荧光。

精液样本采集和分析
所有121个精液样本来自于南京医科大学附属淮安第一医院生殖中心就诊的男性。精液样本是通过2-7天禁欲后的自慰采集的。精液常规分析严格按照世界卫生组织人类精液检查和处理实验室手册的要求进行^11,12。使用计算机辅助精子分析系统（CASA）进行精子浓度和活动性分析。每个样本分析两次。只有当两个结果之间的差异在95%置信区间内时，才以平均值报告结果；否则，进行重新采样和分析。

DFI分析
计算精液样本所需的样本体积，使流式细胞仪试剂盒中试剂A中的最终精子浓度为2–3 x 10⁶/mL。计算方法：假设原始精液样本中的精子浓度为M x 10⁶/mL，则所需精液体积（μL）= 150/M。将计算得出的精液体积加入流式细胞仪管中，然后加入50 μL的试剂A并轻轻混合。加入100 μL的试剂B，轻轻混合，在室温下孵育30秒。立即加入300 μL的试剂C并轻轻混合。使用CFG和PGG在流式细胞仪上检测样本，并分析至少5000个精子。

统计分析
使用GraphPad Prism 6.0对数据进行统计分析。通过计算平均值和差异构建Bland-Altman图，以评估PGG和CFG之间的一致性水平。将两种方法之间的差异绘制在它们的平均值上。此外，使用Pearson方法分析PGG和CFG之间的相关性。确定p值小于0.05具有统计学意义。

Results

在121名研究参与者（平均年龄：32.5 ± 4.9岁；范围：26–44岁）中，28人被诊断为精子无力症，4人被诊断为精子稀少症。基线人口统计学特征和精液分析参数总结于表1。

如图4所示，Bland-Altman图显示，PGG和CFG方法获得的精子DFI结果具有极好的一致性（r = 0.9667，p = 0.0000）。只有两个样本显示的差异大于+10%，三个样本显示的差异小于-10%，比例分别为1.7%和2.5%。

表2显示，PGG的DFIp与CFG的每个参数：DFIm、DFIs和DFIc之间存在强正相关性。相关系数分别为0.6497、0.9404和0.9667，p值均小于0.05。PGG方法检测的HDS结果与CFG方法检测的DFIs和DFIc呈显著负相关。相关系数分别为-0.3042和-0.2120，p值均小于0.05。调查显示HDS与DFIm之间没有相关性（p值大于0.05）。

如表3所示，逐渐运动的精子百分比与DFIp、DFIm、DFIs和DFIc显著负相关（所有p值均小于0.05），但与HDS无关（p值大于0.05）。精液量与DFIp、DFIs和DFIc显著正相关（所有p值均小于0.05），但与HDS无关（p值大于0.05）。精子浓度和精子总数未发现与PGG和CFG分析结果相关（p值大于0.05）。

CFG方法在DFI评估方面与PGG表现出极好的一致性。CFG可以区分DNA损伤的程度，其DFI参数与精子运动性显著相关。被称为DFIs的严重精子DNA损伤指标更适合在临床常规实践中广泛使用。

数据可用性：
本研究过程中产生和/或分析的数据集包含患者级临床数据，由于机构隐私和伦理考虑，不向公众公开。在提交合理请求并获得南京医科大学附属淮安市第一人民医院伦理委员会批准后，对应作者有权提供去标识的数据和分析结果。本研究没有涉及任何自定义代码的开发。

图1: 工作流程的总体示意图。 请点击这里查看此图的大图。

图2: 用于检测DFI的流式细胞术十字门控（CFG）. Q1 – 正常精子。 Q2 – 轻度DNA片段化（DFIm）。 Q3 – 已减去的非特异性荧光。 Q4 – 严重DNA片段化（DFIs）。 DNA受损的精子落入Q2和Q4中。它们的总和代表总DNA‑碎片精子总数（DFIc）。 请点击这里查看此图的大图。

图3: 用于检测DFI的流式细胞术多边形门控（PGG）. P3: DNA变性的精子。 P4: 高DNA染色性（HDS） 请点击这里查看此图的大图。

图4: PGG和CFG检测DFI结果的Bland-Altman图。 X - 轴：PGG方法和CFG方法获得的测量结果的平均值。 Y - 轴：PGG方法和CFG方法之间的测量结果差异 请点击这里查看此图的大图。

项目	平均值±标准差	范围
年龄（年）	32.5±4.9	26-44
禁欲天数（天）	4.1±1.3	3-7
精液量（mL）	3.8±1.6	0.5-6.8
精子浓度（×106/mL）	52.0±35.5	10.3-185.1
逐渐运动（%）	42.8±14.9	5.2-66.3
总运动（%）	52.8±15.9	9.6-78.6

Discussion

世界卫生组织《人类精液检查和处理实验室手册》第六版¹²推荐了四种评估精子DNA完整性的方法：末端脱氧核苷酸转移酶（dUTP）末端标记（TUNEL）、单细胞凝胶电泳（Comet）测定、SCSA和精子染色质分散（SCD）测试。其中，SCSA因其使用流式细胞术分析，提供高吞吐量、效率和客观性，以及能够同时报告DFI和HDS⁷等参数而在男性生殖医学实验室得到广泛应用。根据一项全球调查⁷，全球约四分之一（24.1%）的生殖临床医生选择SCSA作为评估精子DNA完整性的方法。

SCSA程序中最关键的步骤是建立适当的流式细胞术门控。传统的PGG方法可以检测DNA链断裂（DFI）片段和异常高DNA染色（HDS）精子，特征是缺乏正常组蛋白和精蛋白交换¹³。然而，它无法区分精子DNA的单链断裂和双链断裂。近年来，杨等¹⁰建立了一种CFG方法，用流式细胞术分析精子的DFI，可以区分精子DNA损伤的严重程度。该方法的关键步骤是为流式细胞仪设置十字形门控。CFG方法表现出优良的重复性（变异系数小于5%）和DFI检测的线性范围从8.93%到53.90%。该方法报告了三个指标—DFIm、DFIs和DFIc—但不提供HDS结果¹⁰。

本研究发现CFG方法的总DFI（DFIc）与PGG方法（DFIp）具有良好的一致性。相关性分析显示，DFIs和DFIp的相关系数显著高于DFIm。精子浓度和总精子数均与CFG或PGG方法的结果无相关性。PR（%）和四种类型的DFI（DFIm、DFIs、DFIc、DFIp）均与CFG或PGG方法的结果显著负相关。PR（%）与四种类型的DFI（DFIm、DFIs、DFIc、DFIp）均显著负相关。与DFIm（r = -0.1975）的相关性显著弱于DFIs、DFIc和DFIp（r = -0.3794、-0.3574、-0.3824）。这些发现与杨等报告的结果一致¹⁰。此外，DFIs和DFIc与精液量呈现良好的相关性，而DFIm则没有。尽管与基本的精液参数紧密相关的指标的临床效用可能有限，但这一发现表明，严重精子DNA损伤指数（DFIs）可能反映了精子发生的不同病理方面。更重要的是，如我们的相关性分析所示，DFIs与持续进动的精子百分比的相关性显著强于DFIm，进一步支持其作为男性生育能力评估中补充指标的潜力，超越了传统的精液分析。

HDS代表缺乏正常组蛋白和精蛋白交换的未成熟精子的比例。HDS精子中的精蛋白1前体保留了通常被切割的末端氨基酸⁸，可能会阻止染色质适当的凝聚，导致dsDNA的荧光橙染色增加。以往的研究强调了HDS在描述精子染色质缺陷中的重要性。林等¹⁴和Virro等¹⁵的研究表明，体外受精（IVF）的流产率在HDS大于15%的男性中显著更高。然而，近期的发现表明，HDS可能不能可靠地表明核不成熟，因为它与CMA3、AB和TB染色结果的相关性较弱¹⁶。因此，HDS可能不适合作为男性生育能力的指标¹⁷。本研究也未显示HDS与精液体积、精子浓度和活动力等基本精液参数之间存在显著相关性。因此，HDS不推荐作为精子DNA完整性的标志物¹⁸。

在DFI检测过程中，可能会出现荧光边界的不一致。这一现象主要归因于不同标本之间精子浓度和活动力的显著差异。为了解决这个问题，建议使用适当的门控排除死精子、碎片和其他非特异性信号。这种方法可以提高数据的准确性，并减轻荧光边界不一致的问题。

据我们所知，这是首个比较PGG和CFG方法分析结果的研究。该研究的一个局限性是单中心、小样本设计，其结论需要通过多中心、大样本研究进行进一步验证。未来的研究方向包括确保不同流式细胞仪器之间精子DFI测试结果的一致性，以及确定精子DFIs是否能预测辅助生殖技术的结果。

总之，CFG方法为精子DNA完整性提供了更多参数。具体来说，DFIm和DFIs分别反映了轻度和严重DNA损伤精子的比例。DFIc和DFIp结果显示良好的一致性。CFG方法适合临床应用和推广。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
计算机辅助精子分析系统	北京随家软件有限公司	SA-II
流式细胞仪	深圳明瑞生物医学电子有限公司	Cyto E6
流式细胞术试剂盒	深圳市百瑞生物科技有限公司
Makler计数室	Sefi医疗器械
精子核DNA完整性试剂盒	深圳市百瑞生物科技有限公司	-